乳制品及其相關(guān)食品中乳鐵蛋白常用檢測(cè)方法

張君超 胡素麗

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)的需求日益旺盛。乳鐵蛋白因具有抗菌、抗氧化、抗癌、促進(jìn)腸道發(fā)育、促進(jìn)鐵吸收，以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能，故在乳制品及相關(guān)的嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品等生產(chǎn)中均有不同程度的添加。隨著“國(guó)家優(yōu)質(zhì)乳工程”的實(shí)施，眾多企業(yè)對(duì)巴氏殺菌乳工藝進(jìn)行改進(jìn)，從而保留了更多天然活性乳鐵蛋白。然而，我國(guó)尚未建立完善的乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白添加量與保留量的統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致生產(chǎn)者、監(jiān)管者和消費(fèi)者無(wú)法在同一尺度上進(jìn)行衡量判別。本文通過(guò)對(duì)乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白現(xiàn)有的常用檢測(cè)方法進(jìn)行匯總，對(duì)不同檢測(cè)方法的適用樣本及檢測(cè)性能進(jìn)行分析，提出了不同乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白檢測(cè)方法的建議，旨在為乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化提供思考與建議。

1 乳鐵蛋白的檢測(cè)需求

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是哺乳動(dòng)物乳汁中存在的一種天然非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，具有強(qiáng)大的生物功能——抗菌、抗氧化、抗癌、促進(jìn)腸道發(fā)育和鐵吸收，以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等。因乳鐵蛋白具有優(yōu)質(zhì)生物功能，免疫力較低的人群、患有感染性疾病的人群、具有骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)的人群，以及缺鐵性貧血人群均對(duì)于乳鐵蛋白的補(bǔ)充有所需求。

以嬰幼兒和兒童為例，現(xiàn)有的研究證據(jù)表明，牛乳鐵蛋白對(duì)嬰幼兒和兒童腹瀉、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、新生兒呼吸道疾病、新生兒敗血癥、兒童幽門螺旋桿菌感染等均有一定的預(yù)防和輔助治療作用，且對(duì)嬰幼兒貧血具有改善作用，并對(duì)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。

母乳是嬰幼兒獲得乳鐵蛋白的主要來(lái)源，而無(wú)法正常進(jìn)行母乳哺育的嬰幼兒和其他人群獲得乳鐵蛋白的主要來(lái)源則為其他乳制品及相關(guān)食品。因?yàn)榕Ｈ殍F蛋白和人乳鐵蛋白的氨基酸序列同源性達(dá)69%，且具有相似的生物活性，所以是目前最易獲取的乳鐵蛋白來(lái)源之一。但鮮牛乳中的乳鐵蛋白含量?jī)H為0.02～0.2g/L，約為母乳中的乳鐵蛋白含量（0.44～4.4g/L）的1/20，且鮮牛乳中的乳鐵蛋白會(huì)隨著加工過(guò)程中加熱時(shí)間、pH值、鐵飽和度及壓力等因素的變化而降低活性與功能。因此，大部分企業(yè)會(huì)在乳制品及相關(guān)食品中添加易獲得的牛乳鐵蛋白，其目前已被應(yīng)用于嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、特殊膳食食品及保健食品中。由于乳鐵蛋白原料價(jià)格較高，一些不法企業(yè)少添加或不添加乳鐵蛋白，使產(chǎn)品與宣傳標(biāo)示的添加量嚴(yán)重不符，侵犯了消費(fèi)者的利益。牛乳鐵蛋白作為生鮮牛乳中的天然成分，更多地保留其天然營(yíng)養(yǎng)活性也是目前關(guān)注的技術(shù)重點(diǎn)，“國(guó)家優(yōu)質(zhì)乳工程”明確提出優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳生物活性物質(zhì)的指標(biāo)要求——乳鐵蛋白≥25mg/L。如此看來(lái)，對(duì)乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白進(jìn)行檢測(cè)顯得尤為重要，其不僅能對(duì)標(biāo)示添加量進(jìn)行控制，還可對(duì)巴氏殺菌工藝進(jìn)行精準(zhǔn)控制。

2 乳鐵蛋白的常用檢測(cè)技術(shù)

目前，乳制品及相關(guān)食品中的牛乳鐵蛋白檢測(cè)尚無(wú)國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的常用檢測(cè)方法按照檢測(cè)原理可分為免疫學(xué)分析法（免疫擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測(cè)法）和色譜分析法（高效液相色譜法、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法/超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、凝膠電泳檢測(cè)方法）。此外，分光光度法、離子共振法、生物傳感測(cè)定法、核酸適配體法等也有所報(bào)道。

2.1免疫學(xué)檢測(cè)

