基于生物信息學分析STAT3、Grim19在卵巢癌中的表達及臨床意義*

王亦如， 楊夢瑩， 陽志軍△

1廣西醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院婦科，南寧 5300212廣西醫(yī)科大學區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，南寧 530021

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是常見的婦科惡性腫瘤，其結(jié)局取決于早期診斷和治療，然而卵巢癌起病隱匿、疾病進展較快，影響患者預后。卵巢癌的一線療法基于腫瘤細胞減滅術(shù)和鉑類藥物化療，而高復發(fā)率和鉑耐藥是當前面臨的臨床難題，貝伐單抗和PARP抑制劑的有效應用進一步提示靶向精準治療的必要性[1-2]。近年來，信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在炎癥和腫瘤[3]、腫瘤微環(huán)境[4]、腫瘤細胞凋亡抑制[5]等生物學過程中的作用得到印證，STAT3靶向抑制劑WP1066[6]、S3I-201[7]在減緩腫瘤進展和增強化療藥物敏感性中的作用取得初步進展，但其機制和精準靶點有待進一步探索。維甲酸-干擾素誘導死亡相關(guān)基因19(the genes-associated with retinoid-interferon induced mortality-19，Grim19)，又名Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復合物13(NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 13，NDUFA13)，一方面作為線粒體復合體Ⅰ的輔助亞基參與線粒體代謝，同時特異地與STAT3相互作用影響腫瘤進展[8]，是可能的腫瘤治療靶點，但其作用機制并不明確。本研究旨在通過生物信息學分析，結(jié)合卵巢癌臨床資料和完整基因芯片信息篩選STAT3、Grim19的相關(guān)基因，并富集相關(guān)基因，挖掘STAT3、Grim19的臨床價值與潛在的功能、機制，為進一步研究二者在卵巢癌疾病中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 STAT3、Grim19生物信息學分析

1.1.1 獲取STAT3、Grim19的基本信息 利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UCSC(http：//genome.ucsc.edu/)、UniProt(https：//www.uniprot.org/)等在線數(shù)據(jù)庫，檢索STAT3、Grim19的序列號、染色體定位等基本信息。

1.1.2 PubMed檢索STAT3、Grim19相關(guān)文獻 在PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)數(shù)據(jù)庫中查找已發(fā)表相關(guān)文獻，分別以STAT3、Grim19作為關(guān)鍵詞檢索，仔細閱讀并篩選與STAT3、Grim19相關(guān)的研究文獻。

1.1.3 GEPIA在線工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫卵巢癌臨床病例中STAT3、Grim19蛋白之間相關(guān)性 利用GEPIA軟件(http：//gepia2.cancer-pku.cn/)檢索TCGA數(shù)據(jù)庫426例卵巢癌的資料信息，采用Pearson檢驗分析STAT3、Grim19在卵巢癌中表達的相關(guān)性，檢驗標準為P<0.05[9]。

1.1.4 臨床病例數(shù)據(jù)來源及生存分析 使用LinkedOmics在線軟件(http：//www.linkedomics.org/login.php/)[10]下載卵巢癌mRNA的TCGA數(shù)據(jù)集，篩選出包含STAT3表達量的臨床病例294例，按照STAT3表達水平由高到低排列，將表達水平位于前50%的病例作為高表達組(n=147)，后50%作為低表達組(n=147)，應用SPSS 26繪制Kaplan-Meier生存曲線；篩選包含Grim19表達量的臨床病例549例，將表達水平前50%病例作為高表達組(n=275)，后50%作為低表達組(n=274)，應用SPSS 26繪制繪制Kaplan-Meier生存曲線，檢驗標準為P<0.05。

1.1.5 STAT3、Grim19相關(guān)基因篩選 使用LinkedOmics在線工具(http：//www.linkedomics.org/login.php)下載包含STAT3、Grim19表達水平的基因芯片卵巢癌數(shù)據(jù)集，共檢測基因6426個，使用Spearman相關(guān)分析進行篩選，檢驗標準為P<0.05，利用LinkedOmics在線軟件分別選取正負相關(guān)基因各50個，繪制火山圖[10]。

1.1.6 STAT3、Grim19的GO分析和KEGG分析將篩選出與STAT3、Grim19相關(guān)的基因，按照相關(guān)系數(shù)絕對值排列，取與STAT3關(guān)系最強基因136個，與Grim19關(guān)系最強基因124個，轉(zhuǎn)換基因名稱，利用Omicshare(https：//www.omicshare.com/tools/)在線軟件，進行GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集分析，選取標準為P<0.05。

