HGGT基因與小麥赤霉病籽粒毒素積累的關(guān)系解析

吳迪 朱素芹 張語卉

摘要：赤霉病是我國小麥重要病害之一，禾谷鐮刀菌是其主要致病因子。赤霉病菌在侵染小麥過程中會在籽粒中產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素（DON）。維生素E的抗氧化作用在一定程度上能降低DON的毒性，HGGT（尿黑酸牻牛兒基牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶）是維生素E生物合成的關(guān)鍵限速酶。為了揭示HGGT基因與小麥赤霉病及DON毒素積累的關(guān)系，本研究克隆HGGT基因的全長，并開發(fā)了基因特異標記，在31份小麥品種中進行標記分析，明確了該基因的分布。同時采用雙花滴注法在揚花期對31份小麥品種進行赤霉病接種和抗性鑒定，成熟期利用LC-MS法測定籽粒中DON毒素含量。結(jié)果表明，HGGT基因與赤霉病抗性相關(guān)，攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素含量顯著（P<0.05）低于不攜帶該基因的品種，說明HGGT基因可以用于改良小麥赤霉病抗性，并降低籽粒毒素含量。

關(guān)鍵詞：小麥;赤霉病;DON毒素;HGGT基因;維生素E

中圖分類號： S435.121.4+5 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0096-04

收稿日期：2020-04-20

基金項目：國家自然科學基金（編號：31771772）。

作者簡介：吳 迪（1992—），男，江蘇揚州人，碩士研究生，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：956671930@qq.com。

通信作者：李 韜，博士，教授，主要從事小麥赤霉病遺傳和種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：taoli@yzu.edu.cn。 ?小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌引起的一種麥類真菌病害。赤霉病抗性類型主要分為抗侵染、抗擴展、籽?？剐院涂苟舅胤e累。小麥赤霉病多發(fā)生在溫暖多雨和氣候濕潤地區(qū)[1]，近年來，我國小麥赤霉病發(fā)生區(qū)域由長江流域向黃淮流域不斷北移[2]，主要發(fā)生在長江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)[3]。禾谷鐮刀菌侵染小麥后造成穗部組織褐化壞死，籽粒干癟，導致小麥產(chǎn)量和品質(zhì)下降[4-5]，造成嚴重的經(jīng)濟損失。小麥赤霉病的另一大危害是感病籽粒中積累的毒性次級代謝產(chǎn)物脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）[6-7]，人畜中毒后會出現(xiàn)胃部不適，惡心眩暈、頭痛[8]，故又稱嘔吐毒素，還會造成神經(jīng)危害，抑制機體免疫反應(yīng)[9]。小麥赤霉病不僅造成糧食減產(chǎn)，還在侵染過程中積累毒素，造成嚴重的食品安全隱患[10]。因此赤霉病引起的食品和飼料污染問題引起了人們的極大關(guān)注。我國衛(wèi)生和標準管理部門規(guī)定，小麥和玉米中DON含量超過1 mg/kg、小麥赤霉病病粒含量超過4%時則禁止食用[11]。

維生素E是一種重要的抗氧化劑，可分為生育酚和生育三烯酚兩大類[12]。小麥中的生育酚主要存在于胚中，生育三烯酚存在于果皮和胚乳中[13]。維生素E的生物合成途徑包括：（1）親水性頭部的合成。（2）HGA的植基化。HGA分別在尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶（HPT）和尿黑酸牻牛兒基牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶（HGGT）的催化下生成生育酚和生育三烯酚的前體物[14]。（3）MPBQ（2-甲基-6-植基-苯醌）和MGGBQ（2-甲基-6-牻牛兒牻牛兒基-苯醌）的甲基化。（4）環(huán)化反應(yīng)[15]。HGGT基因定位于質(zhì)體中，主要在小麥胚乳中表達。HGGT是維生素E生物合成的關(guān)鍵酶基因[16]，Cahoon等于2003年第一次從大麥和水稻種子中克隆得到HGGT序列[17]。小麥籽粒積累DON毒素后，活性氧（ROS）含量提高，抗氧化能力下降，誘導機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導致機體和細胞的脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷[18]。維生素E是一種強自由基清除劑，能及時清除活性氧，防止脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生[19]。在飼料中添加維生素E能降低DON的毒性作用，在膳食中使用維生素E能緩解DON引起的急性中毒[20]，但維生素E對DON的降毒機制尚不清楚。HGGT是生育三烯酚合成的第一個限速關(guān)鍵酶，也是維生素E合成的第一個分支點[21]。本試驗的主要目的是在31份小麥品種中擴增HGGT基因，接種赤霉菌鑒定病小穗率，并測定籽粒中的毒素含量，解析HGGT基因與小麥赤霉病抗性、病小穗率及毒素含量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

