犬腺病毒和犬細(xì)小病毒雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法的建立

王艷杰，巨敏瑩，王秀明，劉亭岐，劉東霞，劉建奇，孔彩平，范秀麗，趙麗霞，宋慶慶*

（1. 金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030； 2. 國家工程實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

犬腺病毒（Canine adenovirus，CAV）屬腺病毒科，哺乳動(dòng)物腺病毒屬，其基因組為雙股，線狀DNA 病毒，根據(jù)其血凝和中和試驗(yàn)等特性不同可將CAV 分為I 型和II 型[1-2]， CAV-I 型主要引起犬的致死性肝炎，引起野生犬腦炎病理學(xué)變化；CAV-II 型則引起上呼吸道感染和腸道感染，不引起肺炎癥狀，可引起幼犬咳嗽又叫犬窩咳[1-3]。

犬細(xì)小病毒病又稱犬傳染性出血性腸炎（Ca?nine prvovirus，CPV），屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬成員，是一類無囊膜、單股DNA 病毒。臨床癥狀表現(xiàn)分為腸炎型和心肌炎型，腸炎型潛伏期1～2周，多見于青年犬，病情較輕且治愈率高，而心肌炎型多見于8 周齡以下的幼犬，突然發(fā)病，數(shù)小時(shí)死亡[4-6]。

這兩種病毒單一感染或混合感染均可給養(yǎng)犬業(yè)帶來嚴(yán)重的打擊，兩種犬病原臨床癥狀較為相似，且常伴有混合感染，給臨床診斷造成了一定的困難[7-8]?，F(xiàn)有學(xué)者建立了用于同時(shí)檢測犬瘟熱病毒（CDV）、CPV、CAV-II 型和犬副流感病毒（CPIV）的多重普通PCR 檢測技術(shù)[3]，以及CDV、CPV、I 型和II 型CAV 多重普通PCR 檢測方法[1]，本研究擬建立CAV 和CPV 雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法，以提高產(chǎn)品檢測敏感度和提高產(chǎn)品檢測的效率，并降低氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)，本研究利用TaqMan 檢測技術(shù)原理，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增CAV 的Hexon 基因和CPV 的VP2 基因的2 對(duì)引物和2 條探針，建立雙重TaqMan熒光定量PCR 檢測方法，以實(shí)現(xiàn)CAV 和CPV 的快速鑒別檢測，為兩種病毒的檢測提供有效的技術(shù)保障，同時(shí)為CAV 和CPV 疫苗半成品的抗原定量和疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料CAV DNA、CPV DNA、CDV RNA、CPIV RNA、犬冠狀病毒（CCV）RNA 均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。用于感染實(shí)驗(yàn)犬的CAV、 CPV 株均由金宇保靈生物藥品有限公司分離、鑒定和保存。比格犬購自江蘇省常州市某試驗(yàn)動(dòng)物犬基地。MDCK 細(xì)胞購自ATCC；AceQ qPCR Probe Master Mix 試劑盒購自Vazyme 公司；DL2000 DNA Marker、pMD19-T 載體、JM109 感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等均購自TaKaRa公司；Axyprep 病毒核酸提取試劑盒（AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit）購自AxyGen 公司。

1.2 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank 中登錄的CAV 基因序列（EU717145.1）和CPV 基因序列（EF028071.1），利 用DNAStar 軟 件 進(jìn) 行 同 源 性 分析，采用Primer3 設(shè)計(jì)引物和探針（表1），引物和探針均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 CAV 和CPV 引物、探針序列Table 1 Primers and probes sequence of CAV and CPV

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定分別以CAV 和CPV DNA 為模板，采用表1 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各為0.5 μL，模板為2 μL，加無酶水補(bǔ)充至25 μL；反應(yīng)條件為： 95 ℃5 min；95 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。擴(kuò)增的CAV 和CPV 目的片段長度分別為132 bp 和192 bp，PCR 產(chǎn)物回收經(jīng)試劑盒純化后克隆至pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，選取經(jīng)菌落PCR 鑒定和序列測定分析驗(yàn)證的陽性重組質(zhì)粒pMD-Hexon-CAV 和pMD-VP2-CPV 作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。測定重組質(zhì)粒濃度，并根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式換算成拷貝數(shù)。

1.4 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測方法反應(yīng)條件的優(yōu)化采用25 μL 反應(yīng)體系，其中2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5 μL，上 下游引物（10 μmol/L）各為0.125 μL、0.25 μL、0.375 μL、0.5 μL、0.625 μL，探針（10 μmol/L）為0.25 μL、0.5 μL、0.75 μL、1.00 μL、1.25 μL，模板為5 μL，加dd H2O 補(bǔ)充至25 μL，采用棋盤法進(jìn)行引物和探針濃度優(yōu)化。CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR 體系比例配置按照1:0.5、1:1、1:1.5 和1:2 進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增循環(huán)條件如下：95 ℃，10 min；95 ℃10 s、52 ℃～62 ℃30 s Read，循環(huán)數(shù)為45，進(jìn)行退火溫度優(yōu)化。

