棘孢木霉揮發(fā)性次級代謝產(chǎn)物檢測及抑菌活性分析

陶玲蕓，張怡雯，李雅乾,2，羅來鵬，張曾魯，陳捷,2

1 上海交通大學 農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240

2 上海交通大學 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (南方) 重點實驗室，上海 200240

木霉 (Trichodermaspp.) 是一類具有重要的生防價值的絲狀真菌，其抗逆性強，至少對18個屬20余種病原真菌和多種病原細菌有拮抗作用，已有數(shù)種木霉 (深綠木霉Trichoderma atroviride、哈茨木霉Trichoderma harzianum、綠色木霉Trichoderma viride等) 商業(yè)化用于防控根腐病、枯萎病、菌核病和紋枯病等植物病害，均取得了顯著的防效[1-2]。

研究表明，木霉菌在重寄生過程中，分泌多種細胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶和蛋白酶等，并產(chǎn)生豐富多樣具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物，如聚酮類和抗菌肽類物質(zhì)，通過酶與抗菌物質(zhì)協(xié)同增效防治植物病害[3-4]?；蚪M測序證實了木霉包含近 40個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，其中聚酮合酶 (PKS) 和非核糖體肽合成酶 (NRPS) 分別負責合成聚酮類化合物如吡喃酮以及非核糖體肽類物質(zhì)如 Trichorzianines A和 B、Atroviridin_A、Trichotoxin_A-40等[5-6]。這些揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物在病害防治中發(fā)揮重要作用。

6-正戊基-2H-吡喃-2-酮 (6-PAP) 是一種木霉產(chǎn)生的吡喃酮類揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，散發(fā)椰子香味，具有廣譜抗菌活性，對尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea等多種植物病害表現(xiàn)出很強的拮抗活性[7-9]。6-PAP最早從綠色木霉中分離出來，隨后在多種木霉中被檢測到[10]。研究表明6-PAP來源于脂肪酸亞油酸的氧化，盡管哈茨木霉中6-PAP主要合成步驟已經(jīng)被闡明，但其生物合成途徑中關(guān)鍵酶仍待鑒定。6-PAP除了能抑制真菌的生長，還可以降低串珠鐮孢菌中鐮孢菌酸和禾谷鐮孢菌中脫氧雪腐鐮孢菌烯醇的產(chǎn)量[11-12]。此外，Vinale 等研究表明6-PAP對豌豆、番茄和油菜具有類似生長素的作用，即在低濃度下促進植物生長而在較高濃度時會抑制植物生長[13]。因此，6PAP具有低毒性、環(huán)境相容性等特點，成為開發(fā)新型生防殺菌劑的優(yōu)選產(chǎn)品。

棘孢木霉的生長速度快和代謝產(chǎn)物多樣性的優(yōu)勢引起研究者更多關(guān)注[14-15]。本研究基于實驗室前期分離鑒定獲得的12株棘孢木霉，通過比較不同棘孢木霉拮抗尖孢鐮孢菌的特性，確定2株木霉菌ZJSX5003和GDFS1009具有較好的拮抗性，進一步利用頂空固相微萃取 (Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME) 和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS) 測定了其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，從代謝角度闡明該棘孢木霉的優(yōu)良拮抗特性，為棘孢木霉菌劑在生防領域的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

木霉：實驗前期從浙江省紹興市的不同農(nóng)作物 (蘿卜、四季豆、絲瓜、青菜、番薯) 黑壚土土壤中分離出了6株木霉，通過形態(tài)和分子鑒定(ITS和tef1-α) 確定6株棘孢木霉T.asperellum，分別為 ZJSX1003、ZJSX4002、ZJSX5001、ZJSX5002、ZJSX5003、ZJSX5008。從廣東省佛山 (生菜、雞毛菜、羅漢果、白菜、絲瓜) 等灌淤土壤中分離到的菌株，通過形態(tài)和分子鑒定(ITS和 tefl-α) 確定 6株棘孢木霉，分別為GDFS1009、GDFS1010、GDFS2001、GDFS2011、GDFS2012、GDFS5201。12株棘孢木霉均保存在上海交通大學木霉保藏中心 (http://www.china-cctc.org/ClassificationKnow.aspx)。

