基于超高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用的白血病細(xì)胞及耐藥細(xì)胞非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究

周玲婳，盧紅梅

(中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083)

白血病是一種因造血干細(xì)胞在分化過(guò)程中不同階段發(fā)生凋亡障礙、分化阻滯以及惡性增殖而引起的異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)臨床和病理情況，一般將白血病分為慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓系細(xì)胞白血病、急性髓系細(xì)胞白血病和其它少見(jiàn)的白血病類(lèi)型。白血病的主要治療方式為多種藥物結(jié)合化療和骨髓移植，而多藥耐藥性是治療中的最大障礙之一。白血病多藥耐藥性的形成機(jī)制十分復(fù)雜，目前許多報(bào)道從相關(guān)基因[1-3]、蛋白質(zhì)[4-5]和代謝物[6-8]等多方面進(jìn)行研究。其中，代謝組學(xué)作為一門(mén)致力于研究整個(gè)生物體的動(dòng)態(tài)代謝狀態(tài)的“組學(xué)”，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①所需檢測(cè)的代謝產(chǎn)物數(shù)量遠(yuǎn)少于基因和蛋白質(zhì)的數(shù)量；②基因和蛋白水平的微小改變會(huì)在代謝產(chǎn)物中被放大；③檢測(cè)對(duì)象是代謝的最終產(chǎn)物，能夠直接反映機(jī)體的生理或病理狀態(tài)[9-10]。這些優(yōu)點(diǎn)使得代謝組學(xué)廣泛用于各種疾病的代謝研究。

目前，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)因具有靈敏度高、分辨率高、穩(wěn)定性好、干擾小等優(yōu)點(diǎn)，而成為細(xì)胞代謝物研究的最熱門(mén)分析手段之一。由于細(xì)胞中各種酶反應(yīng)活躍且繁多，代謝產(chǎn)物成分復(fù)雜，濃度跨度大，物質(zhì)之間理化性質(zhì)差異較大，所以最大限度地提取細(xì)胞內(nèi)代謝物是非靶標(biāo)分析方法的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞猝滅是進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)代謝物分析前的最重要步驟，Dietmair等[11]比較了60%甲醇、含0.9%碳酸氫銨(AMBIC)的60%甲醇和0.9% NaCl溶液3種常用的猝滅溶劑，發(fā)現(xiàn)0.9%的NaCl溶液對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有較好的猝滅效果，并通過(guò)比較12種溶劑體系對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的提取結(jié)果，發(fā)現(xiàn)50%乙腈水溶液的效果最好。He等[12]基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用比較了100%甲醇、甲醇/甲醇/水(2∶2∶1,體積比)、50%乙腈水溶液和60%甲醇水溶液4種提取溶劑的提取效率，發(fā)現(xiàn)甲醇/甲醇/水的提取效果最好。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)80%甲醇對(duì)人結(jié)腸腺癌(HCT8)細(xì)胞的代謝物提取最多。所以，對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞分析時(shí)，應(yīng)優(yōu)化出最合適的溶劑提取方法。除了溶劑提取外，利用物理化學(xué)或機(jī)械作用力，如超聲、凍融、微波[14]等方法進(jìn)行細(xì)胞破碎，可幫助提高胞內(nèi)代謝物的提取效率。

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-IT-TOF MS)聯(lián)用分析平臺(tái)，以人慢性髓系白血病細(xì)胞及其阿霉素耐藥細(xì)胞(K562和K562-ADM)制備成的質(zhì)量控制(QC)樣本為研究對(duì)象，以獲得的代謝特征峰數(shù)目和方法重復(fù)性等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察了細(xì)胞破碎方法、提取溶劑體系以及溶劑體積對(duì)提取效果的影響，以期建立可靠的研究2種細(xì)胞代謝物差異的非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：LC-30AD超高效液相色譜系統(tǒng)、Shimadzu LCMS-8050離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Shimadzu公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀科學(xué)儀器有限公司)；KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HSC-24A氮吹儀(南京科捷分析儀器有限公司)；AL104電子分析天平(Mettler-Toledo公司)；加熱/制冷型-TCS10恒溫混勻儀(杭州瑞城儀器有限公司)；IKA MS 3digital渦旋儀(北京聯(lián)合科儀科技有限公司)。

甲酸、甲醇、乙腈和異丙醇(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)；純凈水(杭州娃哈哈公司)；氯仿(優(yōu)級(jí)純，科隆化工試劑廠)；甲基叔丁基醚(優(yōu)級(jí)純，上海泰坦科技股份有限公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)。標(biāo)準(zhǔn)品：L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-精氨酸、L-肉堿和馬尿酸均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)與收集

