不同中藥乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶抑制活性的比較

張國哲 劉平平 季禹喬

[摘要] 目的 對(duì)幾味中藥醇提物的美白活性進(jìn)行研究，為開發(fā)中藥美白產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 高良姜、白及、白芷、蘇木、白術(shù)、紫草、艾葉、馬齒莧、訶子9味中藥采用70%乙醇提取方法，以維生素C和熊果苷為陽性對(duì)照，采用體外酪氨酸酶抑制法實(shí)驗(yàn)，比較不同藥物的活性差異。 結(jié)果 中藥訶子酪氨酸酶抑制率為（51.43±2.52）%，高于熊果苷的（46.34±6.32）%。中藥艾葉和馬齒莧也有一定的抑制酪氨酸酶作用，抑制率分別為（22.88±7.99）%和（13.07±11.98）%。而其他幾味中藥幾乎沒有抑制酪氨酸酶作用。 結(jié)論 中藥訶子、艾葉醇提物對(duì)酪氨酸酶有一定的抑制活性，可作為美白中藥進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 美白;酪氨酸酶;中藥;熊果苷

[中圖分類號(hào)] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）06（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study the whitening activity of ethanol extracts of several traditional Chinese medicine， and to provide experimental basis for the development of whitening products of traditional Chinese medicine. Methods Nine traditional Chinese medicine including lesser galangal rhizome， common bletilla rubber， dahurian angelica root， sappan wood， largehead atractylodes rhizome， Radix Arnebiae， argy wormwood leaf， purslane herb， and medicine terminalia fruit were extracted with 70% ethanol. Vitamin C and arbutin were used as positive control drugs. In vitro tyrosinase inhibition test was employed to compare the bioactivity of different drugs. Results The inhibition rate of traditional Chinese medicine medicine terminalia fruit was （51.43±2.52）%， was higher than （46.34±6.32）% of arbutin. Artemisiae Argyi， Herba Portulacae also have good tyrosinase inhibity， the inhibition rates were （22.88±7.99）% and （13.07±11.98）%， respectively. However， the other Chinese medicine hardly inhibited tyrosinase activity. Conclusion The ethanol extracts of medicine terminalia fruit and argy wormwood leaf have certain inhibitory activities on tyrosinase， which can be further studied as whitening tradiational Chinese medicine.

[Key words] Whitening; Tyrosinase; Traditional Chinese medicine; Arbutin

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)美的追求已經(jīng)從傳統(tǒng)的日化護(hù)膚品向純天然的功能化妝品轉(zhuǎn)變。美容中藥及化妝品、護(hù)膚品在我國發(fā)展歷史悠久，早在《五十二病方》中就已經(jīng)記載了8首有關(guān)美容相關(guān)的方劑。也有諸多中醫(yī)藥古籍關(guān)于美白中藥的記載。

由于中藥毒副作用小，使用后效果明顯，越來越受到廣大消費(fèi)者的歡迎。因此，研究開發(fā)中藥美容護(hù)膚品不僅可以滿足市場的需求，也對(duì)挖掘中醫(yī)藥寶庫、發(fā)揚(yáng)光大我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥十分有益。中醫(yī)藥美白、祛斑等產(chǎn)品以日本、韓國和臺(tái)灣發(fā)展較為迅速，市售的許多美白、祛斑產(chǎn)品都是通過抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的形成而達(dá)到美白的功效[1]，藥物的美白作用強(qiáng)弱可以通過測定其對(duì)酪氨酸酶抑制率作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[2-4]。美白藥物的篩選實(shí)驗(yàn)最常用的是酪氨酸酶抑制試驗(yàn)，方法成熟，結(jié)果可靠[5-7]。然而，單純注重美白還不夠，痤瘡、粉刺、脫發(fā)、齲齒等疾病多與微生物滋生有關(guān)，因此也應(yīng)當(dāng)關(guān)注抑菌中藥的美白作用。本研究主要通過體外實(shí)驗(yàn)，利用酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)，觀察高良姜、白及、白芷、蘇木、白術(shù)、紫草、艾葉、馬齒莧、訶子幾味傳統(tǒng)的美白及抗菌消炎中藥的美白活性，為開發(fā)中藥美白化妝品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