免疫學(xué)檢測(cè)是基于抗原抗體特異性反應(yīng)的檢測(cè)方法，已報(bào)道的乳鐵蛋白檢測(cè)方法有隨機(jī)免疫擴(kuò)散法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測(cè)方法等。免疫學(xué)檢測(cè)的關(guān)鍵在于抗體的特異性，即乳鐵蛋白抗體與乳制品及相關(guān)食品中其他酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等成分無(wú)交叉反應(yīng)。

2.1.1 免疫擴(kuò)散法

免疫擴(kuò)散法以抗原-抗體的免疫沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)，以瓊脂為惰性載體，通過(guò)沉淀帶與乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度的關(guān)系即可定量測(cè)定待測(cè)樣品中乳鐵蛋白的含量。

免疫擴(kuò)散法可用于檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的含量。該方法成本相對(duì)低廉，但操作步驟復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)大于48h，且檢測(cè)結(jié)果需通過(guò)人為測(cè)量沉淀環(huán)直徑進(jìn)而容易產(chǎn)生誤差，檢測(cè)范圍在50～200mg/L之間，故在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用并不廣泛。

2.1.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是在抗原與抗體特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上通過(guò)酶標(biāo)記及顯色劑判斷最終結(jié)果的常用檢測(cè)方法。乳鐵蛋白的分子量為70～80kD，因此常采用酶聯(lián)免疫雙抗夾心法進(jìn)行測(cè)定——在酶標(biāo)微孔上預(yù)包被牛乳鐵蛋白抗體，預(yù)包被的牛乳鐵蛋白抗體與酶標(biāo)抗體（酶標(biāo)物）同時(shí)與樣本中的牛乳鐵蛋白結(jié)合形成抗體-牛乳鐵蛋白-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)TMB底物顯色，樣本吸光值與牛乳鐵蛋白的含量呈正相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中牛乳鐵蛋白的含量。

由于抗原與抗體的特異性及酶催化效率，酶聯(lián)免疫方法具有反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，對(duì)于乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白的檢測(cè)，乳粉檢出限可達(dá)20mg/kg，液體乳檢出限可達(dá)到0.1mg/kg。目前，酶聯(lián)免疫法商品化試劑盒的研發(fā)技術(shù)已相對(duì)成熟，故使檢測(cè)操作更為簡(jiǎn)便，能夠?qū)Υ罅繕颖具M(jìn)行檢測(cè)，但不同廠家的試劑盒、實(shí)驗(yàn)人員的操作經(jīng)驗(yàn)和熟練程度等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度有所影響。由于嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品中相關(guān)乳制品中乳鐵蛋白的添加量較高，且不同廠家之間差異較大，因此檢測(cè)時(shí)需將樣本稀釋在試劑盒的線性范圍內(nèi)，使稀釋倍數(shù)提升2000～4000倍;同時(shí)，不同廠家之間的配方也有所不同，其他元素的干擾較多、樣本前處理方法不當(dāng)?shù)榷紩?huì)造成檢測(cè)結(jié)果的差異。為減少誤差，保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)于同一樣本的檢測(cè)需要定期對(duì)試劑盒進(jìn)行質(zhì)控和回收試驗(yàn)，建議每次對(duì)不同樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)都要進(jìn)行隨行質(zhì)控或回收試驗(yàn)。

2.1.3 免疫層析快速檢測(cè)

免疫層析快速檢測(cè)法的特點(diǎn)是在抗原與抗體特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上利用標(biāo)記技術(shù)和層析反應(yīng)，達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測(cè)待檢物的目的。對(duì)于簡(jiǎn)單樣本液體乳而言，該方法不需要進(jìn)行前處理即可對(duì)大量樣本中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行快速篩查，具有簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。乳鐵蛋白免疫層析快速檢測(cè)法的檢測(cè)限最低可達(dá)2.4μg/L，具有靈敏度高的特點(diǎn)，但該方法因存在樣本基質(zhì)差異問(wèn)題和假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，不適用于其他成分復(fù)雜乳制品及相關(guān)食品的檢測(cè)，也不適用于執(zhí)法機(jī)構(gòu)進(jìn)行判別確證。因此，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)特點(diǎn)選取合適檢測(cè)限的免疫層析快速檢測(cè)產(chǎn)品用于企業(yè)對(duì)巴氏殺菌工藝控制的快速判別。

2.2 色譜法檢測(cè)

色譜法檢測(cè)是利用不同的物質(zhì)在固定性和流動(dòng)相兩相間的分配不同，從而達(dá)到待測(cè)物分離的目的。目前報(bào)道的乳鐵蛋白檢測(cè)方法有高效液相色譜法、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法/超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、凝膠電泳檢測(cè)方法等。

