茶樹CsWRKYIIcs轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析

肖羅丹，唐磊，王偉東，高岳芳，黃伊凡，孟陽，楊亞軍,2，肖斌

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008）

0 引言

【研究意義】茶樹（Camellia sinensis（L.）O.kuntze）起源于我國西南地區(qū)，是一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物[1]。全國的茶樹種植分為四大茶區(qū)，跨度大、范圍廣，茶樹在生長過程中易遭受高溫、高鹽、干旱等非生物脅迫的傷害，如干旱脅迫使茶樹葉片脫水變枯，導(dǎo)致茶氨酸、兒茶素等含量減少，嚴(yán)重影響其品質(zhì)成分的積累，降低經(jīng)濟(jì)效益[2]。因此，鑒定出茶樹中的抗性基因，對(duì)利用分子育種技術(shù)定向篩選和培育抗性品種有重要研究價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】WRKY是植物重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域得名。根據(jù)不同數(shù)量的WRKY結(jié)構(gòu)域和不同類型的鋅指結(jié)構(gòu)將WRKY分成I、II、III家族，I家族有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）型鋅指結(jié)構(gòu)；II家族有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域及與I家族相同的鋅指結(jié)構(gòu)類型；III家族有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，且含與I、II家族不同的C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）型鋅指結(jié)構(gòu)。依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析和氨基酸序列差異，II家族可進(jìn)一步分為IIa—e等5個(gè)亞家族，其中IIc亞家族具有1個(gè)高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和C-X4-C-X22-23-H-X-H型鋅配體[3-5]。近年來，大量研究表明，植物中不同WRKY家族成員受病菌、干旱、高鹽、高溫和外源激素等誘導(dǎo)表達(dá)，參與多種植物對(duì)生物或非生物脅迫的抗性[6-10]，其中IIc亞家族成員也參與對(duì)多種脅迫的響應(yīng)過程，如擬南芥AtWRKY8、AtWRKY48、AtWRKY50、AtWRKY51和AtWRKY57對(duì)茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)通路有應(yīng)答作用[11]，棉花GhWRKY33、GhWRKY39、GhWRKY93、GhWRKY110和GhWRKY114參與低溫、鹽堿、干旱、外源脫落酸（ABA）等非生物脅迫的響應(yīng)[12]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，茶樹中的WRKY基因家族已有報(bào)道[13-15]，研究了不同WRKY的功能[16-22]，表明WRKY與茶樹的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。茶樹的WRKY家族基因眾多，筆者課題組通過對(duì)茶樹高鹽、干旱和高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)IIc亞家族基因差異表達(dá)，推測其在茶樹響應(yīng)非生物脅迫的過程中具有重要作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫（http://tpia.teaplant.org/）中注釋的WRKY序列設(shè)計(jì)特異性引物，從‘陜茶1號(hào)’茶樹中克隆CsWRKYIIcs的cDNA序列，并進(jìn)行一系列的生物信息學(xué)分析，探究不同組織和脅迫下的表達(dá)模式，驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄活性，為后續(xù)深入研究抗逆機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018—2019年在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院茶學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 植物材料、生長條件和脅迫處理

2018年6月底于人工氣候室對(duì)‘陜茶1號(hào)’一年生扦插苗進(jìn)行水培預(yù)培養(yǎng)，生長條件：晝夜溫度25℃/20℃，相對(duì)濕度70%—80%，光強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1，光周期為晝夜12 h/12 h。8月底時(shí)茶苗生長狀況良好且萌發(fā)出新芽，選取生長勢(shì)一致的健壯茶苗隨機(jī)分成4組，每組30株，分別置于4個(gè)水培箱中進(jìn)行高鹽、模擬干旱、高溫及外源脫落酸脅迫處理。高鹽處理：將茶苗的根部全部浸入含200 mmol·L-1NaCl的溶液中；模擬干旱處理：將茶苗的根部全部浸入含20%PEG 6000的溶液中；高溫處理：茶苗置于40℃的人工氣候室；外源脫落酸處理：將ABA（少量95%乙醇溶解）溶于蒸餾水配制成100 μmol·L-1的溶液，均勻噴施于茶苗葉片。每個(gè)處理在0、1、2、4、8、12、24和48 h時(shí)取不同株的芽下二至三葉3—5片混勻分成3份，液氮速凍于-80℃冰箱備用。另從多株未處理的茶苗中，取初開的花朵、未木質(zhì)化的嫩莖、嫩根和頂芽下第二葉各0.1 g用于組織表達(dá)分析，材料液氮速凍于-80℃冰箱保存[23-24]。