熊果苷、L（+）-抗壞血酸（臺(tái)灣第一化工原料股份有限公司）;酪氨酸酶（美國Sigma公司，貨號(hào)：076K7034， 5771 U/mg）;酪氨酸（美國Sigma公司，貨號(hào)：145726， 98%）;KH2PO4、K2HPO4（臺(tái)灣聯(lián)工化學(xué)制藥廠，分析純）。

1.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)真空干燥儀（臺(tái)灣泛群科技有限公司）;分析天平（美國丹佛DENVER，TB-214，精密度萬分之一）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化）;超聲波清洗器（美國BRANSONIC，TB-214）;渦旋混合器（美國Scientific Industries，Vortex-Genie2）;紫外分光光度計(jì)（日立，U-1800）。

1.3 中藥供試液制備

中藥飲片高良姜、白及、白芷、蘇木、白術(shù)、紫草、艾葉、馬齒莧、訶子9味中藥材購于臺(tái)灣屏東大茂藥局，由黃吉發(fā)教授進(jìn)行性狀鑒定，符合《中華人民共和國藥典》[8]規(guī)定的基源。

稱取10 g原藥材置于250 mL三角瓶中，加入150 mL 70%藥用乙醇浸泡12 h，在三角瓶口覆蓋玻璃皿，文火加熱45 min，將中藥提取液抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，旋轉(zhuǎn)真空干燥儀在50℃條件下干燥，制備供試中藥提取物粉末。分析天平準(zhǔn)確稱取17 mg中藥提取液干燥粉末，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，純凈水超聲溶解并定容，制備成濃度為1.7 mg/mL的供試藥液。

1.4 溶液配制

PBS緩沖液的配制（pH 6.8）：將0.5 mol/L的KH2PO4溶液53 mL與0.5 mol/L的K2HPO4溶液47 mL混合，向其中加入9 g的NaCl，并稀釋至1000 mL既得0.05 mol/L pH 6.8的PBS緩沖液。

酪氨酸（181.2 g/mol）5 mmol/L溶液的配制：稱取18.1 mg酪氨酸溶于20 mL pH 6.8的PBS緩沖溶液中，加熱攪拌至透明。

酪氨酸酶溶液的配制：稱取1.9 mg（10 000 U）酪氨酸酶，加10 mL濃度為0.05 mol/L的PBS溶液，避光冰浴下超聲波震蕩至透明，即得1000 U/mL酪氨酸酶溶液。

熊果苷供試液的配制：用PBS溶液配制熊果苷，濃度為4 mg/mL。

維生素C供試液的配制：用PBS溶液配制維生素C，濃度為4 mg/mL。

1.5 酪氨酸酶抑制測試

先將50 μL 5 mmol/L酪氨酸溶液和100 μL的中藥水溶液混合置于96孔板。隨后將以上混合溶液避光條件下加入20 μL 1000 U/mL酪氨酸酶溶液，25℃反應(yīng)10 min（另外一組不加酪氨酸酶，而加入20 μL純凈水或者PBS緩沖溶液）。陽性對(duì)照組為熊果苷和維生素C，濃度均為4 mg/mL。純凈水為空白對(duì)照組。每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。紫外分光光度計(jì)（日立，U-1800），波長為475 nm讀取吸光度值。樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率按照下式計(jì)算：抑制比率=[（A-B）-（C-D）]/（A-B）×100%;含酪氨酸酶與不含酪酸酶吸光度差值（△A）=C-D。A為純凈水加酪氨酸酶的吸光度（475 nm）數(shù)值;B為純凈水未加酪氨酸酶的吸光度（475nm）數(shù)值;C為加藥樣本加酪氨酸酶的吸光度（475 nm）數(shù)值;D為加藥樣本未加酪氨酸酶的吸光度（475 nm）數(shù)值。

