銀耳源糖醛酸制備工藝及體外抗氧化活性研究

高云杉 陳洋煒 鄭明鋒 楊成龍

摘 要：以銀耳多糖為原料，采用酸水解法制備葡萄糖醛酸。以葡萄糖醛酸得率為指標(biāo)，運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化并制備銀耳糖醛酸，檢測(cè)其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，酸水解制備銀耳糖醛酸的最佳工藝條件如下：水解溫度80℃，水解時(shí)間6h，鹽酸濃度1mol/L，底物濃度0.8mg/mL，葡萄糖醛酸得率（32.03±1.70）%。與銀耳多糖、葡萄糖醛酸的體外抗氧化活性對(duì)比，銀耳糖醛酸的抗氧化活性要顯著優(yōu)于銀耳多糖和葡萄糖醛酸。

關(guān)鍵詞：葡萄糖醛酸;銀耳多糖;制備;體外抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào) S567.3+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）09-0022-06

Study on Preparation of Tremella Glucuronic Acid and its Antioxidant Activity in Vitro

Gao Yunshan1 et al

（1School of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350000， China）

Abstract： The glucuronic acid were obtained by acid hydrolysis from Tremella polysaccharide. The yield rate of glucuronic acid was used as the index to optimize the preparation condition for glucuronic acid by orthogonal design depended on the results of single factor experiments. Results showed that the yield rate of Tremella glucuronic acid was at 32.03%±1.70% under the optimal conditions： the hydrolysis at 80℃ for 6 hours， hydrochloric acid concentration of 1mol/L， substrate concentration of 0.8mg/mL. The antioxidant activity of tremella glucuronic acid was better than that of glucuronic acid and tremella polysaccharide.

Key words： Tremella Polysaccharide; Glucuronic Acid; Preparation; Antioxidant Activity in vitro.

葡萄糖醛酸（Glucuronic acid）簡(jiǎn)稱葡糖醛酸，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，它的分子式為C6H10O7，分子量為194.14[1]。葡萄糖醛酸分子中同時(shí)存在高反應(yīng)活性的醛基和羧基，可與人體內(nèi)源性及外源性有毒物質(zhì)中的羥基、巰基、羧基、氨基等相互作用，從而達(dá)到排毒養(yǎng)顏、促進(jìn)代謝的目的[2]。有研究表明，糖醛酸含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)[3]。目前，葡萄糖醛酸的生產(chǎn)方法主要有生物發(fā)酵法、化學(xué)氧化法、多糖水解法等[4]。但生物發(fā)酵法所用的酶及菌株的篩選與制備過(guò)程繁瑣、成本高且收率極低，目前，僅用于實(shí)驗(yàn)探索[5]。當(dāng)前工業(yè)化生產(chǎn)葡萄糖醛酸主要是采用濃硝酸氧化淀粉的化學(xué)氧化法，但污染嚴(yán)重、能耗高、成本大[6]。多糖水解法多采用動(dòng)植物多糖經(jīng)過(guò)酸堿水解生產(chǎn)糖醛酸，原料天然多樣、來(lái)源廣泛，對(duì)開(kāi)展大宗農(nóng)副產(chǎn)品深加工和綜合利用、合理利用自然資源有著重要意義。

銀耳多糖（Tremella polysaccharides，TP）是銀耳中的重要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降血糖血脂等多項(xiàng)生理功能[7-10]。銀耳多糖是由α-（1→3）-D-甘露糖為主鏈結(jié)構(gòu)的雜多糖，主要成分有木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖，其中葡萄糖醛酸的含量約占10%，比其他天然多糖中的原料糖醛酸含量高[11]。在一般情況下銀耳多糖中的葡萄糖醛酸常與糖苷鍵結(jié)合在一起，通過(guò)水解等方法使銀耳多糖中的葡萄糖醛酸游離或產(chǎn)生小分子結(jié)構(gòu)，使其更易被分解利用，發(fā)揮出更強(qiáng)的生物活性[12]。