1.2 茶樹CsWRKYIIcs的克隆

基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫（http://tpia.teaplant.org/）中注釋的WRKY序列，以擬南芥IIc亞家族（https://www.arabidopsis.org/）的序列作為查詢序列，經(jīng)本地BLAST檢索及冗余性檢查后，獲得9個(gè)CsWRKYIIcs亞家族基因。利用在線IDT網(wǎng)站（https://sg.idtdna.com/calc/analyzer）從基因序列起始密碼子前和終止密碼子后的非編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以‘陜茶1號(hào)’葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 70 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。將膠回收得到的PCR產(chǎn)物連接至pMD-19T克隆載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

在ORF finder網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）分析開放閱讀框。利用ExPASy網(wǎng)站（https://web.expasy.org/）分析理化性質(zhì)。在WOLF PSORT網(wǎng)站（https://wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，并利用cNLS Mapper網(wǎng)站（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）進(jìn)行核定位信號(hào)預(yù)測。利用Meme suite 5.0.5（http://memesuite.org/）在線預(yù)測motif基序。DNAMAN 6.0.3.99進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并用WebLogo（http://weblogo）生成保守域序列l(wèi)ogo圖。利用MEGA7軟件中鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000，并 利 用EvolView（http://120.202.110.254:8280/evolview/）修飾進(jìn)化樹。利用GSDS2.0網(wǎng)站構(gòu)建外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）。截取基因ATG上游約2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測順式作用元件。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析

采用CTAB法[24]提取茶樹不同組織及脅迫處理的總RNA，保存于-80℃?zhèn)溆?。?×All-In-One RT Master Mix試劑盒（abm，加拿大）合成cDNA第一鏈作為模板，茶樹基因CsActin作為內(nèi)參[16]，設(shè)計(jì)9個(gè)CsWRKYIIcs的定量引物（表1），按照Eva Green 2×qPCR Master Mix-ROX試劑盒（abm，加拿大）使用說明在QuantStudio?5熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 70 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)[25]，用SPSS 26統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.0.1作圖。

1.5 轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證

利用NovoRec? Plus PCR一步定向克隆試劑盒（Novoprotein，中國）分別將9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs的cDNA序列融合至pGBKT7表達(dá)載體上的GAL4 DNA結(jié)合域，引物見表1，構(gòu)建pGBKT7-CsWRKYIIcs重組表達(dá)載體。通過PEG/LiAc法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，在SD/-Trp缺陷固體培養(yǎng)基上30℃倒置培養(yǎng)3—5 d，觀察酵母菌落生長情況。挑取單菌落接種于SD/-Trp缺陷液體培養(yǎng)基中，在30℃下250 r/min振蕩培養(yǎng)約24 h，取3 μL點(diǎn)在SD/-Ade/-His及含X-α-gal的SD/-Ade/-His缺陷固體培養(yǎng)基上，于30℃倒置培養(yǎng)3—5 d，根據(jù)菌落生長情況及是否變藍(lán)來驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄活性。以pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽性對(duì)照，pGBKT7作為陰性對(duì)照[17,19]。

2 結(jié)果

2.1 茶樹CsWRKYIIcs的克隆及理化性質(zhì)分析

以‘陜茶1號(hào)’cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到9條大小在500—1 000 bp不等的特異性條帶（圖1），將其純化后分別連接到pMD-19T克隆載體，挑取陽性單克隆測序，獲得9條CsWRKYIIcs的cDNA序列，依次命名為CsWRKYIIc1—CsWRKYIIc9，用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