2.2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是利用不同的色譜柱對(duì)不同組分因分配系數(shù)及吸附力大小的不同而被分離，并被特定檢測(cè)器識(shí)別的定量檢測(cè)技術(shù)。HPLC方法因具有反應(yīng)靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在眾多乳鐵蛋白檢測(cè)方法中已被作為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)公布實(shí)施，同時(shí)也被作為食品中乳鐵蛋白測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿中的第一法。此方法對(duì)于液態(tài)乳樣品的檢測(cè)定量限可達(dá)到5～20mg/kg，乳粉等固態(tài)樣品的定量限可達(dá)到10～100mg/kg。但因受復(fù)雜基質(zhì)所影響，HPLC方法在其他樣本檢測(cè)中的定量限不盡相同，如在特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的定量限能夠達(dá)到150mg/kg。HPLC方法的實(shí)際應(yīng)用并不廣泛，主要原因在于儀器昂貴、操作相對(duì)復(fù)雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高等。HPLC操作中復(fù)雜度較高的主要環(huán)節(jié)是樣品前處理，因其對(duì)樣品純度要求較高，且乳制品及相關(guān)食品的基質(zhì)成分相當(dāng)復(fù)雜，故無(wú)法直接進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，目前常用肝素親和柱凈化乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白的檢測(cè)，而肝素親和柱的使用又增加了樣品的檢測(cè)成本。

2.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

質(zhì)譜儀通過(guò)測(cè)量特定離子的質(zhì)核比來(lái)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行準(zhǔn)確定性，并能與高效液相色譜/超高效液相色譜等聯(lián)用來(lái)達(dá)到精確定量的目的。牛乳鐵蛋白的分子質(zhì)量為70～80kD，其檢測(cè)是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)與高效液相色譜-質(zhì)譜法/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合進(jìn)行，即先利用堿性胰蛋白酶水解牛乳鐵蛋白確定乳鐵蛋白的特異性肽段，并配合穩(wěn)定同位素肽段作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白定量檢測(cè)。該類方法抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度極高、重復(fù)性好，其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的乳鐵蛋白定量限可達(dá)5mg/kg，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的乳鐵蛋白定量限可達(dá)0.077～0.137mg/kg。此方法適用于多種樣本中牛乳鐵蛋白的含量測(cè)定，同時(shí)也能對(duì)其他來(lái)源的乳鐵蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。但這一方法的前處理過(guò)程需將乳鐵蛋白酶解，而活性與非活性乳鐵蛋白均可參與此過(guò)程，致使最終的檢測(cè)結(jié)果為樣本中乳鐵蛋白的總量，并不能區(qū)分樣本中活性乳鐵蛋白與非活性乳鐵蛋白。此外，該方法使用的設(shè)備相比HPLC更加昂貴，對(duì)操作人員的專業(yè)性要求也更高，因此適用性并不廣泛。

2.2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是以毛細(xì)管為分離通道、高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的液相分離技術(shù)，也是實(shí)驗(yàn)室常用的分離與檢測(cè)蛋白質(zhì)的手段，該方法操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)乳鐵蛋白的定量限可達(dá)50mg/kg。但是，采用該方法易使乳鐵蛋白被毛細(xì)管壁吸附，導(dǎo)致檢測(cè)重復(fù)性差。通過(guò)體系優(yōu)化可以解決此問(wèn)題，但不適用于乳鐵蛋白含量較低的樣本檢測(cè)，僅適用于添加乳鐵蛋白含量較多的食品檢測(cè)。

2.2.4 凝膠電泳檢測(cè)法

凝膠電泳檢測(cè)法是利用不同的DNA探針在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率不同，從而對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離檢測(cè)的方法。在乳鐵蛋白檢測(cè)領(lǐng)域，選擇一種DNA探針?lè)肿优c乳鐵蛋白特異性結(jié)合，根據(jù)DNA-乳鐵蛋白結(jié)合物在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率與條帶的灰度值便可對(duì)樣本中乳鐵蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。此方法使樣本中的乳鐵蛋白在高溫條件下與DNA探針進(jìn)行特異性結(jié)合，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，奶粉檢出限可達(dá)74mg/kg，生乳等的檢出限可達(dá)10mg/L，且無(wú)需借助色譜/質(zhì)譜/光譜等大型儀器，成本低、通量高，但操作相對(duì)繁瑣。

3 小結(jié)

綜上所述，不同檢測(cè)方法有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)，監(jiān)管者、生產(chǎn)者可根據(jù)樣本類型及檢驗(yàn)需求選擇合適的檢驗(yàn)方法，但仍迫切需要建立統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，讓不同檢驗(yàn)方法擁有統(tǒng)一的對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)。