1.2 免疫組化法檢測STAT3、Grim19表達水平及預后分析

收集2013年1月～2017年12月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者組織標本115例，患者平均年齡為(55.44±1.02)歲。所有患者經(jīng)術(shù)中冰凍切片及術(shù)后病理確診為上皮性卵巢癌，WHO組織學分型以漿液性囊腺癌為主，F(xiàn)IGO分期為Ⅰ～Ⅳ期，治療方式分為PDS+化療和NACT+IDS。所取標本均經(jīng)病理學確診且擁有完整病歷資料，并獲患者知情同意及獲廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。免疫組化試劑盒購于CST公司(美國)，STAT3、Grim19抗體購于Abcam公司(英國)，按照免疫組化試劑盒操作流程測定STAT3、Grim19在上皮性卵巢癌中的表達，采用Image J進行定量分析，采用SPSS 26進行生存分析，生存曲線采用Kaplan-Meier分析法，使用Log-rank檢驗進行比較，采用Cox模型進行多變量分析，判定影響預后的獨立危險因素，選取標準為P<0.05。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26進行統(tǒng)計學分析，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗、Spearman檢驗；生存曲線采用Kaplan-Meier分析法，多變量分析采用Cox模型，選取標準為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 STAT3、Grim19的生物信息學分析結(jié)果

2.1.1 STAT3、Grim19的基本信息 通過檢索NCBI、UCSC、UniProt等在線數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)STAT3序列號為NC_000017.11，定位于染色體17q21.2區(qū)域中的一個簇內(nèi)，其成熟基因位點在Chr17：42，313，324-42，388，502；Grim19又稱NDUFA13，序列號為NC_000019.10，定位于染色體19p13.11區(qū)域中的一個簇內(nèi)，其成熟基因位點在Chr19：19，516，225-19，528，198(表1)。

表1 STAT3、Grim19的基本信息Table 1 Basic information of STAT3 and Grim19

2.1.2 STAT3及Grim19參與的疾病調(diào)控 通過PubMed檢索STAT3、Grim19相關(guān)文獻[11-50]發(fā)現(xiàn)：STAT3的表達具有組織特異性，STAT3在乳腺癌[11-12]、宮頸癌[13-14]、肺癌[15-16]、卵巢癌[17-18]、胃癌[19-20]、頭頸部鱗狀細胞癌[21-22]、前列腺癌[23，47]、結(jié)直腸癌[24-25]、膀胱癌[26-27]、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤[28-30]、阿爾茨海默病[31]、慢性淋巴細胞白血病[32]等疾病中表達上調(diào)，經(jīng)由JAK/STAT3、IL-6/STAT3、PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、NF-κB/Bcl-2等信號通路參與細胞凋亡、遷移、增殖、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、腫瘤干細胞生成、炎癥反應、腫瘤微環(huán)境、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多種生物學過程，見表2。Grim19在乳腺癌[33]、宮頸癌[34]、肺癌[35]、肝癌[36-37]、膀胱癌[38]、腎癌[39]、結(jié)直腸癌[40]、甲狀腺癌[41-42]、皮膚鱗狀細胞癌[43]、子宮腺肌癥[44]、原因不明反復流產(chǎn)[45]、弱精子癥[46]等疾病中表達下調(diào)，主要與STAT3相互作用參與細胞凋亡、遷移、增殖、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等生物學過程，見表3。

表2 Pubmed檢索STAT3參與調(diào)控的疾病與相關(guān)信息Table 2 Diseases regulated by STATS signaling pathway from PubMed searches

表3 Pubmed檢索Grim19參與調(diào)控的疾病與相關(guān)信息Table 3 Diseases regulated by Grim19 signaling pathway from PubMed searches

2.1.3 STAT3、Grim19蛋白表達的相關(guān)性分析 利用GEIPA在線工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫426例卵巢癌臨床病例，結(jié)果顯示STAT3、Grim19蛋白表達在卵巢癌中存在負相關(guān)關(guān)系，即Grim19隨著STAT3表達的升高而降低，r=-0.29，P<0.05(圖1)。

圖1 STAT3、Grim19表達的相關(guān)性分析Fig.1 The correlation analysis of expression of STAT3 and Grim19

2.1.4 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析STAT3、Grim19表達水平對臨床病例預后的影響 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析顯示：在294例卵巢癌患者中，STAT3高表達組的中位生存時間與低表達組無明顯差異(P>0.05)；在549例卵巢癌患者中，Grim19高表達組的中位生存時間大于低表達組(P<0.05)，Grim19表達水平對患者的預后有影響(圖2)。