理化性質(zhì)分析表明，9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs的開放閱讀框長度分別為561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp，分別編碼186、319、311、325、298、303、239、335、322個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為21.098（CsWRKYIIc1）—36.952kD（CsWRKYIIc8）。CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc4、CsWRKYIIc7的理論等電點(diǎn)大于7.0，是堿性蛋白；而CsWRKYIIc2、CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc5、CsWRKYIIc6、CsWRKYIIc8、CsWRKYIIc9的理論等電點(diǎn)小于7.0，是酸性蛋白。平均疏水性指標(biāo)均為負(fù)值，說明它們是親水性蛋白。另外，核定位值區(qū)間及亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示9個(gè)基因均定位于細(xì)胞核（表2）。

表1 克隆、熒光定量和構(gòu)建酵母載體引物Table 1 Primers of cloning, qRT-PCR and constructing yeast vectors

圖1 CsWRKYIIcs的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of CsWRKYIIcs

表2 CsWRKYIIcs的理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical analysis of CsWRKYIIcs

2.2 CsWRKYIIcs的序列比對(duì)分析

9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示（圖2-A），9個(gè)蛋白均具有一段高度保守的WRKYGQK序列，CsWRKYIIc7的C2H2型鋅指基序缺少“H-X-H”在內(nèi)的部分氨基酸殘基，其他蛋白均具有完整的C-X4-C-X23-H-X-H型鋅配體。此外，WebLogo分析WRKYGQK序列及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)出現(xiàn)頻率高（圖2-B），進(jìn)一步驗(yàn)證了WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)的高度保守性。

2.3 進(jìn)化樹及保守基序分析

9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs亞家族成員與擬南芥AtWRKY家族成員（https://www.arabidopsis.org/）系統(tǒng)進(jìn)化樹分析見圖3，茶樹CsWRKYIIcs與擬南芥IIc亞家族成員聚集，除CsWRKYIIc1外，其他茶樹成員兩兩成對(duì)，說明9個(gè)CsWRKYIIcs均屬于IIc亞家族，并且在茶樹中可能發(fā)生了復(fù)制。

圖2 CsWRKYIIcs的氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 Amino acid sequence alignment of CsWRKYIIcs

圖3 CsWRKYIIcs和AtWRKYs的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CsWRKYIIcs and AtWRKYs

9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs與水稻（7條）、玉米（3條）、葡萄（8條）和擬南芥（12條）等不同物種的WRKYIIcs亞家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示（圖4-A），39個(gè)成員被分為4個(gè)組，每組都包含茶樹的CsWRKYIIcs亞家族成員。其中CsWRKYIIc8和CsWRKYIIc9與VvWRKY33和VvWRKY37關(guān)系更近；CsWRKYIIc2與VvWRKY16親緣關(guān)系最近，并與CsWRKYIIc3及成對(duì)的CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7聚類；CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6與VvWRKY1和AtWRKY57關(guān)系更近；CsWRKYIIc1與VvWRKY3關(guān)系最近。另外，不同物種中的WRKYIIc亞家族成員有相似的保守基序（圖4-B）。motif1出現(xiàn)在39個(gè)WRKYIIcs亞家族成員中；除了茶樹CsWRKYIIc7外，其他38個(gè)成員均擁有motif2；4個(gè)組中都出現(xiàn)motif3和motif5，第1組、2組、3組中均含motif4。此外，同組成員擁有更多相同基序，如motif6和motif9只出現(xiàn)在第2組。而有的基序只出現(xiàn)在某一組中，如motif7只存在第1組，motif10出現(xiàn)在第3組，motif8只出現(xiàn)在第4組，說明WRKYIIcs在進(jìn)化過程中不同組成員的保守基序有一定的差異。

2.4 CsWRKYIIcs的結(jié)構(gòu)分析

9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs亞家族成員分為4個(gè)組（圖5-A）。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析顯示9個(gè)基因的編碼區(qū)包含1—2個(gè)內(nèi)含子和2—3個(gè)外顯子（圖5-B），表明它們?cè)谶M(jìn)化過程中可能行使相似的功能。

2.5 順式作用元件預(yù)測

9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs的啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測到多個(gè)與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件（表3），它們重復(fù)出現(xiàn)在一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，可能影響CsWRKYIIcs對(duì)不同非生物脅迫的應(yīng)答。值得探討的是，每個(gè)啟動(dòng)子序列中高頻出現(xiàn)響應(yīng)脫落酸的作用元件ABRE及受干旱誘導(dǎo)的作用元件MYB，在多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域頻繁出現(xiàn)與干旱脅迫相關(guān)的作用元件MBS和MYC，由此推測9個(gè)CsWRKYIIcs可能與干旱脅迫密切相關(guān)。

