茶樹花Cu/Zn-SOD酶活性及其基因表達分析

王夢馨 吳國火 崔林 韓寶瑜

摘? 要：為研究Cu/Zn-SOD基因在茶樹花不同發(fā)育階段、不同品種間的表達規(guī)律以及Cu/Zn-SOD基因表達量與酶活性之間的關(guān)系，本研究將‘龍井43品種茶樹花分為4個發(fā)育階段，選擇15個品種的茶樹花為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術(shù)對3個Cu/Zn-SOD基因表達水平進行定量分析，同時測定Cu/Zn-SOD酶活性。結(jié)果表明：在茶樹花的4個發(fā)育階段中，第4階段Cu/Zn-SOD酶活性最低，與其他3個階段具有顯著差異;不同品種的茶樹花Cu/Zn-SOD酶活性有較大差異，其中‘紫鵑茶樹花Cu/Zn-SOD酶活性最高，其次是‘黃金芽和‘白葉1號，‘黃觀音的Cu/Zn-SOD酶活性最低。茶樹花不同發(fā)育階段中Cu/Zn-SOD基因表達水平存在較大差異，細胞質(zhì)型Cu/Zn-SOD1基因表達水平遠高于葉綠體型Cu/Zn-SOD2和過氧化物酶體Cu/Zn-SOD3;不同品種茶樹花Cu/Zn-SOD基因表達水平有較大差異，Cu/Zn-SOD1基因在‘黃牡丹茶樹花中表達量最高，Cu/Zn-SOD2基因在‘白葉1號和‘黃觀音茶樹花中表達量最高，Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鵑茶樹花中的表達量最高。相關(guān)性分析得知‘龍井43茶樹花不同發(fā)育階段Cu/Zn-SOD酶活性與Cu/Zn-SOD基因表達量之間的相關(guān)性不明顯，而不同品種茶樹花的Cu/Zn-SOD酶活性與Cu/Zn-SOD3基因表達量存在顯著相關(guān)性。本研究初步明確了Cu/Zn-SOD酶活性較高的茶樹品種和茶樹花適宜的采摘時間，為茶樹花SOD進一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：茶樹花;Cu/Zn-SOD基因;實時熒光定量PCR;Cu/Zn-SOD酶活性;‘龍井43中圖分類號：S571.1 ?????文獻標識碼：A

Enzyme Activity Characteristics and Expression ofCu/Zn-SODGene in Tea Flowers

WANG Mengxin， WU Guohuo， CUI Lin， HAN Baoyu^*

College of Life Sciences， China Metrology University / Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine， Hangzhou， Zhejiang 310018， China

Abstract：In order to study the expression characteristics ofCu/Zn-SODgene in the flowers within different developmental stages and various cultivars of tea plant flowers， and to discuss the correlationship between the expression ofCu/Zn-SODgene and its enzyme activity， four developmental stages of cultivar ‘Longjing 43 tea flower and 15 tea plant cultivars of fresh flowers were studied. The expression of threeCu/Zn-SODgenes was quantitatively analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR techniques， and the enzyme activity of the three Cu/Zn-SOD was also determined simultaneously. The lowest Cu/Zn-SOD enzyme specific activity was found in the fourth stage， and the difference was significant when compared with the other developmental stages. The specific activity of Cu/Zn-SOD enzyme in different cultivars of tea flowers was significantly different. The Cu/Zn-SOD enzyme specific activity of ‘Zijuan tea flower was the highest， followed by ‘Huangjinya and ‘Baiye 1. The activity of Cu/Zn-SOD enzyme of ‘Huangguanyin tea flower was the lowest. The expression level ofCu/Zn-SODdiffered among the developmental stages， and the expression of cytoplasmicCu/Zn-SOD1gene was much higher than those of chloroplast typeCu/Zn-SOD2and peroxisomeCu/Zn-SOD3. The expression ofCu/Zn-SODin different cultivars was significantly different.Cu/Zn-SOD1had the highest expression in cultivar ‘Huangmudan tea flower，Cu/Zn-SOD2gene had the highest expression in cultivars ‘Baiye 1 and ‘Huangguanyin tea flowers， andCu/Zn-SOD3gene had the highest expression in cultivar ‘Zijaun tea flowers. The result of correlation analysis showed that the specific activity of Cu/Zn-SOD had no correlation withCu/Zn-SOD gene expression in different developmental stages of ‘Longjing 43 tea flowers， but had considerable correlation withCu/Zn-SOD3 gene expression in different tea cultivars. In this study， both tea cultivars and suitable plucking stage with high Cu/Zn-SOD activity were preliminarily expounded， which would provide references for the further research on SOD.

