石油烴污染對滸苔生長和抗氧化指標的影響

董越 陳榕榕 謝汶龍

摘要：為探討石油烴污染對滸苔生長和抗氧化指標的影響，選擇原油和潤滑油飽和溶液為母液，按飽和溶液 1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10的比例連續(xù)培養(yǎng)滸苔7 d，于6 h、24 h、48 h、96 h、7 d分別取樣測定滸苔的抗氧化指標和油的濃度。結(jié)果表明，原油和潤滑油處理蛋白質(zhì)含量呈先升高后降低的趨勢，葉綠素含量降低，原油處理的滸苔葉綠素含量比潤滑油處理葉綠素含量低。原油處理顯著抑制了滸苔過氧化氫酶活性，過氧化物酶活性呈不規(guī)律的變化，前期（6～48 h）上升后期下降，但在7 d時過氧化物酶活性與同期無油對照相比顯著增加（P<0.05）;還原力前期顯著增加后期下降，在6、24、48 h時，還原力都有顯著變化（P<0.05）;滸苔對原油有一定的吸收，1 ∶ 10處理下油的濃度有顯著性降低（P<0.05），其余處理變化不顯著。潤滑油處理對滸苔前期CAT活性也有一定的抑制作用，但變化力度沒有原油的大，后期反而增加;POD活性呈先上升后下調(diào)的趨勢;潤滑油處理滸苔還原力的變化沒有原油處理明顯，也是呈先上升后下調(diào)的趨勢;滸苔對潤滑油有一定的吸收，并且1 ∶ 8和1 ∶ 10處理下油的濃度顯著性降低。原油和潤滑油處理對滸苔都有一定的傷害性，滸苔對原油更為敏感，原油對滸苔的傷害性更強;滸苔可以通過調(diào)節(jié)自身酶的活性來適應石油烴污染。

關(guān)鍵詞：滸苔;石油烴;污染;抗氧化

中圖分類號： X74 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0288-05

收稿日期：2019-05-11

基金項目：浙江海洋大學大學生創(chuàng)新項目（編號：xj2018011）;浙江海洋大學博士啟動基金（編號：Q1701）。

作者簡介：董 越（1997—），女，山東煙臺人，研究方向為海洋生物學。E-mail：1770685036@qq.com。

通信作者：范美華，博士，副教授，研究方向為藻類的抗逆性機理。E-mail：dinger503@163.com。 ?石油產(chǎn)業(yè)是高風險產(chǎn)業(yè)，受地震、海嘯、風暴潮和雷電等不可控自然因素的影響，同時浙江舟山附近海域是我國海上運輸最繁忙的航道，石油運輸過程中潛在的溢油突發(fā)事件風險高，比如2018年1月我國東?！吧＜碧柺鹿室缬褪录?。生物修復技術(shù)以其經(jīng)濟、環(huán)保、處理效果好、無二次污染、可對石油污染區(qū)域進行原位修復、與物理化學方法相比降低石油的污染損害等優(yōu)勢被視為最經(jīng)濟有效和最具使用前景的石油污染治理措施[1-3]。海洋藻類因其在石油污染中具有凈化和供氧雙重功能，成為溢油生物治理的重要方向。已有的研究表明，低濃度石油烴污染物在某種程度上可以促進海洋微藻的快速繁殖，甚至誘發(fā)赤潮藻的過度繁殖而引起赤潮的發(fā)生。例如，小球藻石油被吸收后可以轉(zhuǎn)化為自身的油脂含量[4]。另外，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和青島大扁藻（Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis）對石油烴污染具有一定的抗逆性，并且小球藻還可以利用石油轉(zhuǎn)變?yōu)樽陨淼奈镔|(zhì)[5-6]。雖然對石油烴污染降解的研究在微藻中研究較多，但是大型海藻對石油烴降解的研究較少，特別是石油烴污染對滸苔（Ulva prolifera）的生長和抗氧化指標的影響變化未見研究報道。

滸苔（Ulva prolifera）屬于綠藻綱（Chlorophyta）石莼目（Ulvales）石莼科（Ulvaceae）石莼屬（Ulva），是綠潮的優(yōu)勢種，在海洋群落結(jié)構(gòu)和維持海洋生態(tài)平衡中起到關(guān)鍵的作用，在舟山海域和青島海域頻繁暴發(fā)，并且營養(yǎng)豐富，具有很好的應用前景。石油烴的污染具有很大的潛在危險，對滸苔的生長和基因的表達以及自身對石油烴降解吸附能力都有很大的影響。本試驗以滸苔為研究對象，研究原油和潤滑油處理對滸苔生長發(fā)育和抗氧化指標的影響，以及對不同油品降解吸收的能力，為石油烴污染的防治提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

滸苔于2018年6月采自青島海域，采集后洗凈，先刷掉附著生物和雜藻，再用0.2% KI消毒，處理后用無菌海水沖洗。取處理后新鮮滸苔放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在光照度60 μmol/（m2·s）、光照周期12 h光照/12 h黑暗的光照培養(yǎng)箱中暫養(yǎng)2周以上。