2.6 CsWRKYIIcs的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果顯示（圖6），CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc8和CsWRKYIIc9在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，根中次之，在莖和葉中的表達(dá)量最低；而CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7在根中表達(dá)量顯著，花中次之，在莖和葉中的表達(dá)量相對(duì)較低；CsWRKYIIc5在根中的表達(dá)量最高，莖中次之，在葉和花中相對(duì)較低；CsWRKYIIc6在根中的表達(dá)顯著高于莖、葉和花。這9個(gè)CsWRKYIIcs在根和花中的表達(dá)量明顯高于莖和葉，表明其組織表達(dá)存在差異。

圖4 不同物種WRKYIIcs的進(jìn)化樹和保守基序分析Fig.4 Analysis of phylogenetic tree and motifs of WRKYIIcs from different species

圖5 CsWRKYIIcs的結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Structure analysis of CsWRKYIIcs

圖6 CsWRKYIIcs在不同組織中的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of CsWRKYIIcs in different tissues

表3 順式作用元件預(yù)測Table.3 Cis-elements prediction

圖7 CsWRKYIIcs在干旱脅迫下的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of CsWRKYIIcs under drought stress

在干旱、ABA、高鹽、高溫等不同脅迫處理下，CsWRKYIIcs主要呈不同的表達(dá)模式。干旱脅迫下，不同CsWRKYIIcs被階段性誘導(dǎo)（圖7），CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6的表達(dá)量先升高后降低，在8 h時(shí)達(dá)到峰值，達(dá)0 h的8倍和10倍；其他基因在1—4 h受干旱影響較小，僅有CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc3和CsWRKYIIc7在1 h明顯上調(diào)；而8—48 h時(shí)間段總體表達(dá)水平高于前期，其中CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3均顯著上調(diào)，CsWRKYIIc1在48 h的表達(dá)量為對(duì)照的36倍。在ABA誘導(dǎo)下，CsWRKYIIcs均強(qiáng)烈地上調(diào)表達(dá)（圖8），除CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7稍顯遲緩?fù)?，其他基因均能? h時(shí)快速作出反應(yīng)，在隨后時(shí)間段也有較高表達(dá)水平，其中CsWRKYIIc1在48 h表達(dá)量最高，達(dá)處理前的60倍以上，CsWRKYIIc7在4和24 h均達(dá)對(duì)照的70倍。在鹽處理下，不同CsWRKYIIcs的表達(dá)水平不等（圖9），CsWRKYIIc1僅在4和48 h時(shí)被顯著誘導(dǎo)；CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6、CsWRKYIIc8于1—8 h變化較小，在12 h后表達(dá)量顯著增加；而CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7在24 h表達(dá)量達(dá)最高，其中CsWRKYIIc7表達(dá)量為處理前200倍。CsWRKYIIc9分別在2、12和48 h上調(diào)顯著，表達(dá)量最高可達(dá)處理前的400倍。高溫脅迫下CsWRKYIIcs的表達(dá)也存在差異（圖10），CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3在處理前期無顯著變化，分別在12和8 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，后期表達(dá)量小幅度下降；CsWRKYIIc5在各階段上調(diào)表達(dá)，除2和8 h外；CsWRKYIIc6僅在24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)；CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7、CsWRKYIIc9均在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，特別是CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可達(dá)對(duì)照的100倍；而CsWRKYIIc8在高溫下的表達(dá)受到強(qiáng)烈的抑制。這些結(jié)果表明，CsWRKYIIcs能快速應(yīng)答ABA信號(hào)，不同程度地響應(yīng)干旱、高鹽、高溫脅迫，高鹽脅迫下相對(duì)表達(dá)水平高于干旱、高溫脅迫，表明其可能對(duì)鹽脅迫有更高的敏感性。其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7表達(dá)量更顯著，可能參與了茶樹對(duì)這些脅迫的抗逆反應(yīng)。

圖8 CsWRKYIIcs在ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of CsWRKYIIcs under ABA-induced

圖9 CsWRKYIIcs在鹽脅迫下的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of CsWRKYIIcs under NaCl stress