31份小麥材料為：NIL-7、R75、NIL-8、S98、R22W、臺灣小麥、S22V、蘇麥3號、寧7840、望水白、Clark、黃方柱、海鹽種、N553、S42、CHOKWANG、黃蠶豆、中國春、安農(nóng)8455、Wheaton、寧玉白、Bobwhite、Tokai66、Jagger、白三月黃、科龍199、W7984、菜籽黃、揚麥158、Fielder、NP160。所有材料均于2018年10月種植于揚州大學試驗田，每個品種播種6行，每行15株。

1.2 小麥基因組DNA提取

苗期取31份材料的嫩葉，采用CTAB法[22]提取各材料的基因組DNA。用超微量分光光度計檢測出的DNA濃度均在600 ng/μL左右，D260 nm/D280 nm處于1.7～2.0之間。

1.3 HGGT基因引物設(shè)計及擴增

通過GenBank網(wǎng)站找到HGGT基因的序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計HGGT基因的特異擴增引物（由華大基因公司合成）。

以上述提取獲得的小麥基因組DNA為模板，Seq400.6-2F/Seq400.6-R為引物進行PCR擴增，以鑒定HGGT基因在小麥赤霉病不同抗性品種中的分布。PCR反應(yīng)采用50 μL體系：上下游引物各1 μL，DNA模板10 μL，2×Gflex Buffer 25 μL，ddH2O 12 μL，TKs Gflex酶1 μL。PCR反應(yīng)在Thermal Cycler C1000 Touch PCR儀上進行，程序如下：95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸210 s，37個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃ 保存。取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測帶型，以確定其基因型。

1.4 PDA培養(yǎng)基的配制

稱取40 g馬鈴薯瓊脂糖（PDA）培養(yǎng)基于1 L燒杯中，加入1 L的ddH2O，用玻璃棒攪拌均勻，置于微波爐中加熱15 min完全溶解至透明狀，雙層紗布過濾至錐形瓶中，高溫高壓滅菌鍋121 ℃滅菌 20 min，待溫度降至55 ℃時，于無菌操作臺下傾注平板，配制25 mL的等量PDA培養(yǎng)基于9 cm直徑的無菌培養(yǎng)皿中，待PDA培養(yǎng)基完全凝固后置于 25 ℃ 培養(yǎng)箱貯藏備用。

1.5 試驗用菌株及其菌液制備

本試驗所用禾谷鐮刀菌菌株為F1312（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院陳懷谷研究員提供）。利用滅菌后的接種環(huán)挑取純菌株斜面上的禾谷鐮刀菌邊緣菌體，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，用滅菌后直徑7 mm的圓形打孔器從經(jīng)過活化的禾谷鐮刀菌菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上，取8塊菌塊放入80 mL經(jīng)過滅菌的綠豆湯培養(yǎng)基，然后置于搖床上，在 180 r/min、26 ℃下振搖72～120 h，吸取1 μL孢子液，滴到血球計數(shù)板上，置于顯微鏡下測定孢子濃度，然后稀釋或濃縮到接種需要的濃度（1×105個/mL）。

1.6 赤霉病接種及鑒定

采用雙花滴注法（bilateral florets inoculation method，BFI），在小麥揚花期將制備好的菌液注射到倒5小穗雙側(cè)小花的內(nèi)外穎之間，每行接種10個穗子，記載接種日期，接種后21 d鑒定感病小穗數(shù)，計算病小穗率（proportion of symptomatic spikelets，PSS）：PSS=感病小穗數(shù)/總小穗數(shù)。

1.7 籽粒中DON含量的測定

1.7.1 實驗儀器 液質(zhì)聯(lián)用儀（TSQ-Vantage，Thermo Fisher SCIENTIFIC，美國）。

1.7.2 標準液 制備毒素原液DON（FERMENTEK，以色列）用10%乙腈水配制成 100 μg/L 混標。

1.7.3 樣品前處理 前處理方法參照靳夢瞳等的方法[23]。利用磨樣機將麥粒磨碎，稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈/水溶液，振蕩后超聲30 min，離心5 min后吸2 mL上清于新的 10 mL 離心管，加入150 mg無水硫酸鎂，振蕩吸上清至新的10 mL離心管。加入1 mL正己烷脫脂，離心去除正己烷層，氮氣吹干剩余上清液，最后乙腈/水溶液定容至1 mL。渦旋過0.22 μm尼龍濾膜后，進樣LC-MS分析。