Keywords： tea plant flowers;Cu/Zn-SODgene; real time fluorescence quantitative PCR; Cu/Zn-SOD enzyme activity; cultivar ‘Longjing 43

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.014

茶樹花是茶樹（Camellia sinensis（L.） O. Kuntze）的有性生殖器官^[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、香精油、茶多糖、維生素等營養(yǎng)和功能成分及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性物質(zhì)^[2-6]，對人體具有解毒、降脂、降糖、保護腸胃、增強免疫力和抗氧化等功效^[7-8]。2013年衛(wèi)生部第1號文件批準茶樹花為新資源食品，允許直接開發(fā)和利用。研究發(fā)現(xiàn)茶樹花含有抗氧化活性物質(zhì)，有較強抗氧化功能，可與抗氧化植物迷迭香相媲美^[9]，其中SOD酶起重要作用^[10]。SOD酶是一種生物內(nèi)源性抗氧化劑，可通過歧化作用清除體內(nèi)超氧陰離子自由基，減輕對細胞的損傷，在維持細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能中起著十分關(guān)鍵的作用^[11]，其研究已深入到食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域，應(yīng)用范圍廣泛。根據(jù)金屬輔因子的不同SOD酶可分為3類，即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD^[12]。Cu/Zn-SOD酶是SOD結(jié)構(gòu)的第一族，在SOD酶中比例最大，占SOD總量86%^[13]。一般植物來源的SOD為Cu/Zn-SOD，包括細胞質(zhì)型、葉綠體型及過氧化物酶體型3個類型^[14]，其在活性氧清除的酶系中尤為重要，與植物的抗寒、耐鹽堿等多種抗逆性關(guān)系密切^[15-16]，且植物源SOD有利于人體吸收，使用安全性高，對社會和經(jīng)濟效益明顯，市場前景廣闊。目前有關(guān)茶樹中超氧化物歧化酶的研究主要集中于SOD酶在逆境脅迫中的作用^[17-18]，對茶樹花中超氧化物歧化酶的研究主要在SOD酶抗氧化、提取工藝方面^[19-20]，對SOD酶活及其基因表達的報道較少。

本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)，對上述3類Cu/Zn-SOD基因在‘龍井43品種茶樹花不同發(fā)育階段中和15個栽培品種茶樹花表達水平做定量分析，同時測定Cu/Zn-SOD酶活性，以探明3類Cu/Zn-SOD基因在茶樹花不同發(fā)育階段之間、茶樹品種之間的表達差異，解析Cu/Zn-SOD基因表達水平與Cu/Zn-SOD酶活性之間的關(guān)系，以初步明確茶樹花適宜采摘時間和Cu/Zn-SOD基因表達量高的茶樹花品種，為茶樹花SOD酶的研發(fā)提供參考。

1? 材料與方法

1.1 材料

2017年11月于中國計量大學(xué)試驗茶園（30°19?29.90? N，120°21?19.16? E，海拔11?m）中，參照劉晶晶等^[21]方法采摘5年生的‘龍井43品種茶樹上4個不同發(fā)育階段的花（第1階段：花瓣露白，第2階段：花瓣初綻，第3階段：完全綻放，第4階段：花瓣開?。┮约傲硗?4個國家級茶樹良種5年生茶樹上第3階段的花（圖1）。液氮速凍后，置于?80?℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1? Cu/Zn-SOD酶活性的測定? 準確稱取樣品0.25?g，加入1?mL預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（pH?7.4，0.01?mol/L Tris-HCl，0.0001?mol/L EDTA-2Na，0.01?mol/L蔗糖，0.8%?NaCl），冰浴條件下進行勻漿，制成20%的勻漿液，3500?r/min，離心10?min，取上清液待測。采用南京建成生物工程研究所提供的黃嘌呤氧化酶法（植物銅鋅超氧化物歧化酶測試盒A001-4）測定樣品Cu/Zn-SOD酶活性。每毫克植物組織蛋白在1?mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量定義為1個SOD活力單位（U）。