人慢性髓系白血病細(xì)胞(K562細(xì)胞株)及其阿霉素耐藥細(xì)胞(K562-ADM耐藥細(xì)胞株)均來(lái)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院。

K562和K562-ADM細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(37 ℃，5%CO2)中。K562-ADM細(xì)胞培養(yǎng)于含阿霉素(300 ng/mL)的培養(yǎng)基中直至細(xì)胞收集前1周。

當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算培養(yǎng)基中細(xì)胞的密度，從而計(jì)算收集每個(gè)樣本所需的細(xì)胞懸浮液體積(V1)。采用液氮和5V1的9 g/L NaCl(4 ℃)溶液進(jìn)行猝滅。

1.3 樣本預(yù)處理

將K562和K562-ADM細(xì)胞等量混合后，等分為200個(gè)QC樣本(每個(gè)QC樣本中細(xì)胞數(shù)量為2×106)。以QC樣本進(jìn)行細(xì)胞破碎方法、提取溶劑體系和提取溶劑體積的條件考察后，得到優(yōu)化的樣本預(yù)處理步驟如下：

向QC樣本中加入10 μL的馬尿酸(5.34 μg/mL，內(nèi)標(biāo))和400 μL的80%甲醇(-20 ℃預(yù)冷)，渦旋1 min后，置于超聲清洗儀中超聲7.5 min，通過(guò)加冰維持水溫為4 ℃。在4 ℃下16 000 r/min離心10 min后，將上層代謝物提取液轉(zhuǎn)移至置于干冰上的玻璃離心管中。剩余物質(zhì)再用400 μL的80%甲醇(-20 ℃預(yù)冷)重復(fù)上述步驟，收集代謝物提取液，氮吹至完全干燥，復(fù)溶于100 μL 80%甲醇(5%甲酸，體積分?jǐn)?shù)，下同)中，離心10 min(16 000 r/min，4 ℃)，取上層清液于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣分析。

1.4 儀器條件

液相色譜條件：ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters 公司)，柱溫為35 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為4 μL。流動(dòng)相：A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～3 min，5% B；3～4.5 min，5%～50% B；4.5～15 min，50%～100% B；15～25 min，100% B。流速在0～19 min時(shí)為0.30 mL/min；19～20 min，0.30～0.35 mL/min；20～25 min，0.35 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式，CDL管的溫度為200 ℃，霧化氣(N2)流速為1.5 L/min，干燥氣(N2)壓力為100 kPa，離子阱壓力為1.8×10-5kPa，檢測(cè)器電壓為1.62 kV,噴霧電壓為+4.5 kV，RP真空度為85.0～92.0 Pa，IT真空度為1.8×10-2Pa，TOF真空度為1.3×10-4Pa。前處理?xiàng)l件優(yōu)化時(shí)采用質(zhì)譜全掃描模式，掃描范圍為m/z100～1 000；后續(xù)對(duì)差異代謝特征定性時(shí)進(jìn)行MS/MS數(shù)據(jù)采集，掃描范圍為m/z50～1 000。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將UPLC-MS獲得的原始數(shù)據(jù)從工作站轉(zhuǎn)換為MADATA格式的文件，再將文件導(dǎo)入MZmine 2.0軟件[15]進(jìn)行峰提取、同位素峰合并、峰值積分、峰對(duì)齊，生成包含保留時(shí)間、質(zhì)荷比和面積的數(shù)據(jù)矩陣，按80%規(guī)則[16]去除零值，并以?xún)?nèi)標(biāo)法進(jìn)行校準(zhǔn)后，數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca/)中。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，并進(jìn)行雙尾t檢驗(yàn)和對(duì)p-value采用Benjamini-Hochberg方法進(jìn)行錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正，以得到的校正p值和2組數(shù)據(jù)平均值的倍數(shù)變化(FC=平均值(K562強(qiáng)度)/平均值(K562-ADM 強(qiáng)度))，確定其是否具有顯著性差異。

通過(guò)代謝特征的準(zhǔn)確質(zhì)荷比以及MS/MS碎片信息，結(jié)合儀器工作站的Formula Predictor軟件，在METLIN(http://metlin.scripps.edu/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索推測(cè)可能的結(jié)構(gòu)式，部分代謝特征進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鑒定。

1.6 方法學(xué)考察

儀器穩(wěn)定性：按“1.3”方法處理QC樣本，同一QC樣本連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算代謝特征峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察儀器穩(wěn)定性。