2 結(jié)果

對(duì)照藥維生素C對(duì)酪氨酸酶的抑制率為95.74%，陽性對(duì)照藥物熊果苷的抑制率為46.34%，傳統(tǒng)常用的美白中藥白術(shù)、白及和白芷在本研究中抑制率分別為-6.46%、-3.76%和-7.51%。中藥訶子的酪氨酸酶抑制率為51.43%。中藥艾葉和馬齒莧也有一定的抑制酪氨酸酶作用，抑制率分別為22.88 %和13.07%。而蘇木的抑制率為-350.03%。見表1。

3 討論

中醫(yī)藥關(guān)于美白中藥的研究可謂歷史悠久，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載了多味美容美白中藥，功效概括為“悅澤”“悅顏色”“好顏色”“去面 黑干”“媚好”“美色”“潤澤”“光澤”等，且言可做面脂。中醫(yī)五行學(xué)說認(rèn)為，白色屬金，黑色屬水，金生水，故面黑者可用白色中藥入肺經(jīng)間接達(dá)到補(bǔ)腎水之目的[9]，另外，中醫(yī)講究整體觀念，通過活血化瘀，補(bǔ)氣血等調(diào)節(jié)全身的陰陽氣血，亦可達(dá)到美白的作用[10]。古籍記載白術(shù)可治療面如雀卵色，用苦酒漬術(shù)，日日拭之，極效（《肘后方》）;白及可以除白癬疥蟲，面上皯瘡，令人肌滑（《名醫(yī)別錄》）。白芷可以長肌膚，潤澤顏色，可作面脂（《神農(nóng)本草經(jīng)》）;艾葉可治療面上皯黯（《本草綱目》）;馬齒莧可治療濕廯、白禿、杖瘡（《本草綱目》）;陳藏器言高良姜可以下氣益聲，好顏色;紫草可以療小兒瘡，及面（《名醫(yī)別錄》）?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紫草具有抗菌消炎、抗病毒等作用，在護(hù)膚品中應(yīng)用廣泛;蘇木有活血破血之功，且現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蘇木有很好的抑菌活性。訶子又名訶黎勒，主治久泄久咳，有烏發(fā)生發(fā)之功，且有很好的抑菌功效。因此，本研究選擇上述9味中藥進(jìn)行美白實(shí)驗(yàn)研究。

從研究結(jié)果可以看出，陽性對(duì)照藥物維生素C對(duì)酪氨酸酶的抑制作用最強(qiáng)，高達(dá)95.74%，熊果苷的抑制率也達(dá)到46.34%，這與其他相關(guān)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似[11-12]。雖然文獻(xiàn)報(bào)道熊果苷和維生素C對(duì)酪氨酸酶的最大抑制率都可以超過90%，但在相同濃度下維生素C的抑制作用更強(qiáng)。本研究中，傳統(tǒng)常用的美白中藥白術(shù)、白及、白芷、紫草的抑制率出現(xiàn)了負(fù)值，提示幾味藥的醇提物對(duì)酪氨酸酶不但沒有抑制作用，反而有促進(jìn)作用。中藥蘇木的酪氨酸酶抑制率更是達(dá)到了-350.03%，這是由于蘇木醇提物與體系中酪氨酸酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致溶液渾濁所引起的。由于本研究中中藥飲片采用70%乙醇提取，推測是由于乙醇提取的活性不如水提取導(dǎo)致的[13-14]。而且，提取溫度對(duì)藥物的活性也有影響，有研究顯示[15]白芷隨著提取溫度的增加，抑制酪氨酸酶的作用會(huì)降低，甚至出現(xiàn)促進(jìn)酪氨酸酶活性的作用。而陳美君等[12]卻發(fā)現(xiàn)，白及醇提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率可達(dá)68.36%，水提物卻有促進(jìn)酪氨酸酶作用，與本研究結(jié)果不同。中藥訶子的酪氨酸酶抑制率高達(dá)51.43%，效果優(yōu)于熊果苷，且訶子的實(shí)驗(yàn)濃度為1.7 mg/mL，要低于熊果苷的4 mg/mL。陳彬等[16]研究了5味酸味中藥枳椇子、金櫻子、木瓜、地榆、綠萼梅對(duì)酪氨酸酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)5味中藥都有很高的抑制率，其中枳椇子抑制率最高可達(dá)81.66%。陳志春等[17]考察了山楂、當(dāng)歸、山茱萸對(duì)酪氨酸酶活性抑制率、多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量、多巴自動(dòng)氧化抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸味的收斂固澀藥山茱萸對(duì)酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用（P < 0.05）。