1.2.2? 總RNA提取及cDNA合成? 參照天根RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒操作方法提取各樣品總RNA，測得RNA濃度及A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8～2.0之間。RNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的總RNA有明顯的28S和18S兩條帶，亮度比例大致為2∶1左右，且無拖尾現(xiàn)象，說明所提取的總RNA完整。按照PrimSctipt^TM RT Reagent Kit （Perfect Real Time） 操作方法，將各樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。獲得的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或–20?℃貯藏備用。

1.2.3? 實時熒光定量PCR分析 ?以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用基因?qū)Ｒ恍砸?sup>[22]（表1）進行相關(guān)基因的熒光定量分析。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）選取GAPDH作為內(nèi)參基因^[23]進行校正。qRT-PCR方法參照SYBR Premix Ex Taq^TM（TaKaRa）試劑盒?？傮w系20?μL﹕10?μL SYBR Premix Ex Taq（2×）、10??mol/L上引物和下引物各0.4??L、ROX Reference Dye（50×）0.4??L、2??L cDNA、加無菌水補足至20??L。反應(yīng)在熒光定量PCR儀（ABI stepone plus）上進行。擴增程序為：95?℃預(yù)變性1 min;95?℃變性15?s， 58?℃退火25?s，共45個循環(huán)，最后從55～95?℃記錄溶解曲線。通過分析溶解曲線，確定擴增產(chǎn)物為單一PCR產(chǎn)物。樣品和內(nèi)參分別重復(fù)3次。采用2^-ΔΔCt方法進行基因表達水平分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件對試驗數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析，利用Duncans 新復(fù)極差法進行顯著性分析;采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行Pearson相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? ‘龍井43茶樹花的4個發(fā)育階段及不同品種茶樹花Cu/Zn-SOD酶活性的差異分析

在‘龍井43茶樹花的4個發(fā)育階段中，Cu/Zn-SOD酶活性具有差異（圖2）。隨著茶樹花的逐漸發(fā)育，Cu/Zn-SOD酶活性呈下降趨勢。Cu/Zn-SOD酶活性由高到低順序依次為：第1階段>第3階段>第2階段>第4階段。第1階段Cu/Zn-SOD酶活性最高，顯著高于第4階段（P< 0.05），但與第2、第3階段酶活性差異不顯著。

對15個茶樹品種茶樹花第3發(fā)育階段的酶活性測定中，發(fā)現(xiàn)：‘紫鵑（編號15）和‘黃金芽（編號9）茶樹花Cu/Zn-SOD酶活性最高，顯著高于其他品種茶樹花（P<0.05）。其次是‘白葉1號（編號5）、‘中茶108（編號3）和‘龍井43（編號1）?！S觀音（編號12）茶樹花酶活性最低，‘紫鵑酶活性是‘黃觀音的2.3倍左右（圖3）。

2.2‘龍井43茶樹花Cu/Zn-SOD基因表達的變化

在‘龍井43品種茶樹花的4個發(fā)育階段中，選擇第3發(fā)育階段3個Cu/Zn-SOD基因的表達水平為對照，即1個標準單位，據(jù)此分別計算3個Cu/Zn-SOD基因在其他3個發(fā)育階段的相對表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個Cu/Zn-SOD基因在‘龍井43茶樹花的4個不同發(fā)育階段的表達水平都有較大差別（圖4）。其中，Cu/Zn-SOD1基因的表達水平隨著茶樹花的發(fā)育而上調(diào)，在第4階段達到最大值，顯著高于其他階段（P<0.05），是對照的1.2倍左右;Cu/Zn-SOD2基因表達水平呈先下降、后上升、再下降的趨勢，在第3階段達到最大值;Cu/Zn- SOD3基因表達水平呈先上升、后下降的趨勢，在第2階段達到最大值，是對照的1.2倍左右。