1.7.4 色譜及質(zhì)譜條件 色譜及質(zhì)譜條件參照靳夢瞳等的方法[23]，略有改進。主要參數(shù)如下：

色譜條件：色譜柱選用ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃，樣品溫度 5 ℃。流速0.3 mL/min，進樣體積為5 μL。采用流動相A（甲醇）和流動相B（乙酸銨）組成的流動相進行梯度洗脫。洗脫程序：0 min 20% A-80% B，1 min 20% A-80% B、5.5 min 90% A-10% B，65 min 90% A-10% B、7 min 20% A-80% B。

質(zhì)譜條件：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測。曲線脫溶劑管（CDL）溫度250 ℃，霧化氣體和干燥氣體均為氮氣，流速分別為3.0、15 L/min。碰撞氣為高純氬氣，碰撞誘導解離壓力為230 kPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 HGGT基因的擴增

本研究通過BAC克?。ǖ卿浱枺篕U641029）獲得HGGT基因，HGGT基因序列包含2個外顯子和1個內(nèi)含子。其編碼區(qū)包含273個堿基，編碼80個氨基酸。轉(zhuǎn)錄起始位點位于402 532 nt，第1外顯子分布在401 715～401 828 nt，共114個堿基，第2外顯子分布在400 820～400 975 nt，共156個堿基，PolyA信號位點位于400 620 nt（圖1）。

為了鑒定HGGT基因在小麥赤霉病不同抗性品種中的分布，根據(jù)HGGT基因的序列設(shè)計特異性引物，進行了PCR擴增。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的帶型，結(jié)果如圖2所示：17份攜帶HGGT基因的品種都能擴增2 000 bp目的條帶，其余14份品種中沒有擴增條帶。

2.2 不同小麥材料赤霉病病小穗率及籽粒DON含量

測定不同小麥材料的病小穗率及籽粒中的DON含量，結(jié)果（表1）表明，攜帶HGGT基因的17份材料高抗赤霉病，不攜帶HGGT基因的14份材料高感赤霉病。

2.3 2種基因型下的病小穗率及籽粒DON含量的差異

方差分析結(jié)果表明，攜帶HGGT基因與不攜帶HGGT基因的品種之間病小穗率存在差異，P=000<0.05;攜帶HGGT基因與不攜帶HGGT基因的品種之間的籽粒DON存在差異，P=0.00<0.05（表2）。說明攜帶HGGT基因與不攜帶HGGT基因的品種之間的病小穗率和籽粒毒素含量均存在差異。

3 討論與結(jié)論

本試驗根據(jù)HGGT基因序列，設(shè)計特異性標記，在31份不同赤霉病抗性小麥品種中利用基因擴增技術(shù)擴增目的基因，確定HGGT在不同赤霉病抗性品種中的分布。在揚花期進行赤霉病接種抗性鑒定，后續(xù)測定籽粒中積累的DON毒素含量，結(jié)果表明，HGGT基因只在高抗赤霉病品種中擴增出，在感病品種中未擴增出目的條帶，且攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素含量較低，與不攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素含量存在顯著差異（P<0.05），這也從側(cè)面說明了籽粒中DON毒素積累的前提是赤霉菌在穗部侵染。說明HGGT基因與赤霉病擴展抗性有關(guān)，在一定程度上阻止病原菌在穗部的擴展并降低籽粒中積累的DON毒素含量，可以用于改良小麥赤霉病抗性。HGGT基因是維生素E生物合成途徑的一個關(guān)鍵酶基因，我們推測維生素E對赤霉病的降毒效應(yīng)，很有可能是受HGGT基因調(diào)控的作用，后續(xù)將進一步研究HGGT基因相關(guān)的功能以及HGGT基因?qū)Τ嗝?/p>

病的抗性機制。赤霉菌在揚花期和抽穗期都會侵染小麥，會在籽粒中積累DON毒素。本研究結(jié)果證明了攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素積累量較低，說明HGGT基因具有赤霉病抗性作用，豐富了HGGT基因功能的認識，為小麥赤霉病病小穗率及DON毒素防控提供新的方向，對解析擴展抗性的機制和DON毒素方面的研究具有重要的參考價值。

參考文獻：

[1]馬躍亭. 小麥籽粒DON含量影響因素相關(guān)性分析及氨基酸對赤霉菌產(chǎn)毒的影響[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇科技大學，2019：1-57.

