在線固相萃取/高分辨質(zhì)譜快速分析三文魚中氧氟沙星殘留量

祝偉霞， 楊冀州， 魏 蔚， 王新輝， 張淑霞

(鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州450003)

氧氟沙星（ofloxacin）是第二代氟喹諾酮類藥物，對(duì)革蘭氏陰性/陽(yáng)性菌具有抗菌活性，主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的防治[1]。氧氟沙星易在動(dòng)物體內(nèi)殘留，長(zhǎng)期食用含有該藥物殘留的食品，可危害人類健康[2]。三文魚以其獨(dú)特的口味、豐富的營(yíng)養(yǎng)，受到越來(lái)越多人的青睞。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，目前全球超過(guò)70%三文魚來(lái)自于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[3]。為保障人類身體健康，2015年我國(guó)農(nóng)業(yè)部第2292號(hào)公告禁止氧氟沙星用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中。我國(guó)是三文魚的主要進(jìn)口國(guó)家，為保障國(guó)內(nèi)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，急需建立三文魚中氧氟沙星殘留量的分析方法。

目前有關(guān)氧氟沙星的研究報(bào)道主要采用拉曼光譜法[4]、電化學(xué)法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、液相色譜法[7-10]和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[11]。水產(chǎn)品中氧氟沙星殘留測(cè)定需要液液萃取與離線固相萃取前處理方法[8-9]，操作繁瑣，目前未見(jiàn)有關(guān)三文魚中氧氟沙星殘留量全自動(dòng)分析的文獻(xiàn)報(bào)道。為了提高分析效率，本方法設(shè)計(jì)了一種在線固相萃取凈化方法，可以快速測(cè)定三文魚中氧氟沙星的殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

TranscendTM在線凈化液相色譜聯(lián)合四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；T18渦旋混勻器(德國(guó)IKA公司)；3-16KL型離心機(jī)（日本Sigma公司）；N-EVAP氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品 (CAS 82419-36-1) 購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(96%)和乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)備

稱取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品10 mg加入甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，該標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL，該溶液于-18 ℃以下保存，可穩(wěn)定6個(gè)月。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，2 ℃～4 ℃保存，可穩(wěn)定1個(gè)月。用水-乙腈（9:1）將中間標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器參數(shù)

在線固相萃取凈化色譜柱為CycloneTM(50 mm×0.5 mm)；進(jìn)樣體積為50 μL；液相分離色譜柱為SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ(150 mm×2.0 mm,3.0 μm)；進(jìn)樣量為50 μL，TurboFlow上樣泵流動(dòng)相、HPLC流動(dòng)相、其它儀器條件見(jiàn)表1。

表1 測(cè)定氧氟沙星oneline-SPE凈化和色譜條件Table 1 Online -SPE conditions and HPLC parameters of Ofloxacin

檢測(cè)器：四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱；離子化：正離子電噴霧（ESI+）；離子源溫度：300 ℃；毛細(xì)管溫度：350℃；噴霧電壓：3400 V；鞘氣：45 psi；輔助氣：15 psi；質(zhì)量掃描范圍：m/z 200 amu～400 amu；監(jiān)測(cè)模式：全自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)掃描(dd-MS2)；母離子掃描分辨率為70000，子離子分辨率和閾值為17500和100000；碰撞能量為35 eV；氧氟沙星理論分子量365.1516，檢測(cè)分子量362.1511，質(zhì)量精度1.4 ppm，特征子離子318.1612和261.1034。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g勻質(zhì)樣品，加入4 mL乙腈混勻，超聲提取10 min，4000 r/min離心2 min，取上清液氮吹至干燥，1 mL乙腈-水（9:1）溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果討論

2.1 在線固相萃取條件的優(yōu)化

氧氟沙星屬中等極性的疏水物質(zhì)，SPE方法常主要采用反相固相萃取和陽(yáng)離子固相萃取柱凈化。Turboflow技術(shù)是基于渦流色譜原理的樣品制備方法，結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)吸附和體積排阻原理，在捕獲目標(biāo)化合物的同時(shí)快速除去復(fù)雜樣品中的蛋白質(zhì)及核酸等大分子物質(zhì)，并消除基質(zhì)干擾。實(shí)驗(yàn)采用不同在線固相萃取柱Cyclone（1×50 mm）、Cyclone-P（1×50 mm）和HTLC-C18（1×50 mm）進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Cyclone（1×50 mm）柱對(duì)分析物的保留作用最強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選擇Cyclone（1×50 mm）柱為萃取柱。

實(shí)驗(yàn)分別試驗(yàn)了0.1%甲酸、水和0.1%氨水作為上樣溶劑的效果。結(jié)果表明水為上樣溶劑時(shí)，氧氟沙星保留最高，0.1%甲酸和0.1%氨水為上樣溶劑時(shí)，分析物在固相萃取柱上的相對(duì)保留降低21.7%～46.2%。

實(shí)驗(yàn)比較了不同比例乙腈-0.1%甲酸溶液的洗脫效果。結(jié)果表明采用乙腈-0.1%甲酸（6:4）為洗脫溶劑，氧氟沙星回收率95.7%（見(jiàn)圖1），當(dāng)乙腈比例增加至100%，回收率無(wú)顯著變化?？紤]到目標(biāo)物在分析柱柱頭的聚焦，實(shí)驗(yàn)選擇較低比例有機(jī)相，乙腈-0.1%甲酸（6:4）洗脫溶劑分析物可得到良好的峰形。

2.2 方法驗(yàn)證

方法采用不含氧氟沙星殘留的三文魚樣品添加3種濃度水平進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得方法的最低檢出濃度，經(jīng)實(shí)驗(yàn)方法定量限為2.0 μg/kg。試驗(yàn)在三文魚樣品基質(zhì)中添加3種濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得線性范圍1.0 μg/kg～100 μg/kg線性范圍內(nèi)，分析物的濃度與其峰面積呈良好的線性關(guān)系Y=8472X+1234(R=0.9994)。

試驗(yàn)選取陰性三文魚分別在定量限、2倍定量限和5倍定量限濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定10次，方法回收率為68.7%～102.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.7%～12.8%之間。

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

為驗(yàn)證該方法的有效性，收集了48份三文魚樣品進(jìn)行分析。按照上述方法操作，根據(jù)保留時(shí)間和高分辨精確分子量進(jìn)行確證，未檢出氧氟沙星殘留。本方法的分析結(jié)果與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

該方法聯(lián)合采用在線固相萃取凈化與液相色譜-四極桿/高分辨靜電場(chǎng)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了三文魚中氧氟沙星殘留的鑒定方法，依靠高分辨精確母離子和二級(jí)精確子離子進(jìn)行定性和定量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度誤差小于5 ppm。經(jīng)采用實(shí)際樣品進(jìn)行分析，證明本方法分析速度快，準(zhǔn)確度高，可用于三文魚中氧氟沙星的快速測(cè)定和確證。