目前關(guān)于純化的銀耳多糖的單糖組成以及糖醛酸含量研究已有少量報(bào)道，但未見(jiàn)銀耳多糖制備葡萄糖醛酸的研究。因此，本研究以銀耳源葡萄糖醛酸為研究對(duì)象，以葡萄糖醛酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討了水解時(shí)間、底物濃度、酸濃度、溫度等對(duì)銀耳多糖水解后葡萄糖醛酸提取率的影響，以及銀耳源葡萄糖醛酸對(duì)羥基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基的清除作用，以考察糖醛酸含量與其抗氧化活性的相關(guān)性，為以后的分離純化、活性分析和應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海寶曼生物科技有限公司）、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、間羥基聯(lián)苯、四硼酸鈉、30%過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS標(biāo)準(zhǔn)品、三氯乙酸、水楊酸化學(xué)試劑均為分析純、BL60S電子天平（德國(guó)SARTRIUS公司）、HH-2恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）、XD-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器公司）、LXJ-ⅡB離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、CLARIOSTAR多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)BMGLABTECH公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖醛酸的測(cè)定 葡萄糖醛酸含量的檢測(cè)采用間羥基聯(lián)苯法[13]，具體步驟如下：

四硼酸鈉—硫酸溶液：0.478g四硼酸鈉溶于100mL濃硫酸中，備用。

間羥基聯(lián)苯溶液：稱取0.15g間羥基聯(lián)苯溶于5mg/mL氫氧化鈉溶液中，定容至100mL，使得最終濃度為1.5mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸溶液：稱取干燥至恒重的葡萄糖醛酸10mg定容至100mL，混勻配置成100μg/mL的溶液。

取100μg/mL的葡萄糖醛酸溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mL于20mL的具塞試管中，加水至1mL，置于冰水浴中預(yù)冷3min，然后加入5mL的四硼酸鈉—硫酸溶液，漩渦振蕩器震蕩2min后，于沸水浴中加熱5min，立即冷卻至室溫，加入100μL間羥基聯(lián)苯溶液，震蕩搖勻5min，靜置30min，于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。測(cè)得回歸方程為：y=0.0063x+0.0932，r=0.9993。

取試驗(yàn)結(jié)果得到的葡萄糖醛酸溶0.5mL于20mL的具塞試管中，置于冰水浴中預(yù)冷3min，然后加入5mL的四硼酸鈉—硫酸溶液，漩渦振蕩器震蕩2min后，于沸水浴中加熱5min，立即冷卻至室溫，加入100μL間羥基聯(lián)苯溶液，震蕩搖勻5min，靜置30min，于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.2.2 銀耳水解糖醛酸工藝單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 溫度 取1mg/mL銀耳多糖溶液20mL與20mL的1.0mol/L鹽酸溶液混合，將溶液在恒溫振蕩水浴鍋中分別加熱至50、60、70、80、90℃后混合進(jìn)行水解反應(yīng)，開(kāi)始反應(yīng)計(jì)時(shí)，反應(yīng)6h，用2.0mol/LNaOH溶液中和，調(diào)pH值至6.5，定容60mL，并冷卻至室溫。取10mL反應(yīng)液加入4倍體積的無(wú)水乙醇靜置12h，5000r/min離心10min，收集上清液，計(jì)算葡萄糖醛酸的提取率。

1.2.2.2 時(shí)間 取1mg/mL銀耳多糖溶液20mL與1.0mol/L鹽酸溶液20mL混合，將溶液在恒溫振蕩水浴鍋中分別加熱至90℃后混合進(jìn)行水解反應(yīng)，開(kāi)始反應(yīng)計(jì)時(shí)，反應(yīng)4、5、6、7、8h，用2.0mol/L NaOH溶液中和，調(diào)pH值至6.5，定容60mL，并冷卻至室溫。取10mL反應(yīng)液加入4倍體積的無(wú)水乙醇靜置12h，5000r/min 離心10min，收集上清液，計(jì)算葡萄糖醛酸的提取率。

1.2.2.3 酸濃度 取1mg/mL銀耳多糖溶液20mL與0.3、0.5、0.7、1.0、1.2mol/L鹽酸溶液20mL混合，將溶液在恒溫振蕩水浴鍋中分別加熱至90℃后混合進(jìn)行水解反應(yīng)，開(kāi)始反應(yīng)計(jì)時(shí)，反應(yīng)6h，用2.0mol/L NaOH溶液中和，調(diào)pH值至6.5，定容60mL，并冷卻至室溫。取10mL反應(yīng)液加入4倍體積的無(wú)水乙醇靜置12h，5000r/min離心10min，收集上清液，計(jì)算葡萄糖醛酸的提取率。