茶樹花的4個發(fā)育階段中的表達差異：在各個發(fā)育階段中分別選用Cu/Zn-SOD1基因的表達水平為對照，即1個標準單位，據(jù)此計算Cu/Zn-SOD2、Cu/Zn-SOD3基因在第1、2、3、4發(fā)育階段的相對表達水平（圖5），發(fā)現(xiàn)‘龍井43茶樹花的4個發(fā)育階段中Cu/Zn-SOD1基因表達水平最高，均顯著高于其他2個基因（P<0.05）;在茶樹花第1發(fā)育階段，Cu/Zn-SOD1基因表達水平是Cu/Zn- SOD2基因表達水平的8倍左右，是Cu/Zn-SOD3基因的30倍以上;在茶樹花的第2發(fā)育階段，Cu/Zn-SOD1表達水平是Cu/Zn-SOD2的18倍，是Cu/Zn-SOD3的30倍;在茶樹花的第3發(fā)育階段，Cu/Zn-SOD1表達水平是Cu/Zn-SOD2、Cu/Zn- SOD3的30倍以上，Cu/Zn-SOD2的是Cu/Zn-SOD3的1.4倍左右;在茶樹花的第4發(fā)育階段，Cu/Zn- SOD1的是Cu/Zn-SOD2的40倍，是Cu/Zn-SOD3的80倍以上。

2.3不同品種茶樹花Cu/Zn-SOD基因的表達差異分析

在15個茶樹品種的茶樹花發(fā)育的第3階段中，Cu/Zn-SOD基因的表達水平存在明顯差異（圖6）。分別以‘龍井43茶樹花的3個Cu/Zn-SOD基因的表達水平作為對照。結(jié)果顯示，Cu/Zn- SOD1基因在‘黃牡丹（編號14）茶樹花中表達量最高，是對照的2.4倍左右，與其他品種差異顯著（P<0.05）。其次為‘鳩坑早（編號7）和‘紫鵑（編號15），皆顯著高于其他品種茶樹花（P<0.05），而在‘金觀音（編號11）中表達量最低。Cu/Zn-SOD2基因在‘白葉1號（編號5）、‘黃觀音（編號12）和‘龍井43（對照，編號1）茶樹花中表達量最高，‘金觀音（編號11）和‘中茶108（編號3）表達量最低。Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鵑（編號15）茶樹花中表達量最高，是對照的2倍左右，其次為‘黃金芽‘白葉1號‘紫牡丹‘金觀音等，其中‘平陽特早（編號2）表達量最低。

2.4茶樹花Cu/Zn-SOD酶活性與基因表達水平的相關(guān)性

對15個品種茶樹花中每個Cu/Zn-SOD基因表達水平與Cu/Zn-SOD酶活性之間關(guān)聯(lián)度進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Cu/Zn-SOD3基因的表達水平與Cu/Zn-SOD酶活性呈顯著性相關(guān)性（P<0.05），其他2個Cu/Zn-SOD基因的表達水平與Cu/Zn-SOD酶活性的相關(guān)系數(shù)均未達到顯著性水平（表2）。分析‘龍井43茶樹花整個發(fā)育階段（第1～4階段）每個Cu/Zn-SOD基因表達量與Cu/Zn-SOD酶活性之間關(guān)聯(lián)度（表3），相關(guān)系數(shù)均未達到顯著性水平。

[5]?????? 田國政， 王東輝， 周光來， 等. 茶樹花營養(yǎng)成分的分析與評價[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2004（2）： 26-28.

[6]?????? 黃阿根， 董瑞建， 韋? 紅. 茶樹花活性成分的分析與鑒定[J]. 食品科學(xué)， 2007（7）： 400-403.

[7]?????? Yang Z Y， Xu Y， Jie G L，et al. Study on the antioxidant activity of tea flowers （Camellia sinensis）[J]. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition， 2007， 16（S1）： 148-152.

[8]?????? Yoshikawa M， Sugimoto S， Kato Y，et al. Acylated oleanane-type triterpene saponins with acceleration of gastrointestinal transit and inhibitory effect on pancreatic lipase from flower buds of Chinese tea plant （Camellia sinensis）[J]. Chemistry and Biodiversity， 2009， 6（6）： 903-915.