[2]范三紅，胡小平. 小麥赤霉菌毒素合成機制及檢測技術(shù)研究進展[J]. 麥類作物學報，2018，38（3）：348-357.

[3]程順和，郭文善，王龍俊，等. 中國南方小麥[M]. 南京：江蘇科學技術(shù)出版社，2012：281-282.

[4]Dexter J E，Clear R M，Preston K R. Fusarium head blight：effect on the milling and baking of some Canadian wheats[J]. Cereal Chemistry，1996，73（6）：695-701.

[5]Dexter J E，Marchylo B A，Clear R M，et al. Effect of Fusarium head blight on semolina milling and pasta-making quality of durum wheat[J]. Cereal Chemistry，1997，74（5）：519-525.

[6]Jiang C，Zhang C K，Wu C L，et al. Tri6 and Tri10 play different roles in the regulation of deoxynivalenol（DON） production by cAMPsignalling in Fusarium graminearum[J]. Environmental Microbiology，2016，18（11）：3689-3701.

[7]Li T，Bai G，Wu S，et al. Quantitative trait loci for resistance to Fusarium head blight in a Chinese wheat landrace Haiyanzhong[J]. Theoretical and Applied Genetics，2011，122（8）：1497-1502.

[8]徐存寬，黃 偉，孫寶勝. 嘔吐毒素在小麥正常粒和赤霉病粒中的分布情況研究[J]. 糧食與油脂，2019，32（1）：84-86.

[9]Woloshuk C P，Won-Bo S. Aflatoxins，fumonisins，and trichothecenes：a convergence of knowledge[J]. Fems Microbiology Reviews，2013，37（1）：94-109.

[10]劉易科，佟漢文，朱展望，等. 小麥赤霉病抗性改良研究進展[J]. 麥類作物學報，2016，36（1）：51-57.

[11]張愛民，陽文龍，李 欣，等. 小麥抗赤霉病研究現(xiàn)狀與展望[J]. 遺傳，2018，40（10）：858-873.

[12]柴玉瓊. 利用維生素E生物合成相關(guān)基因調(diào)控大麥生育酚含量及其組成[D]. 杭州：浙江大學，2015：1-80.

[13]張玉紅，陳建澍，曾章慧，等. 大麥籽粒生育酚和生育三烯酚的合成與分布特性[J]. 植物生理學報，2015（4）：181-185.

[14]Rohmer M. Mevalonate-independent methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis.Elucidation and distribution[J]. Pure and Applied Chemistry，2003，75（2/3）：375-387.

[15]Babura S R，Abdullah S N A，Khaza A H. Advances in genetic improvement for tocotrienol production：a review[J]. Journal of Nutritional Science &Vitaminology，2017，63（4）：215-221.

[16]Yang W，Cahoon R E，Hunter S C，et al. Vitamin E biosynthesis：functional characterization of the monocot homogentisate geranylgeranyl transferase[J]. The Plant Journal，2011，65（2）：206-217.

[17]Cahoon E B，Hall S E，RippK G，et al. Metabolic redesign of vitamin E biosynthesis in plants for tocotrienol production and increased antioxidant content[J]. Nature Biotechnology，2003，21（9）：1082-1087.

[18]王 旭，黃德玉，吳慶華，等. 真菌毒素引起的氧化應(yīng)激及其毒理學意義[J]. 生態(tài)毒理學報，2015，10（6）：62-70.

[19]楊 巍. 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對人外周血淋巴細胞的遺傳毒性研究[D]. 武漢：華中科技大學，2012：1-144.

[20]Rizzo A F，Atroshi F，Ahotupa M，et al. Protective effect of antioxidants against free radical-mediated lipid peroxidation induced by DON or T-2 toxin[J]. ZentralblVeterinarmed A，1994，41（1-10）：81-90.

[21]FarreG，Sudhakar D，Naqvi S，et al. Transgenic rice grains expressing a heterologous β-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase shift tocopherol synthesis from the γ to the α-isoform without increasing absolute tocopherol levels[J]. Transgenic Research，2012，21（5）：1093-1097.

[22]施 璇. 小麥類過敏反應(yīng)突變體抗病性研究及氮依賴性類過敏反應(yīng)基因的定位[D]. 揚州：揚州大學，2018：1-72.

[23]靳夢曈，王建華，林善海，等. 室溫下麥粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其隱蔽型（D3G）毒素累積分析[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（17）：132-136.雷嬌嬌，田 力，袁 偉，等. 貴陽花溪久安茶樹炭疽病病原菌（Colletotrichun gloeosporioides）的分離鑒定及生物學特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（11）：100-105.