病原菌：尖孢鐮孢菌 (F. oxysporum)，由上海交通大學植物病理學實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)。配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15–20 g，蒸餾水1 000 mL。自然pH。液體培養(yǎng)基 (PD)：成分同PDA，去除瓊脂。培養(yǎng)基121 ℃，15 min滅菌后備用。

菌株的活化及形態(tài)觀察：將尖孢鐮孢菌和棘孢木霉分別接種在PDA新鮮培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)，定期拍照記錄菌落形態(tài)。

1.2 木霉拮抗尖孢鐮孢菌平板對峙實驗

活化后的 12株棘孢木霉分別和尖孢鐮孢菌在新鮮PDA培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)。對照組：以單獨培養(yǎng)的病原菌作為陰性對照，單獨培養(yǎng)的木霉菌做陽性對照，28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行無光培養(yǎng)，培養(yǎng)期間觀察、拍照并測量和記錄尖孢鐮孢菌落的半徑，計算抑制率。

抑制率的計算公式：抑制率=(C-T)/C×100%。其中，C為對照組尖孢鐮孢菌的半徑，T為實驗組尖孢鐮孢菌的半徑。

1.3 棘孢木霉抗生性次級代謝產(chǎn)物提取和鑒定

木霉菌分生孢子中抗生物質(zhì)的提?。耗久咕兓?，接種在 PDA 平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)6 d，待分生孢子長滿后，用干凈已滅菌的藥匙小心地刮下平板表面的孢子，常溫下干燥孢子至恒重，待用。代謝產(chǎn)物提取方法參考文獻[16]。

GS-MS分析：采用 GS-MS對提取物成分展開分析，儀器型號為美國 Perkin Elmer公司AutoSystem XL GC/TurboMass MS，色譜柱為DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；參數(shù)設置為：柱溫50 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；進樣溫度為280 ℃；離子源為 EI，電子能量為70 eV；離子源溫度為200 ℃；接口溫度為260 ℃；質(zhì)量掃描范圍為33–500 amu；光電倍增管電壓450 V；汽化室溫度為300 ℃；載氣為氦氣 (99.999%)；分流比為無分流；進樣量為 1 μL。

1.4 頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測定揮發(fā)性代謝產(chǎn)物

將菌株ZJSX5003和GDFS1009接種在PD液體培養(yǎng)基上，在 28 ℃、170 r/min搖床上培養(yǎng)7 d，取發(fā)酵液，首先將固相微萃取 (SPME) 針頭插入氣相色譜儀的進樣口，推出萃取頭，在氦氣流中260 ℃老化20 min， 然后將萃取頭縮回保護針管，立即將SPME針頭插入頂空瓶中，推出萃取頭，萃取揮發(fā)性物質(zhì)30 min，再將SPME針頭插入氣相色譜儀的進樣口，推出萃取頭，解吸附30 s，隨后取出SPME進樣手柄和萃取頭[17]。

固相微萃取 (SPME) 實驗條件，用 DB-wax型毛細管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 分離揮發(fā)性物質(zhì)，載氣為氮氣，流速為1 mL/min，不分流模式。升溫程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃ /min升至 220 ℃，以 20 ℃/min升至 250 ℃，保持2.5 min；接口溫度260 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電離方式：EI+，70 eV；掃描方式：全掃描；質(zhì)譜范圍：20–400 amu；NIST 2014譜庫。

GC-MS結(jié)果分析：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行定性分析，利用 NIST2014譜庫并結(jié)合計算機檢索技術(shù)，對化學成分進行分離鑒定，應用氣相色譜峰面積歸一化法測定各成分的相對含量。

1.5 6-PAP平板抑菌試驗

分別將6-PAP配成3個不同濃度 (20、50和100 mg/L) 的溶液，用乙酸乙酯作為溶劑，比較3個濃度下，6-PAP在PDA平板對尖孢鐮刀菌生長的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉形態(tài)差異比較

12株棘孢木霉分別接種PDA平板，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌株表型差異。由圖1A看出6株棘孢木霉生長各異，ZJSX5001、ZJSX5002和ZJSX5003生長相對較快，菌絲致密，產(chǎn)生黃色或綠色色素，而 ZJSX4002生長得最慢。其中ZJSX5001形成的孢子數(shù)量顯著多，并產(chǎn)生綠色色素，而 ZJSX5008的菌絲發(fā)達，但孢子數(shù)量少，產(chǎn)生的綠色或者黃色色素極少。圖1B中的6株棘孢木霉菌落生長迅速，其中 GDFS2012、GDFS1009生長較快，孢子數(shù)量較多，有綠色色素產(chǎn)生，GDFS1009、GDFS2001、GDFS2011、GDFS2012的菌絲成羊絨狀的氣生菌絲，GDFS1010、GDFS5201的菌絲成氈狀的氣生菌絲，產(chǎn)孢量較低。

