青藏高原高寒草甸退化對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化微生物基因的影響

王向濤， 張 超， 廖李榮3,， 王 杰， 喻嵐輝3,， 張憲洲

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 西藏 林芝 860000； 2.中國(guó)科學(xué)院 地理科學(xué)與資源研究所，生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測(cè)與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 拉薩高原生態(tài)試驗(yàn)站， 北京 100101; 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049;4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 水土保持研究所， 陜西 楊凌 712100; 5.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 北京 100190)

目前，對(duì)于青藏高原高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)已開展了大量研究，如植物群落的演替[7]、土壤養(yǎng)分[8]以及微生物量[9]、酶活性[10]的變化，而對(duì)于土壤參與氮素轉(zhuǎn)化的微生物研究相對(duì)較少，而這是深刻認(rèn)識(shí)草地退化的關(guān)鍵科學(xué)問題。鑒于此，本研究以青藏高原不同退化程度的高寒草甸為對(duì)象，分析退化過程中土壤氮素轉(zhuǎn)化微生物基因豐度的變化，明確其影響因素，為退化高寒草甸的科學(xué)治理和人工恢復(fù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于西藏自治區(qū)拉薩市當(dāng)雄縣草原站(91°05′E，30°51′N)，海拔高度4 330 m，年均溫為1.3 ℃，最高月(7月)平均溫度為10.7 ℃，最低月(1月)平均溫度為10.4 ℃。年平均降水量為476 mm，集中在6—8月之間。草地類型為高寒草甸，優(yōu)勢(shì)種為高山嵩草(Kobresiapygmaea)，常見伴生種有窄葉苔草(Carexmontis-everestii)、絲穎針茅(Stipacapillacea)、二裂葉委陵菜(Potentillabifurca)和釘柱委陵菜(Potentillasaundersiana)等。土壤類型為典型的高山草甸土。

1.2 樣品采集

根據(jù)草地植物種類及蓋度的差異，參照Xue等[11]對(duì)天然草地退化等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定為未退化(non-degraded， ND)，輕度退化(light degraded， LD)，中度退化(moderate degraded， MD)以及重度退化(severe degraded， SD)4種退化草地處理。每個(gè)小區(qū)面積為40 m×60 m，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。于2018年8月采集樣品，采用蛇形取樣法，每個(gè)小區(qū)沿150 m的樣條建立了5個(gè)等間距的采樣點(diǎn)(0.5 m×0.5 m)，以內(nèi)徑為3.5 cm 的土鉆，采集0—20 cm 土樣，每樣地取樣5～8個(gè)，混為1個(gè)土樣。土壤樣本去除枯落物及植物根系后，分為兩個(gè)部分，一部分過篩風(fēng)干進(jìn)行理化性質(zhì)的測(cè)定分析，另一部分保存在-80 ℃用于進(jìn)行DNA的提取。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

1.4 土壤微生物功能基因豐度測(cè)定

微生物功能基因豐度采用定量PCR測(cè)定。本研究中主要測(cè)定了參與土壤氮素轉(zhuǎn)化的7個(gè)基因，包括nifH,amoA-AOA,amoA-AOB,narG,nirK,nirS以及nosZ，其功能見表1，測(cè)定方法參考廖李容等[13]，即取0.25 g凍干樣品，按照UltraClean soil DNA Extraction Kit試劑盒的說明書，提取土壤總DNA，目的基因引物序列見表1，擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃，持續(xù)60 s；30個(gè)循環(huán)，98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s；在72 ℃下保持5 min，每個(gè)樣品重復(fù)3次，使用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)測(cè)定濃度。

表1 氮轉(zhuǎn)化微生物功能基因PCR擴(kuò)增引物及對(duì)應(yīng)功能[13]

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析對(duì)不同退化程度草地的土壤理化性質(zhì)及功能基因進(jìn)行差異分析，并使用最小顯著性差異法對(duì)不同退化草地之間的差異進(jìn)行多重比較，顯著水平為0.05。采用Pearson法和冗余分析 (RDA)，分析氮轉(zhuǎn)化基因與土壤性質(zhì)之間的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)分析采用R的vegan包，利用SigmaPlot 12.0作圖。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

高寒草甸退化顯著影響土壤理化性質(zhì)(見表2)。與未退化草甸相比，退化草甸的土壤有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均顯著降低(p<0.05)，降幅分別達(dá)41.9%～67.5%，26.8%～56.2%，44.7%～76.6%和36.0%～58.9%。輕度退化草甸的速效磷及速效鉀含量與未退化草甸相比無顯著差異(p>0.05)，顯著高于中度和重度退化草甸(p<0.05)。土壤pH值變化為6.43～6.90，且隨退化程度的增高而逐漸增加。退化降低了土壤水分，其含量隨退化程度的增高而逐漸下降，與未退化草甸相比，重度退化草甸的水分含量降低了33.6%。

表2 不同退化草地土壤理化性質(zhì)