[9]?????? 王秋霜， 趙超藝， 凌彩金， 等. 國內(nèi)外茶樹花研究進展概述[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009（7）： 35-38.

[10]??? 陳鴻鵬， 譚曉鳳. 超氧化物歧化酶（SOD）研究綜述[J]. 經(jīng)濟林研究， 2007（1）： 59-65.

[11]??? Kim K Y， Lee S Y， Cho Y S，et al. Molecular characterization and mRNA expression during metal exposure and thermal stress of copper/zinc-and manganese-superoxide dismutases in disk abalone，Haliotis discusdiscus[J]. Fish and Shellfish Immunology， 2007， 23（5）： 1043-1059.

[12]??? KenIchi O， Sumio K， Kozi A. Intra- and extra-cellular localization of “Cytosolic” CuZn-superoxide dismutase in spinach leaf and hypocotyl[J]. Plant and Cell Physiology， 1996， 37（6）： 790-799.

[13]??? 饒麗莎， 許珊珊， 黃田盛， 等. 杉木Cu/Zn-SOD基因克隆、序列特征及組織特異性表達[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報， 2018， 33（2）： 75-82.

[14]??? Kliebenstein D J， Monde R A， Last R L. Superoxide dismutase inArabidopsis： an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization[J]. Plant Physiology， 1998， 118（2）： 637-650.

[15]??? 馮昌軍， 羅新義， 沙? 偉， 等. 低溫脅迫對苜蓿品種幼苗SOD、POD活性和脯氨酸含量的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)， 2005（6）： 29-32

[16]??? Song F N， Yang C P， Liu X M，et al. Effect of salt stress on activity of superoxide dismutase （SOD） inUlmus pumilaL.[J]. Journal of Forestry Research， 2006， 17（1）： 13-16.

[17]??? 屠幼英， 楊秀芳， 楊賢強. 茶樹抗逆境生理與超氧歧化酶（SOD）的相關(guān)性[J]. 茶葉， 1996（2）： 40-43.

[18]??? 朱? 政， 蔣家月， 江昌俊， 等. 低溫脅迫對茶樹葉片SOD、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011， 38（1）： 24-26.

[19]??? 白婷婷， 孫威江， 黃伙水. 茶樹花的特性與利用研究進展[J]. 福建茶葉， 2010， 32（Z1）： 7-11.

[20]??? 翁? 蔚. 茶（Camellia sinensis）花主要生物活性成分研究及應(yīng)用展望[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2004.

[21]??? 劉晶晶， 王富民， 劉國峰， 等. 茶樹萜類香氣物質(zhì)代謝譜與相關(guān)基因表達譜時空變化的關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報， 2014， 41（10）： 2094-2106.

[22]??? 王? 仲. 鐵觀音茶樹SOD家族成員基因克隆及其低溫脅迫表達分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2016.

[23]??? 孫美蓮， 王云生， 楊冬青， 等. 茶樹實時熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 植物學(xué)報， 2010， 45（5）： 579-587.

[24]??? Mckersie B D， Murnaghan J， Jones K S，et al. Ironsuperoxide dismutase expression in transgenic alfalfa increases winter survival without a detectable increase in photosynthetic oxidative stress tolerance[J]. Plant Physiology， 2000， 122（4）： 1427-1437.

[25]??? 汪本勤， 陳? 曦， 向成斌. SOD活性增高的擬南芥晚花突變體具有增強的非生物脅迫耐受性[J]. 植物學(xué)通報， 2007（5）： 572-580.

[26]??? 姜慧芳， 任小平. 干旱脅迫對花生葉片SOD活性和蛋白質(zhì)的影響[J]. 作物學(xué)報， 2004（2）： 169-174.

[27]??? 李? 敏， 王維華， 王? 然， 等. 高溫脅迫對菠菜葉片保護酶活性和膜透性的影響[J]. 園藝學(xué)報， 2004（1）： 99-100.

[28]??? 王? 盛， 張保青， 黃? 杏， 等. 甘蔗Cu/Zn-SOD的克隆和表達分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46（15）： 3277-3284.