1.2.2.4 底物濃度 取0.5、1、2、3、4、5mg/mL銀耳多糖溶液20mL與1.0mol/L鹽酸溶液20mL混合，將溶液在恒溫振蕩水浴鍋中分別加熱至90℃后混合進(jìn)行水解反應(yīng)，開(kāi)始反應(yīng)計(jì)時(shí)，反應(yīng)6h，用2.0mol/L NaOH溶液中和，調(diào)pH值至6.5，定容60mL，并冷卻至室溫。取10mL反應(yīng)液加入4倍體積的無(wú)水乙醇靜置12h，5000r/min離心10min，收集上清液，計(jì)算葡萄糖醛酸的提取率。

1.2.3 銀耳水解糖醛酸工藝正交試驗(yàn) 在上述研究的基礎(chǔ)上，對(duì)單因素條件進(jìn)行正交優(yōu)化，試驗(yàn)每組重復(fù)3次。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.4 銀耳糖醛酸與銀耳多糖、葡萄糖醛酸抗氧化活性的測(cè)定

1.2.4.1 銀耳糖醛酸制備 根據(jù)正交分析篩選出的最優(yōu)條件生產(chǎn)銀耳水解物。稱取0.8mg/mL銀耳多糖溶液500mL，加入0.1mol/L鹽酸水溶液500mL，在溫度90℃下加熱6h，冷卻至室溫，加入4倍體積的無(wú)水乙醇靜置12h，5000r/min離心10min，收集上清液，真空濃縮至無(wú)餾分，冷凍干燥備用。

1.2.4.2 對(duì)羥基自由基（-OH）清除效果的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]方法，往試管中依次加入配好的水楊酸—乙醇（9mmol/L）工作液、亞硫酸鐵溶液（9mmol/L），然后加入濃度分別為2、4、6、8、10mg/mL的樣品溶液以及過(guò)氧化氫溶液（8.8mmol/L）各1mL，純水補(bǔ)足15mL，振蕩混勻后置于37℃的水浴中反應(yīng)15min，在波長(zhǎng)510nm下檢測(cè)吸光值，記為AX;按上述步驟用1mL的純水代替樣品檢測(cè)吸光值，記為A0;將1mL純化水代替過(guò)氧化氫檢測(cè)吸光值，記為AX0。試驗(yàn)每組平行3次，取平均值。參照以下公式計(jì)算羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

1.2.4.3 對(duì)ABTS 自由基清除效果的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]方法配制ABTS工作液，分別取濃度為1、2、3、4、5mg/mL的樣品溶液100μL和ABTS工作液1.5mL充分混合，避光處常溫放置1h后，于波長(zhǎng)734nm處測(cè)定吸光度，記為AX;同時(shí)以純水代替樣品測(cè)定吸光度，記為A0;以純水代替ABTS測(cè)定吸光度，記為AX0。試驗(yàn)每組平行3 次，取平均值。參照以下公式計(jì)算羥基自由基清除率：

ABTS 自由基清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

1.2.4.4 對(duì)DPPH 自由基清除效果測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]方法，分別取濃度為1、2、3、4、5mg/mL 的樣品溶液2mL和DPPH工作液2mL在試管中混勻，在常溫避光處反應(yīng)30min，然后于波長(zhǎng)517nm處測(cè)定其吸光度（AX）;以純化水代替樣品測(cè)定吸光度（A0）;以純化水代替DPPH工作液測(cè)定吸光度（AX0）。試驗(yàn)每組平行3次，取平均值。參照以下公式計(jì)算羥基自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)銀耳糖醛酸提取率的影響 由圖1可以看出在不同溫度的條件下，水解液中的葡萄糖醛酸提取率隨溫度的升高呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析顯示，當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)糖醛酸提取率達(dá)到最高，但80℃與90℃糖醛酸提取率相差較小，分別為28.60%和29.71%;這可能是因?yàn)闇囟仍礁?，分子運(yùn)動(dòng)越激烈，酸分子與多糖的糖苷鍵接觸的機(jī)會(huì)越多，大大增加了糖苷鍵的斷裂機(jī)會(huì)，使帶有葡萄糖醛酸的糖苷鍵游離出來(lái)，更易被分離提取;這可能是由于反應(yīng)液內(nèi)葡萄糖醛酸的糖苷鍵基本游離出來(lái)，糖醛酸提取率就開(kāi)始趨于平穩(wěn)[17]。