1.2 試驗方法

1.2.1 原油水溶性母液的制備 試驗用油為原油和潤滑油。由于油難溶于水，將試驗用油與無菌海水（0.2 μm濾膜過濾，滅菌）按1 ∶ 9（體積比）混合，置于磁力攪拌機上，連續(xù)攪拌24 h后，靜置4 h，分離出下層水相即為油母液。將母液置于冰箱4 ℃保存。

1.2.2 試驗濃度設(shè)定及樣品處理 采用紫外分光光度法[7-8]測定母液濃度。分別配制5、10、 20、 30、40、50 mg/L的系列標準樣品，以正己烷（透光率不小于90%）為空白對照，在250 nm波長下測定標準系列，繪制標準曲線y=0.012 2x+0.000 4，r2=0.999。

1.2.3 試驗設(shè)定 根據(jù)標準曲線計算得出原油母液的濃度為6.24 mg/L，潤滑油母液的濃度為 7.12 mg/L。根據(jù)母液測定結(jié)果以及GB 3097—1997《海水水質(zhì)標準》中Ⅰ類和Ⅱ類海水中石油類的含量≤0.05 mg/L，Ⅲ類海水中石油類含 量≤0.3 mg/L，Ⅳ類海水石油含量≤0.5 mg/L，用無菌海水（2 μm濾膜過濾，滅菌）按1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10 進行稀釋，每個濃度設(shè)定3個平行組。將滸苔放到不同濃度里，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、6、24、48、96、7 d進行取樣測定。

1.2.4 指標測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法[9];葉綠素含量的測定采用分光光度法[10];過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法;過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外分光光度法[11];還原力的測定采用鐵氰化鉀法;油濃度的測定采用紫外分光光度法[12]。.

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0和Excel 2016軟件對所有數(shù)據(jù)進行方差分析和差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原油和潤滑油培養(yǎng)對滸苔蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)的標準曲線為y=0.006 4x-0.015 2（r2=0.994 8）。可溶性蛋白作為植物抗逆性指標，主動參與脅迫時植物的滲透調(diào)節(jié)，是除脯氨酸、可溶性糖外植物中重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。如圖1所示，無油處理下，以6 h無油處理的滸苔蛋白質(zhì)含量為對照，滸苔的蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢，在48、96 h時蛋白質(zhì)含量呈顯著性升高，7 d時蛋白質(zhì)含量顯著降低（P<0.05）。原油培養(yǎng)在6 h時，以6 h無油處理的滸苔蛋白質(zhì)含量為對照，滸苔蛋白質(zhì)的含量稍微有點上升，但差異不顯著。原油1 ∶ 8和1 ∶ 10處理的滸苔蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)為先上升后下降再上升再下降的趨勢，分別在24、48 h時達到最高點，與6 h無油處理對照差異顯著（P<0.05）。潤滑油飽和油處理的滸苔在6 h時蛋白質(zhì)含量與無油處理6 h相比顯著提高（P<0.05），其他處理間差異不顯著。在96 h時，1 ∶ 5和1 ∶ 8潤滑油處理的滸苔蛋白質(zhì)含量達到最高點，與96 h無油處理差異顯著（P<0.05），隨著時間的延長在7 d時，滸苔蛋白質(zhì)含量都呈下降趨勢。

2.2 原油和潤滑油培養(yǎng)對滸苔葉綠素含量的影響

葉綠素是進行光合作用的主要色素。如圖2所示，原油培養(yǎng)的滸苔在6 h時，葉綠素含量與無油對照無顯著性差異，隨后隨著時間的延長呈現(xiàn)葉綠素顯著下調(diào)的趨勢。潤滑油飽和油、1 ∶ 5和1 ∶ 10處理6 h時與同期無油處理對照相比顯著下調(diào)（P<0.05），在48 h時，1 ∶ 10處理的滸苔葉綠素含量還有顯著性升高。說明原油對滸苔的傷害性較強，影響了滸苔葉綠素的光合作用，使葉綠素的含量顯著降低。

2.3 原油和潤滑油培養(yǎng)對滸苔CAT活性的影響

過氧化氫酶是清除氧自由基的關(guān)鍵酶，催化過氧化氫為氧氣和水。如圖3所示，無油的對照處理，滸苔CAT活性呈先上升后下調(diào)的趨勢，96 h達最大值。原油處理的滸苔CAT活性在前期降低，與無油對照相比差異性顯著。原油飽和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8和 1 ∶ 10 處理的滸苔分別在96 h、6 h、7 d、24 h達到最低值，分別為同期無油對照的 17.88%、42.49%、17.80%、12.66%，并且與對照相比差異顯著（P<0.05）。潤滑油1 ∶ 8處理的滸苔樣品CAT活性在6～24 h 內(nèi)與同期的無油對照相比呈顯著上升趨勢。