2.1.5 STAT3、Grim19相關(guān)基因篩選結(jié)果 在294例表達STAT3的基因芯片臨床數(shù)據(jù)集中，2785個基因與STAT3具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與STAT3呈正、負相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較高的50個基因依次為DNAAF2、SLC34A2、FAM134C、UNQ6490、TOM1等，其中與STAT3相關(guān)性系數(shù)最高(rs=-0.42，P<0.05)的基因為裝配因子2(the dynein axonemal assembly factor 2，DNAAF2)，又名C14orf104，是一種蛋白激酶，參與軸突動力蛋白裝配，在纖毛和鞭毛運動中起核心作用。在594例表達Grim19的基因芯片數(shù)據(jù)集中，4960個基因與Grim19具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Grim19呈正、負相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較高的50個基因依次為NDUFB7、MRPL34、C19orf14、MGC3194、P117等，其中與Grim19相關(guān)性系數(shù)最高(rs=0.75，P<0.01)的基因為NADH脫氫酶1β復合體亞基7(NADH：ubiquinone oxidoreductase subunit B7，NDUFB7)，NDUFB7是線粒體復合體Ⅰ的輔助亞基，在線粒體氧化呼吸鏈電子傳遞中起重要作用(圖3)。

A：STAT3高表達組與低表達組對患者遠期生存的影響；B：Grim19高表達組與低表達組對患者遠期生存的影響圖2 TCGA臨床病例STAT3、Grim19表達水平對患者預后的影響Fig.2 Effect of expression levels of STAT3 and Grim19 on the prognosis based on TCGA database

A：STAT3相關(guān)基因火山圖；B：Grim19相關(guān)基因火山圖圖3 STAT3、Grim19的相關(guān)基因火山圖Fig.3 The related gene heatmaps of STAT3 and Grim19

2.1.6 STAT3、Grim19的GO分析和KEGG分析GO功能注釋富集分析結(jié)果顯示，STAT3主要涉及的生物學學過程(biological process)為細胞過程、單一生物過程、代謝過程、刺激反應等；主要涉及的分子功能(molecular function)為結(jié)合、催化活性、信號轉(zhuǎn)導活性等；主要涉及的細胞組分(cellular component)為細胞質(zhì)、細胞膜和細胞器等。Grim19主要涉及的生物學過程為細胞過程、代謝過程、細胞組分組織或合成等；主要涉及的分子功能為結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性等；主要涉及的細胞組分為細胞質(zhì)和細胞器等(圖4)。

KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，STAT3信號通路主要參與的細胞過程為運輸和分解代謝，作用的機體系統(tǒng)為免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，涉及信號轉(zhuǎn)導，在傳染病和惡性腫瘤中作用明顯；KEGG信號通路富集發(fā)現(xiàn)STAT3主要作用在肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、補體途徑、白細胞跨內(nèi)皮遷移等信號通路中。Grim19信號通路在神經(jīng)退行性疾病、內(nèi)分泌和新陳代謝疾病、惡性腫瘤中作用明顯，參與多種生物代謝過程，如能量代謝、核苷酸代謝等，作用的機體系統(tǒng)多為環(huán)境適應和神經(jīng)系統(tǒng)，在遺傳信息處理中發(fā)揮重要作用；KEGG信號通路富集發(fā)現(xiàn)Grim19主要作用在亨廷頓病、氧化磷酸化、帕金森綜合征、非酒精性脂肪肝病等信號通路中(圖5)。

A：STAT3相關(guān)基因GO功能注釋中關(guān)聯(lián)性最強的20個功能；B：Grim19相關(guān)基因GO功能注釋中關(guān)聯(lián)性最強的20個功能圖4 STAT3、Grim19相關(guān)基因GO功能注釋Fig.4 The GO term of STAT3 and Grim19 genes

2.2 免疫組化法檢測臨床樣本中STAT3、Grim19的表達水平及預后分析

將免疫組化測得的115例上皮性卵巢癌樣本STAT3、Grim19表達水平按照從低到高排列，位于前50%的患者為低表達組(58例)，余為高表達組(57例)。低表達組平均STAT3水平為(56.20±9.65)，高表達組為(78.85±6.15)；平均Grim19表達水平，低表達組為(8.37±3.23)，高表達組為(18.88±3.97)。STAT3、Grim19高表達組的中位生存時間與低表達組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖6。

A：STAT3表達水平對患者遠期生存的影響；B：Grim19表達水平對患者遠期生存的影響圖6 115例上皮性卵巢癌患者STAT3、Grim19表達水平對患者遠期生存的影響Fig.6 Effect of STAT3 and Grim19 expression levels on overall survival rate of 115 patients with epithelial ovarian cancer