訶子也是一味收斂固澀中藥，在藏藥中，訶子有“藥中之王”的美譽(yù)，在敦煌古醫(yī)書中有很多方劑用到了訶子。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示[18-20]，訶子具有抗菌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗炎、保肝、抗腫瘤等功效。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)[21]，訶子對(duì)八種常見的治病真菌和3種細(xì)菌均有不同層度的殺菌抑菌作用?？勺鳛橹兴幓瘖y品的重要原料進(jìn)行深入開發(fā)。中藥艾葉和馬齒莧也有一定的抑制酪氨酸酶作用，也可作為美白成分進(jìn)一步研究。酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)是美白活性成分篩選的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，本研究設(shè)置了空白對(duì)照和陽性對(duì)照，結(jié)果穩(wěn)定可靠。后續(xù)可以利用小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞模型評(píng)價(jià)所篩選的活性中藥。

東方女性歷來崇尚以白為美，當(dāng)今很多男士也對(duì)美白不懈追求，因此，美白類產(chǎn)品層出不窮，成為了關(guān)注的熱點(diǎn)。然而，在追求美白的同時(shí)，應(yīng)避免副作用的發(fā)生，更要有一定治療作用。由于痤瘡、粉刺、脫發(fā)、齲齒等很大程度是微生物引起的，本研究考查了訶子、蘇木、紫草等具有抑菌活性的中藥的美白活性。將來可將美白藥與抑菌中藥組成復(fù)方并制成適宜的劑型，具有廣闊的市場前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?張智萍.川芎美白活性成分的提取分離及在化妝品中的應(yīng)用研究[D].廣州：廣東藥學(xué)院，2014.

[2] ?周婷婷，蔡曌穎，潘宇，等.中藥美白保濕面膜的制備及性能評(píng)價(jià)[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2019，42（9）：30-33.

[3] ?任宇，張石琳，鄒征云.中藥單體對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)酪氨酸酶活性的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2018，26（11）：1663-1667.

[4] ?袁陽明，黎靜雯，宋鳳蘭，等.復(fù)方甘草美白保濕霜的制備[J].廣州化工，2017，45（12）：71-74.

[5] ?穆丹丹，侴桂新.15種中藥活性單體化合物對(duì)酪氨酸酶抑制作用研究[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2019，19（70）：153-154.

[6] ?任宇，張石琳，鄒征云.中藥單體對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)酪氨酸酶活性的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2018，26（11）：1663-1667.

[7] ?楊涪，李明春.我國已上市的小分子酪氨酸激酶抑制劑研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2017，33（3）：267-271.

[8] ?國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[9] ?張蓓蓓，徐琨，王昌，等.傳統(tǒng)中藥及植物美白成分作用機(jī)理及其在化妝品中的應(yīng)用[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2015， 36（10）：73-75.

[10] ?葛媛，謝若男.活血化瘀、補(bǔ)氣血方劑在現(xiàn)代化妝品中的應(yīng)用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2018，14（3）：103-107.

[11] ?歐喜燕，于秀華.白芷美白液體外抑制酪氨酸酶活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：960-961.

[12] ?陳美君，劉珈羽，李峰慶，等.中藥白及抑制酪氨酸酶及清除DPPH自由基的有效部位篩選及其制備工藝考察[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（2）：15-19.