2.4 原油和潤滑油培養(yǎng)對滸苔POD活性的影響

過氧化物酶是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，它們能催化很多反應。過氧化物酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。如圖4所示，無油的對照處理，滸苔的POD活性呈現(xiàn)先6～96 h上升，第7天下調(diào)的趨勢，在96 h達到最大值，與6 h的無油處理相比差異顯著（P<0.05）。原油培養(yǎng)時，POD活性呈現(xiàn)差異性變化，但是規(guī)律性不強。潤滑油處理在6 h時與無油對照相比，POD活性顯著升高（P<0.05）;在48 h時飽和油和1 ∶ 10處理滸苔的POD活性與同期無油對照相比顯著升高（P<0.05），1 ∶ 5處理顯著降低（P<0.05）。7 d潤滑油處理的POD活性相比48 h時整體呈下調(diào)趨勢，但1 ∶ 5、1 ∶ 8和1 ∶ 10處理的POD活性與第7天無油對照相比仍有顯著增加（P<0.05）。因此，過氧化物酶的活性呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢，但是與無油對照相比，下降的幅度較低。

2.5 原油和潤滑油培養(yǎng)對滸苔還原力的影響

藻類在壓力的脅迫下容易產(chǎn)生氧自由基，抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原能力越強，抗氧化能力越強。由圖5所示，無油的對照處理還原力在7 d內(nèi)無差異性變化。原油培養(yǎng)在6、24、48 h時，還原力有顯著性變化（P<0.05）;在6 h時，飽和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8和 1 ∶ 10 處理的還原力分別為無油對照的1.56、1.64、1.61、1.56倍（P<0.05），但是原油各個處理之間無顯著性差異。原油處理時，還原力呈先上升后下調(diào)的趨勢，飽和油和1 ∶ 5的處理在48 h時還原力急劇下降，1 ∶ 8和1 ∶ 10處理時，還原力在48 h達最大值，隨后下調(diào)。潤滑油處理時，滸苔還原力的變化沒有

原油的明顯，也是呈先上升后下調(diào)的趨勢，飽和油潤滑油處理96 h達最大值，為無油對照的1.10倍。

研究結(jié)果表明，原油比潤滑油對滸苔培養(yǎng)的影響較大，導致滸苔自身的抗氧化機制的應激反應，抗氧化能力增強，所以還原力在前期有很大的升高，適應后后期抗氧化能力降低。

2.6 滸苔對原油和潤滑油吸收的影響

如圖6所示，原油的飽和油濃度和潤滑油飽和油濃度分別為6.24、7.12 mg/L，經(jīng)過7 d后，原油和潤滑油的濃度都有降低。潤滑油飽和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8 和1 ∶ 10處理7 d后分別吸收原濃度的 0.98%、1620%、8.38%、18.99%;原油飽和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8和1 ∶ 10處理7 d后原油濃度分別降低響應濃度的1.92%、4.00%、6.41%、16.67%。說明滸苔對潤滑油的吸收能力要比對原油的吸收能力強。

3 討論與結(jié)論

在石油烴污染的脅迫下，需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），包括O-2·、H2O2 、HO2·、·OH等。ROS的積累，會造成細胞的膜質(zhì)過氧化，對細胞造成一定的傷害。為了清除ROS的毒害，藻類主要是通過抗氧化酶活性或者抗氧化酶基因的表達，來提高抗性[13-14]。抗氧化系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、POD、GR和APX等抗氧化酶，在藻類的抗逆性機制中起到重要的作用。目前為止，國內(nèi)外有諸多關(guān)于石油污染物對海洋生物抗氧化系統(tǒng)影響的研究[15]。張聿柏通過石油烴對3種微藻的毒害和響應機理研究表明，石油烴脅迫下，3種微藻的葉綠素含量和葉綠素熒光指數(shù)都有顯著的降低，抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、GR活性均出現(xiàn)波動，呈先升高后下調(diào)的趨勢[6]。本研究表明，原油和潤滑油處理蛋白質(zhì)含量呈先升高后降低的趨勢，葉綠素含量降低，原油處理的滸苔葉綠素含量比潤滑油處理低。原油處理顯著抑制了滸苔過氧化氫酶活性，過氧化物酶活性呈不規(guī)律的變化，前期（6～48 h）上升后期下降，但在7 d時過氧化物酶活性與同期無油對照相比顯著增加（P<0.05）;還原力前期顯著增加后期下降，在6、24、48 h時，還原力都有顯著性變化（P<0.05）;滸苔對原油有一定的吸收，1 ∶ 10處理下油的濃度有顯著性降低（P<0.05），其余處理變化不顯著。潤滑油處理對滸苔前期CAT活性也有一定的抑制作用，但變化力度沒有原油的大，后期反而增加;POD活性呈先上升后下調(diào)的趨勢;潤滑油處理滸苔還原力的變化沒有原油處理變化的明顯，也是呈先上升后下調(diào)的趨勢;滸苔對潤滑油有一定的吸收，并且 1 ∶ 8 和1 ∶ 10處理下油的濃度顯著性降低。結(jié)果表明，滸苔對潤滑油的適應能力更強，原油對滸苔的影響更大。滸苔可以通過調(diào)節(jié)自身的酶的活性來適應石油烴污染，蛋白質(zhì)和葉綠素含量降低，光合作用受到破壞，滸苔抗氧化系統(tǒng)中的POD活性被激活和還原力也增加，但在長期的脅迫條件下POD活性和還原力降低，而CAT可能在潤滑油的后期起作用。

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