2.2 不同時(shí)間對(duì)銀耳糖醛酸提取率的影響 由圖2可知水解時(shí)間與銀耳糖醛酸的提取率密切相關(guān)，水解時(shí)間太短時(shí)銀耳多糖反應(yīng)不夠充分，糖醛酸提取率太低，隨著水解反應(yīng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，葡萄糖醛酸含量也逐漸增大，水解時(shí)間到達(dá)6h時(shí)糖醛酸提取率到達(dá)最高峰，為26.29%，隨后糖醛酸的提取率隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始有小幅下降。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的高溫在一定程度上破壞了糖醛酸的結(jié)構(gòu)，使糖醛酸提取率下降[18]。因此綜合考慮確定銀耳糖醛酸提取的最佳水解時(shí)間為6h。

2.3 不同底物濃度對(duì)銀耳糖醛酸提取率的影響 如圖3所示，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.5～5mg/mL范圍時(shí)，水解液中的葡萄糖醛酸提取率剛開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但底物濃度超過(guò)1mg/mL后糖醛酸提取率開(kāi)始逐步下降，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊竭_(dá)3mg/mL時(shí)糖醛酸提取率變化趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。這可能是由于底物濃度較小時(shí)，反應(yīng)液內(nèi)糖醛酸的量有限，因此糖醛酸提取率較小。隨著底物濃度的增加，糖醛酸的提取率也隨之上升，上升到一定濃度時(shí)反應(yīng)液黏度增大，當(dāng)黏度到達(dá)一定程度時(shí)，鹽酸分子不能充分地與糖苷鍵進(jìn)行接觸水解，從而降低了水解效率，使葡萄糖醛酸提取率下降或停滯不前。因此綜合考慮銀耳糖醛酸提取的最佳底物濃度為1mg/mL。

2.4 不同酸濃度對(duì)銀耳糖醛酸提取率的影響 由圖4可以看出，隨著酸濃度的增加，葡萄糖醛酸含量也在逐漸增加。當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到0.7mol/L后，糖醛酸提取率曲線趨于平緩。由于過(guò)大的鹽酸濃度會(huì)使后續(xù)的調(diào)節(jié)pH產(chǎn)生大量的鹽，不利于之后的分離純化檢測(cè)，因此選擇0.7mol/L的酸濃度作為水解的最佳條件。

2.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)篩選最佳的水解條件組合。如表2所示，通過(guò)比較k值可以得出水解條件的最優(yōu)組合為A4B2C4D2，即溫度90℃，時(shí)間6h，鹽酸濃度1mol/L，底物濃度0.8mg/mL。極差R分析結(jié)果顯示，4種影響因素中溫度的極差最大，為18.215，底物濃度次之，說(shuō)明在水解的過(guò)程中，主要影響的因素是溫度，其次是鹽酸的濃度。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，如表3所示，通過(guò)比較F值可以得出，4種因素的顯著性差異大小為A>C>B>D，即溫度>酸濃度>時(shí)間>底物濃度。這與表2中的極差分析結(jié)果相一致。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，因素B、D對(duì)葡萄糖醛酸提取率的影響不顯著，因此從表2中選取平均數(shù)最大的水平B2D2為最優(yōu)水平;因素A、C影響極顯著（P<0.01），進(jìn)一步進(jìn)行多重比較。

采用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)因素A、C進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示因素A處于第3水平（80℃）、第4水平（90℃）時(shí)葡萄糖醛酸的提取率相差不大，兩者均可作為優(yōu)選條件。綜合經(jīng)濟(jì)節(jié)能考慮，選取第3水平為溫度的最優(yōu)條件，即A3。因素C中第4水平（1mol/LHCl）要顯著優(yōu)于其他水平，因此選取第4水平為酸濃度最優(yōu)條件，即C4。

根據(jù)正交試驗(yàn)方差分析和多重比較，A3B2C4D2為最優(yōu)方案。將篩選出的最優(yōu)水平做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明酸水解銀耳多糖提取糖醛酸的最佳工藝條件即為水解溫度80℃下，水解6h，鹽酸濃度1mol/L，底物濃度0.8mg/mL，所得的銀耳糖醛酸提取率為32.03%±1.70%。