采用Cox比例風險模型分析115例上皮性卵巢癌組織標本STAT3、Grim19的表達水平及臨床病理參數(shù)(年齡、FIGO分期、WHO組織學分型、治療方式)與預后之間的相關(guān)性，以評估影響上皮性卵巢癌患者預后的獨立危險因素。結(jié)果表明，年齡可能是影響預后的獨立危險因素，P<0.05，HR=0.348，95%可信區(qū)間為(0.171，0.706)。

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及對患者預后的影響與細胞內(nèi)異常的信號轉(zhuǎn)導緊密相關(guān)，而與炎癥反應、腫瘤細胞凋亡的抑制、腫瘤微環(huán)境等生物過程相關(guān)的信號通路是影響腫瘤進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同信號通路交織成網(wǎng)，受多種靶點影響[51-52]。STAT3作為多種信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)調(diào)控著機體的生物學過程，本研究通過對PubMed數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，STAT3在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中普遍上調(diào)，經(jīng)由JAK/STAT3信號通路過度激活，形成磷酸二聚體轉(zhuǎn)入核內(nèi)對靶基因進行調(diào)節(jié)，發(fā)揮腫瘤細胞凋亡抑制作用[53]。STAT3經(jīng)由IL-6/STAT3、PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、NF-κB/Bcl-2等信號通路影響惡性腫瘤的進展，參與遷移、增殖、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、腫瘤干細胞生成、炎癥反應、腫瘤微環(huán)境、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多種生物學過程。靶向STAT3的抑制劑在延緩腫瘤進程和增強化療敏感性中作用的部分發(fā)現(xiàn)為進一步探索STAT3在臨床治療上的應用提供了依據(jù)[54]。

Grim19(NDUFA13)是一種新型的癌癥抑制基因，參與線粒體氧化代謝并特異性作用于STAT3[8，55]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Grim19在上皮性卵巢癌中表達明顯低于對照卵巢組織，STAT3在上皮性卵巢癌中表達明顯高于對照卵巢組織，且二者呈負相關(guān)。本研究采用GEPIA在線分析工具分析所得的STAT3、Grim19在卵巢漿液性囊腺癌臨床病例中的表達呈負相關(guān)的結(jié)果與之一致，進一步證實STAT3、Grim19之間的特異性互作關(guān)系。同時，本研究檢索PubMed數(shù)據(jù)庫顯示，Grim19在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中特異性低表達，主要經(jīng)由Grim19/STAT3信號通路參與腫瘤細胞凋亡、遷移、增殖、侵襲等生物學過程。

為進一步明確STAT3、Grim19的功能，采用Omicshare在線軟件對篩選出的相關(guān)基因進行GO功能注釋富集分析和KEGG通路富集分析，顯示STAT3涉及多種功能如免疫系統(tǒng)過程、生物粘附、細胞粘附、細胞增殖，且STAT3主要位于細胞質(zhì)中，在細胞膜上也表達，這與其的信號轉(zhuǎn)導機制相符合。Grim19涉及功能最強的為線粒體ATP合成耦合電子輸運，這符合其作為線粒體復合物Ⅰ輔助亞基的特性。相關(guān)基因的富集分析結(jié)果為深入研究STAT3、Grim19的機制奠定了一定理論基礎(chǔ)。

基于TCGA數(shù)據(jù)庫研究STAT3、Grim19表達水平對臨床病例預后的影響，發(fā)現(xiàn)STAT3表達水平對卵巢漿液性囊腺癌的遠期生存率無明顯影響，而高表達Grim19的患者遠期生存率明顯優(yōu)于低表達Grim19的患者，提示Grim19對卵巢癌患者生存的臨床價值。研究本院上皮性卵巢癌臨床樣本中兩蛋白表達水平對卵巢癌預后的影響發(fā)現(xiàn)，STAT3、Grim19表達水平與患者遠期生存率無明顯相關(guān)，與基于TCGA的研究結(jié)果不一致。分析造成TCGA數(shù)據(jù)庫生存分析結(jié)果與本課題組研究病例生存分析結(jié)果不一致的原因可能為部分病例資料觀察時間較短，存在結(jié)尾數(shù)據(jù)較多。

綜上所述，在多種惡性腫瘤中存在STAT3、Grim19特異性表達，STAT3表達上調(diào)，Grim19表達下調(diào)，二者呈負相關(guān)，且經(jīng)由多種信號通路影響惡性腫瘤進展；Grim19經(jīng)由STAT3調(diào)控卵巢疾病進展，有望成為評價卵巢癌預后的指標；STAT3在各種生物過程中的重要作用，為卵巢癌靶向治療提供了可能。