圖10 CsWRKYIIcs在高溫脅迫下的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of CsWRKYIIcs under heat stress

2.7 轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)結(jié)果

利用酵母試驗(yàn)研究CsWRKYIIcs蛋白的轉(zhuǎn)錄活性（圖11），所有重組表達(dá)載體、陽性對(duì)照及陰性對(duì)照均能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長；所有重組表達(dá)載體及陽性對(duì)照在SD/-Ade/-His培養(yǎng)基上正常生長，而陰性對(duì)照生長受抑制；在加入X-α-gal的培養(yǎng)基上，陰性對(duì)照長勢(shì)微弱且無變藍(lán)，但所有重組表達(dá)載體及陽性對(duì)照菌斑均呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)色，表明9個(gè)茶樹CsWRKYIIcs重組蛋白都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖11 CsWRKYIIcs的轉(zhuǎn)錄活性分析Fig.11 Transcription activity analysis of CsWRKYIIcs

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、防御調(diào)控和脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。有研究表明植物經(jīng)常發(fā)生鋅指結(jié)構(gòu)丟失事件，如菠蘿的AcWRKY23和‘鐵觀音’的CsWRKY39均出現(xiàn)鋅指結(jié)構(gòu)缺失[20,26]，本研究也發(fā)現(xiàn)CsWRKYIIc7缺少鋅指殘基，推測缺失可能導(dǎo)致其功能差異，還需要進(jìn)一步研究?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示9個(gè)CsWRKYIIcs含有1—2個(gè)內(nèi)含子和2—3個(gè)外顯子，蘋果MdWRKYIIcs亞家族成員也有類似現(xiàn)象[27]，說明它們結(jié)構(gòu)組成之間密切聯(lián)系，可能有相似作用。

大量研究表明植物中不同WRKY的組織表達(dá)具有特異性，例如，玉米ZmWRKY58在根中表達(dá)較強(qiáng)[28]，陸地棉GhWRKY42主要在莖中表達(dá)[29]，菊花CmWRKY40在葉片中表達(dá)量最高[30]。本研究中‘陜茶1號(hào)’CsWRKYIIcs在不同組織中的表達(dá)也有一定差異，根和花中的表達(dá)量顯著高于莖和葉，推測其可能在茶樹的根和花中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。前人研究證實(shí)不同茶樹品種間的WRKY存在較大差異[14]，如‘龍井43號(hào)’的CsWRKY3在根中表達(dá)最強(qiáng)[18]，CsWRKY7在老葉和根中都優(yōu)勢(shì)表達(dá)[22]，‘鐵觀音’的CsWRKY48在根和莖中的表達(dá)強(qiáng)于葉和花，而CsWRKY6和CsWRKY31分別在老葉和花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[21]，意味著不同的茶樹品種和生長環(huán)境可能導(dǎo)致WRKY在不同組織中的表達(dá)差異。

近年來，眾多研究表明植物的WRKY參與響應(yīng)多種非生物脅迫[31-33]，本研究結(jié)果也說明CsWRKYIIcs與茶樹的逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。在干旱脅迫下，CsWRKYIIcs被階段性誘導(dǎo)表達(dá)，與菊花[30]等植物有類似的表達(dá)模式，說明它們參與干旱脅迫的響應(yīng)。前人證實(shí)激活A(yù)tWRKY57表達(dá)可上調(diào)ABA3和NCED3，提高ABA水平增強(qiáng)擬南芥的抗旱性[34]。CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6受干旱脅迫于8 h時(shí)達(dá)對(duì)照的8倍和10倍，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明其與AtWRKY57親緣關(guān)系相近，推測其可能具有相似的生物學(xué)功能。前人研究表明WRKY是ABA信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因，如CsWRKY2通過參與到ABA下游信號(hào)途徑中響應(yīng)干旱脅迫[16]；過表達(dá)GmWRKY16誘導(dǎo)體內(nèi)ABA合成并調(diào)控脅迫相關(guān)基因表達(dá)從而提高植株的抗性[35]等。本研究結(jié)果顯示ABA誘導(dǎo)下所有CsWRKYIIcs均上調(diào)表達(dá)，且反應(yīng)迅速，這可能與其表達(dá)快速而瞬時(shí)的特點(diǎn)相關(guān)[36]。其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7表達(dá)量高于其他CsWRKYIIcs，預(yù)示著它們可能在ABA信號(hào)調(diào)控途徑中起關(guān)鍵作用。另一方面，從啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測到多個(gè)響應(yīng)ABA和干旱脅迫的順式作用元件，推測CsWRKYIIcs可能通過ABA信號(hào)途徑參與茶樹的抗旱調(diào)控，將是下一步研究重點(diǎn)。