1.5 雙重?zé)晒舛縋CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將pMDHexon-CAV 和pMD-VP2-CPV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至108拷貝/μL 后再作10 倍倍比稀釋，采用已建立的雙重?zé)晒舛縋CR（模板為2 種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物）方法進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，通過分析軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)利用優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件對(duì)CDV、CPIV、CCV 核酸進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增，以MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)的CAV-I 型、CAV-II 型和CPV 培養(yǎng)液提取的核酸作為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。驗(yàn)證該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)以分別10 倍倍比稀釋的（101拷貝/μL～108拷貝/μL）的兩個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物作為模板，按照本研究建立的CAV 和CPV 雙重TaqMan熒光定量方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度做3 次重復(fù)。確定TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 的敏感性，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)以103拷貝/μL～106拷貝/μL 4 個(gè)稀釋度CAV 和CPV 混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板分別進(jìn)行3 次重復(fù)擴(kuò)增，利用本研究建立的方法檢測，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性分析；9 個(gè)不同批次的CAV 和CPV 混合模板重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用本研究建立的方法檢測，進(jìn)行組間重復(fù)性分析，計(jì)算變異系數(shù)，分析該方法重復(fù)性。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。

1.9 臨床模擬樣品檢測選擇2～3 月齡健康易感犬6 只，分成3 組，一組口服感染2 mL 103.0TCID50/mL CPV 細(xì)胞培養(yǎng)病毒液，一組分別口服、滴鼻各1 mL 106.0TCID50/mL 的CAV 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 病 毒 液，另 一 組 作 為未感染對(duì)照，連續(xù)觀察感染犬臨床癥狀，并于第14 d 解剖。將采集的分別感染CAV（10 份）和CPV（27 份）的犬新鮮口、鼻、眼、尿、肛式子和心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、胃、氣管、扁桃體、頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)組織，反復(fù)凍融并研磨后加入裂解液進(jìn)行裂解，以提取的樣品基因組DNA/RNA 為模板。分別采用本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR和檢測CAV（DB51/T 1710.7-2013）、CPV 的普通PCR方法[9]進(jìn)行檢測，比較二者的檢測結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定以CAV 和CPV DNA 為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得預(yù)期大小目的片段（圖略）。目的片段回收純化后克隆于pMD19-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-Hexon-CAV 和pMD-VP2-CPV，重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR 鑒定和測序鑒定正確，測得重組質(zhì)粒濃度為103 ng/μL 和81.7 ng/μL，換算成拷貝數(shù)分別為2.27×1010拷貝/μL 和1.80×1010拷貝/μL，作為雙重?zé)晒舛縋CR 的標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立經(jīng)優(yōu)化后，確定反應(yīng)體系為（25 μL）：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 為12.5 μL，CAV 上下游引物（10 μmol/L）各為1 μL，CAV 探針（10 μmol/L）為0.75 μL，CPV 上下游引物（10 μmol/L）各為1 μL，CPV 探針（10 μmol/L）為0.75 μL，CAV 和CPV 1:1 混合模板為5 μL，加dd H2O 補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃10 min； 95 ℃15 s，56 ℃30 s Read，循環(huán)數(shù)為45。經(jīng)優(yōu)化后CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法陰性對(duì)照無CT 值，CAV 和CPV 陽性對(duì)照CT 值均小于30，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲型曲線，每一樣品均進(jìn)行了兩個(gè)重復(fù)（圖1）。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至108拷貝/μL 并作10 倍倍比稀釋，采用優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。結(jié)果顯示，CAV和CPV相關(guān)系數(shù)分別為0.999和0.998，效率分別為99.8 和104.3，均在90%～110%之間，具有良好的線性關(guān)系。其回歸方程分別為，CAV：y=-3.326x+38.933； CPV：y=-3.223x+39.882，因此可以根據(jù)所檢測臨床樣品的Cq 值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出待測樣品的拷貝數(shù)。

圖1 CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of CAV and CPV by the duplex qPCR assay

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用建立的CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測方法對(duì)CDV、CPIV、CCV 核酸進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，設(shè)置2 個(gè)重復(fù)，并設(shè)立陰性和CAV-I、CAV-II、CPV 的核酸作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示只有CAV-I、CAV-II 和CPV 核酸出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且CT 值均小于30，而其他病原和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增曲線，呈陰性（圖2），表明所建立的方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測方法特異性試驗(yàn)Fig.2 The specific test of the duplex qPCR assay