方法重復(fù)性：按“1.3”方法平行處理6份樣本，連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算代謝特征峰強(qiáng)度的RSD，考察方法重復(fù)性。

日內(nèi)精密度：按“1.3”方法平行處理 QC樣本，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析，計(jì)算代謝特征峰強(qiáng)度的RSD，考察日內(nèi)精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的優(yōu)化

2.1.1 細(xì)胞破碎方法的優(yōu)化以甲醇為提取溶劑，考察了超聲和凍融循環(huán)2種常見(jiàn)的細(xì)胞破碎方法對(duì)細(xì)胞代謝物提取的影響。其中凍融循環(huán)破碎方法的步驟如下：樣本加入提取溶劑，渦旋1 min后，在液氮中放置10 min，然后在37 ℃的恒溫混勻儀中振蕩5 min，凍融步驟重復(fù)3次，離心后，轉(zhuǎn)移提取代謝物至干凈的玻璃離心管中，溶劑提取循環(huán)3次。超聲破碎方法見(jiàn)“1.3”。每種方法處理6個(gè)平行樣。對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的2組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以代謝特征峰數(shù)目、相同代謝特征峰的平均強(qiáng)度和RSD為指標(biāo)，對(duì)不同的細(xì)胞破碎方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

結(jié)果顯示，凍融循環(huán)破碎和超聲破碎方法得到的代謝特征峰數(shù)目分別為(514.17±2.32)和(556.33±6.28)(圖1A)。兩種方法檢測(cè)到330個(gè)相同的代謝特征峰(圖1B)，其中254個(gè)代謝特征峰具有顯著性差異(p<0.05)，超聲破碎法有227個(gè)代謝特征峰的平均強(qiáng)度大于凍融循環(huán)破碎法，說(shuō)明超聲破碎法能檢測(cè)到更多的代謝特征峰數(shù)目，并且對(duì)于共同檢測(cè)到的代謝特征峰具有更高的破碎效率。

圖1 2種細(xì)胞破碎方式的比較Fig.1 Comparison of two methods for cells disruptionA：results of feature number;B：Venn diagram comparison of feature numbers;C：box plot of RSD distribution

RSD常用于評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性，在基于LC-MS的代謝組學(xué)研究中，單個(gè)代謝物最大的允許誤差為20%[17]。圖1A中，凍融循環(huán)破碎和超聲破碎方法得到的RSD≤20%的代謝特征峰數(shù)目分別為(446.00±3.03)和(467.83±4.79)。從RSD箱線圖(圖1C)可見(jiàn)，2種方法所檢測(cè)的代謝特征峰的RSD大部分小于20%，說(shuō)明2種方法的重復(fù)性均良好。但超聲破碎法的均值和四分位距(IQR)范圍的RSD數(shù)值更小，表明超聲破碎法的重復(fù)性更好，且超聲破碎法耗時(shí)更短，操作更簡(jiǎn)單，所以選擇超聲方法進(jìn)行細(xì)胞破碎。

2.1.2 細(xì)胞提取溶劑的優(yōu)化比較了80%甲醇(80%MeOH)、甲醇/異丙醇/水(M/IPA/W,2∶2∶1)、甲醇/乙腈/水(M/ACN/W,2∶2∶1)、甲醇/氯仿/水(M/CHCl3/W,2∶2∶1)和甲醇/甲基叔丁基醚/水(M/MTBE/W,2∶2∶1)5種溶劑體系的提取結(jié)果。實(shí)驗(yàn)前，溶劑均于-20 ℃預(yù)冷，每種方法處理6個(gè)平行樣。如圖2A所示，5種溶劑提取得到的代謝特征峰數(shù)目分別為(628.67±11.50)、(518.83±7.83)、(503.50±8.41)、(526.00±4.60)和(539.83±12.12)，其中80%甲醇提取的代謝特征峰最多。5種提取溶劑檢測(cè)到203個(gè)相同的代謝特征峰，其中198個(gè)代謝特征峰具有顯著性差異(p<0.05)；比較相同代謝特征峰的平均強(qiáng)度，5種溶劑提取得到平均強(qiáng)度最大的代謝特征峰個(gè)數(shù)依次為66、4、7、120和1。這表明對(duì)于相同代謝特征峰，甲醇/氯仿/水的提取效果最好，其次為80%甲醇，其它3種提取效果較差。