2.6 銀耳糖醛酸體外抗氧化效果

2.6.1 對(duì)羥基自由基的清除效果的測(cè)定 從圖5可以看出銀耳多糖、銀耳糖醛酸、葡萄糖醛酸對(duì)羥基自由基均有清除作用，且隨著濃度的增加而有所增強(qiáng)，說(shuō)明羥基自由基的清除率與三者的質(zhì)量濃度呈一定的量效關(guān)系。經(jīng)方差分析表示，當(dāng)濃度處于2mg/mL時(shí)，三者的羥基自由基清除率差異顯著（P<0.01）。當(dāng)濃度超過(guò)8mg/mL后，三者雖都處于上升趨勢(shì)，但三者清除率的差異并不顯著（P>0.05）。葡萄糖醛酸的羥基自由基清除率要高于銀耳多糖與銀耳糖醛酸，這可能是因?yàn)槠咸烟侨┧崴芤翰环€(wěn)定性，易與羥基結(jié)合從而減少有色物質(zhì)生成，使羥基自由基清除率上升。銀耳糖醛酸的羥基自由基清除率要略高于銀耳多糖，可能是由于銀耳水解物中糖醛酸含量要略高于銀耳多糖，糖醛酸通過(guò)與自由基反應(yīng)從而達(dá)到清除自由基的目的。

2.6.2 對(duì)ABTS 自由基的清除效果 由圖6結(jié)合方差分析可知，在一定濃度范圍內(nèi)（1～5mg/mL），銀耳糖醛酸的ABTS自由基清除效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于銀耳多糖和葡萄糖醛酸（P<0.01），銀耳糖醛酸ABTS自由基清除率IC50為1.13mg/mL。銀耳糖醛酸濃度在1～3mg/mL時(shí)ABTS自由基清除率有著極顯著上升（P<0.01）。隨著樣品濃度的增加，銀耳多糖和葡萄糖醛酸的ABTS自由基清除率略有上升，但兩者差異并不顯著（P>0.05）。當(dāng)銀耳糖醛酸濃度到達(dá)3mg/mL時(shí)，銀耳糖醛酸的ABTS自由基清除率達(dá)到98.96%，而銀耳多糖和葡萄糖醛酸ABTS自由基清除率才達(dá)到14.01%和8.31%，可見(jiàn)銀耳糖醛酸的ABTS自由基清除效果要優(yōu)于銀耳多糖和葡萄糖醛酸。

2.6.3 對(duì)DPPH 自由基的清除效果 圖7結(jié)合方差分析表明，在1～5mg/mL濃度范圍內(nèi)，銀耳糖醛酸的DPPH自由基清除率大大優(yōu)于銀耳多糖和葡萄糖醛酸（P<0.01），銀耳糖醛酸DPPH自由基清除率IC50為1.08mg/mL。當(dāng)濃度在1～3mg/mL之間，銀耳糖醛酸DPPH自由基清除率大幅度上升;當(dāng)濃度到達(dá)3mg/mL之后，銀耳糖醛酸DPPH自由基清除率趨勢(shì)逐漸放緩且差異并不顯著（p>0.05），清除率之差逐步維持在2～3個(gè)百分點(diǎn)。隨著銀耳多糖和葡萄糖醛酸濃度增加，其DPPH自由基清除率雖有上升，但是相鄰濃度間DPPH自由基清除率差異并不顯著（p>0.05），上升趨勢(shì)緩慢，遠(yuǎn)不如銀耳糖醛酸。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以銀耳葡萄糖醛酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以水解溫度、時(shí)間、酸濃度、底物濃度為考察因素，通過(guò)L16（45）正交試驗(yàn)結(jié)合多重比較確定酸水解法提取銀耳糖醛酸的最優(yōu)工藝條件：溫度80℃下，水解6h，鹽酸濃度1mol/L，底物濃度0.8mg/mL。

根據(jù)最優(yōu)工藝條件生產(chǎn)的銀耳水解物，其體外抗氧化試驗(yàn)表明銀耳糖醛酸的抗氧化活性要優(yōu)于銀耳多糖和葡萄糖醛酸。當(dāng)銀耳糖醛酸濃度達(dá)到5mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基、ABTS 自由基、DPPH自由基清除率分別為30.51%、99.40%、82.01%。根據(jù)銀耳多糖和葡萄糖醛酸的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合方差分析可見(jiàn)銀耳糖醛酸對(duì)于羥基自由基的清除效果稍差一些，但對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基的清除效果非常好（p<0.01）。

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（責(zé)編：王慧晴）