2.2 棘孢木霉對尖孢鐮孢菌的抑菌效果

按照經(jīng)典的平板對峙培養(yǎng)方法，12株棘孢木霉分別與尖孢鐮孢菌在 PDA平板對峙培養(yǎng)，圖2A結(jié)果表明，與生長速度接近的ZJSX5001、ZJSX5002菌株相比，ZJSX5003具有更好的抑制病原菌生長能力，抑菌效果最差的是ZJSX5008，該菌株屬于產(chǎn)絲型棘孢木霉。圖 2B的平板對峙中顯示菌株GDFS2012和GDFS1009生長速度快，產(chǎn)孢量多，具有較好的拮抗效果。進一步測定抑菌率，如圖 3所示，ZJSX5003的抑菌率達到72.58%，GDFS1009抑菌率高達74.19%。

2.3 棘孢木霉的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物組成

圖1 棘孢木霉在PDA平板上菌落表型差異比較Fig. 1 Comparison of colony phenotypes of different T. asperellum on PDA plates. Strains isolated from Shaoxing,Zhejiang Province (A) and Foshan, Guangdong Province (B) inoculated on PDA at 2 d and 5 d culture were shown.

采用 GC-MS分析棘孢木霉 ZJSX5003和GDFS1009中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類，結(jié)果如表 1所示。菌株 ZJSX5003 孢子提取物內(nèi)共檢測到70多種化學成分：其中烷烴類 (Alkanes) 數(shù)量最多為31種，其他成分為萜烯類 (Terpenes)、羧酸及其衍生物類 (Carboxylic acids and derivatives)、聚酮類 (Polyketides)、含氮及雜環(huán)化合物(Nitrogen heterocyclic compounds) 等，其中萜烯類的總相對含量較高，為22.18%，其次是烷烴類化合物 (21.18%)、羧酸及其衍生物 (18.42%)、聚酮類 (3.84%)，與之相比，GDFS1009菌株中含羧酸及其衍生物含量45.09%，含氮及雜環(huán)化合物含量14.4%，明顯高于菌株ZJSX5003，但是烷烴類(15.30%) 和聚酮類 (1.15%) 明顯低于ZJSX5003菌株，且沒有檢測到萜烯類物質(zhì)。因此不同地域來源木霉，盡管都屬于棘孢木霉，其代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量存在明顯差異。

2.4 頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法測定代謝產(chǎn)物

圖2 棘孢木霉與尖孢鐮孢菌的平板對峙Fig. 2 Plate confrontation test of different T. asperellum and F. oxysporum. Strains isolated from Shaoxing, Zhejiang Province (A) and Foshan, Guangdong Province (B) antagonism against F. oxysporum. Both T. asperellum and F.oxysporum are as positive and negative control.

圖3 不同棘孢木霉對尖孢鐮孢菌抑制率Fig. 3 Inhibition rate of different T. asperellum to F. oxysporum.

表1 棘孢木霉ZJSX5003和GDFS1009在PDA平板培養(yǎng)6 d孢子中次級代謝物含量Table 1 Antibiotic secondary metabolites in Trichoderma asperellum ZJSX5003 and GDFS1009

表2 ZJSX5003和GDFS1009的揮發(fā)性次級代謝產(chǎn)物成分分析Table 2 Analysis of volatile secondary metabolite compositions of ZJSX5003 and GDFS1009