此外，5種溶劑提取得到RSD≤20%的代謝特征峰數(shù)目分別為(511.50±10.33)、(422.00±3.83)、(439.83±7.47)、(375.00±5.71)和(380.50±10.52)，其中80%甲醇得到的代謝特征峰數(shù)目最多(圖2A)。從RSD箱線圖(圖2B)可見(jiàn)，5種提取溶劑的代謝特征峰的RSD大部分小于20%，表明5種提取溶劑的重復(fù)性很好，其中甲醇/乙腈/水的四分位距最小，表明RSD波動(dòng)小，且四分位距范圍的RSD數(shù)值和均值最小，說(shuō)明該提取溶劑的重復(fù)性最好。80%甲醇和甲醇/異丙醇/水在四分位距范圍的RSD數(shù)值分布和均值比前者略大，重復(fù)性次之，而甲醇/甲基叔丁基醚/水和甲醇/氯仿/水在四分位距范圍的RSD數(shù)值分布最寬，均值最大，表明重復(fù)性較差。綜上，80%甲醇的提取效果較好，且溶劑更安全，因此本實(shí)驗(yàn)選擇80%甲醇為提取溶劑。

圖2 5種溶劑的提取結(jié)果Fig.2 Results of five solvents for metabolites extractionA：results of feature number;B：box plot of RSD distribution

2.1.3 提取溶劑體積的優(yōu)化考察了80%甲醇的體積(500、800、1 000 μL)對(duì)細(xì)胞代謝物提取效果的影響，每種方法6個(gè)平行樣。結(jié)果顯示，上述3種溶劑體積提取的代謝特征峰數(shù)目分別為(609.33±11.68)、(722.83±10.41)和(677.67±11.02)，其中800 μL提取到的代謝特征峰最多(圖3A)；此外，3種體積檢測(cè)到504個(gè)相同的代謝特征峰(圖3B)，其中40個(gè)代謝特征峰具有顯著性差異(p<0.05)，3組數(shù)據(jù)中平均強(qiáng)度最大的代謝特征峰個(gè)數(shù)依次為6、12和22，說(shuō)明體積對(duì)于相同代謝特征峰的強(qiáng)度影響不明顯。

此外，上述3種溶劑體積得到RSD≤20%的代謝特征峰數(shù)目依次為(467.33±9.71)、(610.00±8.54)和(528.00±8.89)，800 μL溶劑提取的代謝特征峰數(shù)目最多(圖3A)。RSD分布的箱線圖(圖3C)顯示，3種體積提取的代謝特征峰的RSD大部分小于20%，表明3種體積提取的重復(fù)性很好，但溶劑體積為800 μL時(shí)RSD的均值最小，且在四分位距范圍的RSD最小，表明800 μL提取的重復(fù)性更好，所以提取溶劑體積選擇800 μL。

圖3 3種溶劑體積的提取結(jié)果Fig.3 Results of three solvent volumesA：results of feature number;B：Venn diagram comparison of feature numbers;C：box plot of RSD distribution

2.2 方法學(xué)考察

按照 “1.6”方法考察了儀器穩(wěn)定性、方法重復(fù)性和日內(nèi)精密度。在儀器穩(wěn)定性考察中，98%的代謝特征峰的RSD小于20%；在方法重復(fù)性考察中，93%的代謝特征峰的RSD小于20%；在日內(nèi)精密度考察中，88%的代謝特征峰的RSD小于20%。以上結(jié)果表明，儀器穩(wěn)定性和方法重復(fù)性較好，樣本在12 h內(nèi)較穩(wěn)定，可用于細(xì)胞代謝組差異分析。

2.3 細(xì)胞的代謝物分析

按照“1.3”對(duì)K562和K562-ADM細(xì)胞(每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)量為2×106個(gè))進(jìn)行前處理，“1.4”條件進(jìn)行分析，每隔5個(gè)樣本穿插1個(gè)QC樣本以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行PCA分析，利用OPLS-DA模型進(jìn)行差異代謝物篩選。PCA分析結(jié)果見(jiàn)圖4A，可見(jiàn)QC樣本聚集緊密，表明建立的實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定，可用于下一步的代謝分析。OPLS-DA模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力參數(shù)分別為R2Y=0.940和Q2=0.932(圖4B和4C)，說(shuō)明該模型可靠。同時(shí)，OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果的R2Y與Q2均小于未置換前所建立的模型，且Q2有負(fù)截距，表明所建立的模型無(wú)過(guò)擬合(圖4D)。從OPLS-DA得分圖可得，K562和K562-ADM的細(xì)胞代謝物存在明顯差別。圖4E為OPLS-DA模型中變量的S-曲線，篩選出VIP>1的變量，再以經(jīng)校正的p值<0.05結(jié)合倍數(shù)變化(FC>2或FC<0.5)驗(yàn)證2組數(shù)據(jù)間存在顯著性差異，篩選出40個(gè)差異特征峰，按照“1.5”方法進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 K562和K562-ADM細(xì)胞的PCA和OPLS-DA結(jié)果Fig.4 PCA and OPLS-DA analysis results of K562 group and K562-ADM groupA：score plot for PCA;B：score plot for OPLS-DA;C：result for OPLS-DA model;D：permutation test result for OPLS-DA;E：S-plot