在鹽脅迫下，CsWRKYIIcs被不同程度地誘導(dǎo)，與前人分析結(jié)果一致[15]，表明其參與了茶樹對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。有研究證實(shí)過量表達(dá)ZmWRKY17調(diào)節(jié)ABA和脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，降低植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[37]。而ZHU等[38]證實(shí)葡萄VvWRKY30受鹽脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并通過活性氧清除和滲透壓積累增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。本研究中CsWRKYIIcs被鹽脅迫誘導(dǎo)較高水平表達(dá)，尤其是CsWRKYIIc7和CsWRKYIIc9可分別達(dá)對(duì)照的200和400倍，因此推測其可能在茶樹抗鹽反應(yīng)中扮演重要角色。另外，WU等[13]分析表明不同茶樹品種的WRKY受溫度誘導(dǎo)存在差異，但又表現(xiàn)出群體一致性。本試驗(yàn)中CsWRKYIIcs的表達(dá)沒有出現(xiàn)規(guī)律性的上調(diào)或下調(diào)，其中CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc2、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7、CsWRKYIIc9表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值，尤其是CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可達(dá)100倍，可能與ZmWRKY106和OsWRKY11具有相似的功能，即正向調(diào)控植物對(duì)高溫脅迫的耐受性[9,39]。而CsWRKYIIc8被強(qiáng)烈地抑制，與茶樹CsWRKY7和菊花多個(gè)CmWRKYs的表達(dá)趨勢(shì)一致[22,30]，可能在高溫脅迫中起負(fù)調(diào)控作用。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)組內(nèi)基因之間有相似的表達(dá)趨勢(shì)，如干旱脅迫下的CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6，鹽處理下的CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7，高溫脅迫下的CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7等，推測它們?cè)谀婢持锌赡苡邢嗨频捻憫?yīng)機(jī)制，但還需進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。

另一個(gè)方面，WRKY是植物重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，它的一個(gè)基本特征是具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可以通過激活下游基因的表達(dá)參與調(diào)控作用[40-41]。因此，本文通過酵母試驗(yàn)驗(yàn)證茶樹CsWRKYIIcs的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示9個(gè)pGBKT7-CsWRKYIIcs重組表達(dá)載體在含X-α-gal的缺陷培養(yǎng)基上呈藍(lán)色，表明它們都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。前人報(bào)道茶樹中不同CsWRKYs定位于細(xì)胞核內(nèi)[16,19,22]，本研究根據(jù)CsWRKYIIcs的核定位預(yù)測值和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果，推測它們是定位于細(xì)胞核的調(diào)控蛋白。另外，研究表明WRKY的N端是表現(xiàn)活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[38,42]，因此，可進(jìn)一步驗(yàn)證CsWRKYIIcs序列的活性部位，為后續(xù)試驗(yàn)提供一定理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從‘陜茶1號(hào)’中克隆獲得9個(gè)CsWRKYIIcs轉(zhuǎn)錄因子，除CsWRKYIIc7鋅指基序缺失外，其他8個(gè)CsWRKYIIcs均含有1個(gè)高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于IIc亞家族。9個(gè)蛋白均具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可能作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與茶樹的逆境調(diào)控。這些基因受ABA、干旱、高鹽和高溫脅迫不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，而且從啟動(dòng)子序列預(yù)測到多個(gè)與非生物脅迫相關(guān)的作用元件，表明CsWRKYIIcs參與了茶樹對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)；高鹽脅迫下的總體表達(dá)水平高于干旱、高溫脅迫，表明其可能對(duì)鹽脅迫具有更高的敏感性。在ABA、干旱、高鹽和高溫處理下，CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7表達(dá)量變化顯著，可作為茶樹逆境候選基因進(jìn)行深入研究。