利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分別檢測其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物 (表2)，通過對GC-MS譜圖的NIST14譜庫搜索和人工解析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZJSX5003和GDFS1009有6種相同的揮發(fā)性代謝物，分別是異丁醇、異戊醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇和 6-正戊基-2H-吡喃-2-酮(6-PAP)。其中，異丁醇、異戊醇、3-羥基-2-丁酮在 ZJSX5003中的相對含量較高，異戊醇的含量高達14.61%。3-甲基-3-丁烯-1-醇、2,3-丁二醇和6-正戊基-2H-吡喃-2-酮 (6-PAP) 在 GDFS1009 中相對含量較高。異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇這3種醇類物質(zhì)在兩株菌中的含量都比較高。ZJSX5003特有的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物有9種，分別是三氯甲烷、2-丁烯醛、5-庚烯-2-酮、(3E,5E)-3,5-庚二烯-2-酮、2,4-己二烯酸乙酯、5-甲基-2-異丙烯基-苯酚、β-倍半水芹烯、苯乙醇、4,8-二甲基-1-(1-甲基乙基)-螺[4.5]癸-8-烯-7-醇。GDFS1009特有的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物有4種，分別是3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃、3-乙基環(huán)戊酮、3-乙基-2-環(huán)戊烯-1-酮。因此，兩株菌中共同檢測到的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要是醇類和酮類。

2.5 6-PAP抑菌試驗

為了驗證吡喃酮6-PAP對尖孢鐮孢菌的抑菌效果，配置3種不同濃度 (20、50、100 mg/L)的6-PAP平板，28 ℃培養(yǎng)5 d和7 d 觀察抑菌效果(圖4)，結(jié)果表明，100 mg/L幾乎能全部抑制尖孢鐮孢菌的生長。而 20 mg/L抑制該菌的生長達到75%，說明6-PAP對尖孢鐮孢菌具有較強的抑制效果，同時我們檢測了 6-PAP對番茄灰霉病和水稻紋枯病菌，20 mg/L抑制70%以上，而100 mg/L幾乎全部抑制其生長。

圖4 三個不同濃度 (20、50和100 mg/L) 6-PAP對尖孢鐮孢菌的抑制Fig. 4 The inhibition effects of 6-PAP with different concentration (20、50 and 100 mg/L) on F. oxysporum at 5 d culture (A) and at 7 d culture (B) in vitro.

3 討論

本研究比較了 12株棘孢木霉對尖孢鐮孢菌的抑制作用，結(jié)果表明，廣東省佛山市分離的棘孢木霉總體拮抗活性優(yōu)于浙江省紹興市分離的棘孢木霉，其中菌株ZJSX5003和GDFS1009均具有較好的拮抗活性，抑菌率分別達73%和74%。表型和代謝產(chǎn)物分析結(jié)果表明，ZJSX5003和GDFS1009二者生長速度較快、菌絲豐富致密、產(chǎn)孢量大，其代謝產(chǎn)物種類豐富，其中ZJSX5003分泌更多的是萜烯類、聚酮類、醇類等抑菌活性物質(zhì)，而GDFS1009分泌的代謝產(chǎn)物主要是羧酸及其衍生物、含氮雜環(huán)類化合物和烷烴類化合物。

本研究利用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法在棘孢木霉GDFS1009 和ZJSX5003中檢測揮發(fā)性代謝產(chǎn)物包括 6-PAP，進而通過體外抑菌試驗證明6-PAP在抑制尖孢鐮孢菌的抑制中發(fā)揮重要作用。Stoppacher等利用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法，鑒定深綠木霉含有的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要分為醇類、酮類、烷烴類、呋喃類以及具有生物活性的 6-戊基-α-吡喃[18]。Henryk等研究表明幾乎所有的深綠木霉都能檢測到分泌 6-PAP，不同木霉產(chǎn)6-PAP具有菌株水平的差異性，而非種水平的差異。6-PAP的濃度2 μg/plug基本完全抑制培養(yǎng)5 d的鐮孢菌的生長。40 μg/plug的6-PAP能夠完全抑制鐮孢菌從培養(yǎng)第 5–18天的生長[19]。Cooney等研究證實木霉產(chǎn)生的6-PAP能夠抑制鐮孢菌菌絲生長和單端孢真菌毒素 (DON) 的形成[12]。El-Hasan 等證實 6-戊基-α-吡喃酮抑制鐮孢菌的鐮孢菌酸合成[21]。6-PAP不僅具有抑菌活性，還能促進小麥種子萌發(fā)，增加番茄根系的長度[22]。

本研究表明棘孢木霉揮發(fā)性次級代謝產(chǎn)物具有明顯拮抗作用，其中6-PAP拮抗尖孢鐮孢菌效果顯著，未來可以作為新型生防菌劑的潛在候選者，通過遺傳和生物工程手段提高棘孢木霉6-PAP的含量，發(fā)展以6-PAP代謝產(chǎn)物為主要成分的木霉生防菌劑，應用于植物病害防治的生產(chǎn)實踐中。