表1 K562和K562-ADM細(xì)胞間的差異代謝物Table 1 Summary of significant changed metabolites between K562 and K562-ADM group

(續(xù)表1)

K562和K562-ADM細(xì)胞間的差異代謝物的倍數(shù)變化如表1所示，與K562細(xì)胞相比，K562-ADM耐藥細(xì)胞中有17種代謝物的水平降低(FC>2)，其中L-肉堿和2-甲基鳥(niǎo)苷的水平顯著低于K562細(xì)胞中的含量；K562-ADM耐藥細(xì)胞中有23種代謝物的水平升高(FC<0.5)，其中腺嘌呤和鳥(niǎo)苷的水平顯著高于K562細(xì)胞。從代謝途徑分析，這些差異代謝物涉及氨基酸代謝、鞘脂代謝、嘌呤代謝以及嘧啶代謝等。其中，L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸等氨基酸在K562-ADM細(xì)胞中的水平較高。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，當(dāng)氨基酸參與合成的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而使治療藥物外泵，這是癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的重要機(jī)制之一[18]。同時(shí)，氨基酸也是嘌呤及嘧啶環(huán)生物合成的原料，K562-ADM耐藥細(xì)胞中，參與嘌呤代謝和嘧啶代謝的鳥(niǎo)苷、腺嘌呤和胸苷等物質(zhì)的含量顯著增加，表明耐藥細(xì)胞可能在細(xì)胞增殖中對(duì)核苷酸的需求不同于敏感細(xì)胞，且嘌呤核苷酸對(duì)于細(xì)胞內(nèi)能量的提供和信號(hào)傳導(dǎo)的作用非常重要。此外，環(huán)腺苷酸(cAMP)在K562-ADM耐藥細(xì)胞的含量降低，cAMP作為一種調(diào)控因子，可通過(guò)cAMP的蛋白激酶途徑調(diào)控細(xì)胞周期過(guò)程的增殖、分化和死亡。有實(shí)驗(yàn)表明cAMP隨濃度的降低，對(duì)K562-ADM耐藥細(xì)胞增殖的抑制作用減弱，且白血病患者服用cAMP復(fù)方制劑可一定程度上改善治療效果，這證明了cAMP可能調(diào)控白血病的多藥耐藥性[19-21]。此外，α-半乳糖基神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、鞘磷脂(d18∶0/14∶1(OH))和膽堿等物質(zhì)可能通過(guò)鞘脂代謝和甘油磷脂代謝參與細(xì)胞膜、線粒體膜等生物膜的構(gòu)成與功能活動(dòng)，這些物質(zhì)以及其它具有差異性的物質(zhì)在白血病耐藥機(jī)制方面尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本文以人慢性髓系白血病細(xì)胞及其阿霉素耐藥細(xì)胞(K562和K562-ADM)為研究對(duì)象，建立了基于UPLC-IT-TOF MS的非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法?？疾炝思?xì)胞破碎方式、提取溶劑體系和提取溶劑體積對(duì)白血病細(xì)胞代謝物的提取效果，發(fā)現(xiàn)以超聲進(jìn)行細(xì)胞破碎，采用800 μL的80%甲醇為提取溶劑，方法簡(jiǎn)單、可靠，提取到的代謝特征峰較多。采用建立的方法對(duì)K562和K562-ADM細(xì)胞代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果表明：相比K562細(xì)胞，K562-ADM耐藥細(xì)胞中有17種代謝物的含量顯著降低，23種代謝物的含量顯著增高。差異代謝物主要參與氨基酸代謝、鞘脂代謝、嘌呤代謝和嘧啶代謝等通路，參與代謝的L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸等氨基酸和cAMP等物質(zhì)與已知的白血病耐藥性機(jī)制相關(guān)。此外，其它差異代謝物與白血病耐藥性相關(guān)的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。