2.2 土壤氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)基因

由表3可以看出，不同退化程度草甸的土壤氮素轉(zhuǎn)化微生物基因豐度差異顯著。其中，nifH基因的豐度變幅最大(每g干土6.88×103～2.76×109個(gè)拷貝數(shù))，且隨退化程度的加劇而逐漸下降，與未退化草甸相比，重度退化草甸的nifH基因豐度降低了78.1%。amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度分別為5.24×103～3.06×109和7.02×103～2.96×109個(gè)拷貝數(shù)，兩者變化趨勢(shì)相同，均隨退化程度顯著降低(p<0.05)，中度退化和重度退化草甸的土壤amoA-AOA基因豐度無明顯差異(p>0.05)，但均顯著低于未退化和輕度退化草甸。nirK和nirS基因變化趨勢(shì)與nifH相反，隨退化程度的加劇而增加，重度退化草甸的nirK和nirS豐度最高，顯著高于未退化草甸(p<0.05)。輕度退化和中度退化草甸土壤中narG基因豐度與未退化草甸無顯著差異，但顯著低于重度退化草甸(p<0.05)。不同退化草甸之間nosZ基因豐度無顯著差異(p>0.05)。

表3 不同退化草地土壤氮轉(zhuǎn)化微生物功能基因豐度

2.3 氮素轉(zhuǎn)化微生物基因與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明(見表4)，nifH基因與土壤pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)，與水分、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及速效鉀呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。

由表4可知，amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度與土壤含水量的相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)分別為0.76和0.81。nirK和nirS基因與pH值呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，而與土壤含水量、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和全磷呈顯著負(fù)相關(guān)。narG則與銨態(tài)氮呈顯著正相關(guān)。

表4 土壤理化性質(zhì)與氮素轉(zhuǎn)化微生物基因豐度的相關(guān)性

RDA分析表明(見圖1)，土壤理化特性解釋了53.2%氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度變異，其中第1軸解釋率為52.7%，第2軸解釋率為10.5%。土壤有機(jī)碳，pH值和含水量是影響高寒草甸土壤氮素微生物基因的主要因素。其中，有機(jī)碳和pH對(duì)nifH基因變化的影響較大，含水量對(duì)amoA-AOA和amoA-AOB基因影響較大，pH值對(duì)nirK和nirS基因影響較大。

注：OC為有機(jī)碳; TN為全氮;為銨態(tài)氮;為硝態(tài)氮; AP為速效磷; AK為速效鉀; WC為含水量; 虛線箭頭線為微生物基因豐度; 實(shí)線箭頭線為土壤理化特征。

3 討 論

在土壤—植被體系中，土壤制約植被，尤其是土壤養(yǎng)分會(huì)引起植物群落結(jié)構(gòu)及物種多樣性的改變[14]。近年來，由于超載放牧等人為干擾及氣候變化異常等多重因素的影響，草地沙化、黑土灘化、植被稀疏化等植被和土壤退化過程不斷加劇，高寒草地生態(tài)功能嚴(yán)重受損。本研究表明，隨著退化程度的加劇，土壤有機(jī)碳、全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均顯著降低，這與王玉琴等[15]、郭小偉等[16]等研究結(jié)果一致，其原因與地上生物量的減少密切相關(guān)。高寒草甸退化導(dǎo)致生物量減少，枯落物也相應(yīng)減少，導(dǎo)致輸入到土壤中的有機(jī)質(zhì)下降，土壤中的碳氮主要來源于有機(jī)質(zhì)，因此土壤中的碳氮含量顯著降低。前人研究表明，植被覆蓋度與土壤含水量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[17-18]。植物蓋度降低必然導(dǎo)致土壤裸露面積增大，引起地表蒸發(fā)量增大，進(jìn)而導(dǎo)致含水量降低以及土壤pH值增加，因此在本研究中，土壤含水量隨退化程度加劇顯著降低，而pH值則顯著增加，這與高海寧等[19]研究結(jié)果一致。王玉琴等[15]發(fā)現(xiàn)，高寒草甸在退化過程中，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量逐漸增加，推測(cè)其原因是嚙齒動(dòng)物排泄物的增加，導(dǎo)致速效氮含量增加。然而，我們發(fā)現(xiàn)土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮隨草甸退化程度的加劇而顯著降低，與王玉琴等[15]結(jié)果相反。由于氮素的轉(zhuǎn)化易受環(huán)境條件的影響，因此這種結(jié)果差異可能與不同草地類型以及人為或動(dòng)物的干擾程度有關(guān)。磷、鉀是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在植物生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[20]。本研究中，隨著退化程度的加劇，土壤速效磷、速效鉀均呈降低趨勢(shì)。造成這一現(xiàn)象的原因是退化草地中土壤微生物減少，使得植物殘?bào)w的分解速率降低，導(dǎo)致土壤中速效磷和速效鉀含量降低。

4 結(jié) 論

青藏高原高寒草甸退化導(dǎo)致土壤有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及水分含量降低及pH值升高。高寒草甸的退化降低了固氮nifH基因、氨氧化amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度，但增加了反硝化narG,nirS和nirK基因豐度。土壤有機(jī)碳，pH值及水分是影響高寒草甸土壤氮素轉(zhuǎn)化微生物基因的主要因素。