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用本研究建立的CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法對(duì)經(jīng)10倍倍比稀釋的兩個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-Hexon-CAV 和pMD-VP2-CPV 混合物（每一個(gè)質(zhì)粒每個(gè)稀釋度各取2.5 μL）作為模板進(jìn)行該方法敏感性檢測，結(jié)果顯示，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-Hexon-CAV 和pMD-VP2-CPV 的最小檢出量均為101拷貝/μL（圖3）。表明本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法敏感性較高。

圖3 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測方法敏感度檢測Fig.3 The sensitivity test of the duplex qPCR assay

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果利用CAV 和CPV 的4 個(gè)稀釋度的各兩個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板混勻后進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn)，利用變異系數(shù)計(jì)算公式計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果顯示，CAV和CPV組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%（表2），表明該方法具有較好的重復(fù)性。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability test of the duplex qPCR assay

2.6 臨床模擬樣品檢測結(jié)果將分別采集的10 份（CAV）和27 份（CPV）人工感染犬組織樣品，分別利用建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法和普通PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，雙重?zé)晒舛縋CR方法CAV檢測陽性率為0（0/10），CPV 檢測陽性率為88.89%（24/27），普通PCR 方法CAV 檢測陽性率為0（0/10），CPV 檢測陽性率為85.18%（23/27），根據(jù)金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算符合率的方法，所建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法與普通PCR方法CAV 和CPV 的符合率分別為100%和96.30%。表明，所建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法與普通PCR 方法符合率高，且CAV 陽性率低、CPV 陽性率高與感染動(dòng)物典型臨床癥狀相符，同時(shí)本檢測陽性率只能代表本次感染樣品的結(jié)果，受感染病毒株、劑量、途徑和采樣位置的不同，陽性率會(huì)存在差異，本臨床模擬樣品檢測試驗(yàn)僅為驗(yàn)證方法的符合率。

3 討 論

本研究分別根據(jù)CAV 和CPV 的保守基因，設(shè)計(jì)了分別檢測CAV 和CPV 的1 對(duì)引物及其對(duì)應(yīng)的1 條探針，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)病毒的同時(shí)檢測，CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測方法大大縮短了普通PCR 檢測的時(shí)間，并且因其封閉式避免了PCR 產(chǎn)物氣溶膠的污染，更好的保護(hù)了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，而且雙重?zé)晒舛縋CR 相比于單重?zé)晒舛縋CR 降低了試驗(yàn)時(shí)間、成本以及同一樣品中CAV 和CPV 兩指標(biāo)分別檢測的誤差，操作更加準(zhǔn)確、快速。

本研究為避免雙重PCR 兩種不同檢測指標(biāo)之間的干擾，在PCR 引物探針設(shè)計(jì)階段，盡可能將CAV和CPV 的目的片段設(shè)計(jì)得大小接近，且引物，探針退火溫度接近，同時(shí)優(yōu)化了CAV 和CPV 兩種體系的引物和探針濃度對(duì)應(yīng)比例關(guān)系和退火溫度，使兩種病毒檢測干擾因素盡可能最低，經(jīng)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)兩種病毒單重PCR 和雙重PCR 不存在干擾，單重和雙重檢測敏感度均為10 拷貝/μL，8 個(gè)梯度標(biāo)品CT 值也無明顯差異，該熒光定量PCR 檢測敏感度比文獻(xiàn)2 的多重檢測敏感度（106拷貝/μL）約高10 000 倍，比文獻(xiàn)2 的單重檢測敏感度（105拷貝/μL）約高1 000 倍，盡管檢測敏感度的表述方式不一，但根據(jù)文獻(xiàn)[10]的聯(lián)合PCR 與TCID50檢測敏感度比較，證明理論上PCR 檢測方法的敏感度要優(yōu)于TCID50。隨著新型檢測技術(shù)的開發(fā)，文獻(xiàn)[11]的高效納米檢測技術(shù)的敏感度也具有一定的優(yōu)勢，但是同文獻(xiàn)[12]和[13]的普通PCR 一樣，均需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，不利于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的保護(hù)，且無法實(shí)現(xiàn)定量檢測，同時(shí)熒光定量PCR 檢測結(jié)果直觀，無干擾條帶對(duì)結(jié)果判定不清的弊端。

將本研究建立的CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法與普通PCR 檢測方法進(jìn)行符合率分析，符合率高且CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR 不僅能實(shí)現(xiàn)雙指標(biāo)的同時(shí)檢測，并且可實(shí)現(xiàn)兩種病毒的定量檢測，因此本研究所建立的CAV 和CPV 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測方法不僅可用于CAV 和CPV 感染監(jiān)測還可實(shí)現(xiàn)獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)中CAV 和CPV 聯(lián)苗抗原含量的檢測，具有一定的指導(dǎo)生產(chǎn)意義，大大縮短疫苗抗原含量測定時(shí)間。