芥菜HDA9突變體構(gòu)建及其與開花整合子SOC1、AGL24啟動子互作

張俊利，蔣煒，李晟男，周雯文，王志敏，魏大勇，王鶴冰，湯青林

1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400715

2重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，重慶401329

芥菜 (Brassica junceaCoss.) 是十字花科重要蔬菜作物，開花時間提前或延遲，不僅影響產(chǎn)品器官的產(chǎn)量和品質(zhì)，還會影響品種選育進程。因此，有關(guān)芥菜抽薹開花調(diào)控研究一直是科研工作者關(guān)注焦點。開花時間受光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑和自主途徑等調(diào)控。Histone deacetylase 9 (HDA9) 屬于去乙?；讣易?HDACs) 之中RPD3/DAD1亞家族成員，具有典型的組蛋白去乙?；附Y(jié)構(gòu)域，其酶活性的發(fā)揮需要 Zn2+的存在[1-2]。HDACs在植物開花調(diào)控、防御反應(yīng)和逆境適應(yīng)等多個發(fā)育事件中起著至關(guān)重要的作用[3]。去乙酰酶基因HDA9在擬南芥莖尖、花蕾和種子中表達量較高[4-5]。

HDA9基因參與擬南芥開花時間控制[6]，轉(zhuǎn)基因超量表達HDA9會延遲植株開花時間，而其功能缺失則提前開花[4]。HDA9可逆地調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?。擬南芥HDA9通過介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)來抑制 Flowering locus T (FT) 上游激活因子Agamous-like 19 (AGL19) 的活性，從而延遲短日照條件下植株的開花時間[4]。FT編碼蛋白是成花素因子，主要在葉片中合成，通過篩管運輸?shù)角o頂端分生組織 (SAM)，促進開花[7-9]。由此說明：FT促進開花的功能受到HDA9的調(diào)控。另外，Suppressor of overexpression of constans 1 (SOC1) 和Agamous-like 24 (AGL24) 是MIKC型轉(zhuǎn)錄因子[10-11]，可促進花分生組織形成，也可調(diào)節(jié)開花時間[12]，它們和 FT均是開花信號整合子[11,13-14]。那么，SOC1和AGL24的開花促進作用是否也受去乙?；?HDA9的調(diào)節(jié)？彼此之間精細的分子調(diào)控機制如何？

本實驗室最近發(fā)現(xiàn)芥菜HDA9不能直接作用于SOC1和AGL24蛋白，但可與SOC1和AGL24的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)開花[5]。然而，芥菜 HDA9蛋白究竟依靠哪些氨基酸位點調(diào)節(jié)該蛋白-DNA相互作用來參與開花調(diào)節(jié)，目前仍不清楚。

HDACs是典型的含Zn2+酶，前人研究表明，在人體中有 3個氨基酸 (D178、H180和 D267)負責(zé)螯合HDAC8的活性位點Zn2+，它們中任何一個發(fā)生突變都會影響去乙?；傅幕钚訹15-16]。將這3個氨基酸突變?yōu)楸彼?，會?dǎo)致該去乙酰化酶的活性完全喪失，說明它們是調(diào)節(jié)該去乙?；腹δ艿年P(guān)鍵氨基酸位點[17]。這些氨基酸位點在去乙酰化酶家族中高度保守。與此類似，另一個去乙?；窰istone deacetylase 5 (HDA5) 中這3個位點 (D198、H200和D291) 突變后也會喪失功能[17]。本研究中通過序列比對發(fā)現(xiàn)，芥菜HDA9的這 3個氨基酸活性位點分別在第 172、174、261位。那么，這些位點突變是否可改變它與開花整合子SOC1、AGL24啟動子的相互作用，迄今未見報道。為此，本研究分別構(gòu)建芥菜 HDA9中這 3個位點的突變體 HDA9D172A、HDA9H174A和 HDA9D261A，利用酵母單雜交系統(tǒng)和雙熒光素酶系統(tǒng)分析HDA9突變體與SOC1、AGL24啟動子的相互作用。這為深入解析去乙?；?HDA9調(diào)控開花時間的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料芥菜“QJ”和本氏煙來源于重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室，種植于RXZ型人工氣候箱。

高保真酶EasyPfuDNA Polymerase由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；質(zhì)粒提取試劑盒以及膠回收純化試劑盒由OMEGA公司提供。酵母菌株 Y1HGold、酵母單雜交質(zhì)粒 (pGADT7、pAbAi、p53-AbAi) 和 Aureobasidin A (簡稱 AbA)均購自 Clontech公司。農(nóng)桿菌菌株GV3101、雙螢光素酶載體 pGreenⅡ62-SK、pGreenⅡ0800-LUC和pSoup由本實驗室保存并提供。芥菜SOC1啟動子、AGL24啟動子的酵母融合載體pAbAi-SOC1和pAbAi-AGL24及其酵母轉(zhuǎn)化菌液均由實驗室保存并提供。

1.2 芥菜HDA9的序列分析與突變體構(gòu)建

NCBI搜索HDAC家族成員hsHDAC8以及擬南芥 HDA2、HDA5、HDA6、HDA15、HDA18和 HDA19 (GenBank登錄號分別為：NC_000023.11、NC_003076.8、NC_003076.8、NC_003076.8、NC_003074.8、NC_003076.8 和NC_003075.7)。DNAMAN軟件氨基酸序列比對，尋找HDAC家族保守的活性位點。

以芥菜cDNA為模板，以FHDA9/RHDA9(表1)為引物擴增目的片段HDA9，膠回收并連接克隆載體，經(jīng)過 PCR檢測、雙酶切鑒定和測序驗證后提取質(zhì)粒。以連接HDA9基因的克隆載體為模板，利用重疊延伸PCR技術(shù) (表2)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收第一、二輪目的片段產(chǎn)物，并等量混合作為模板進行第三輪 PCR，回收目的片段并篩選陽性克隆，測序鑒定并提取質(zhì)粒備用。

表1 實驗所用引物[18]Table 1 Primers used in this study[18]

表2 HDA9突變體構(gòu)建[18]Table 2 Mutant construction of HDA9 in Brassica juncea[18]

1.3 HDA9突變體酵母載體構(gòu)建

用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切上述突變體質(zhì)粒及酵母表達載體 pGADT7，然后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)T7和3′AD引物組合 (表1) PCR檢測后，提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定并送測序驗證。酵母重組質(zhì)粒分別記為 pGADT7-HDA9D172A、pGADT7-HDA9H174A和 pGADT7-HDA9D261A。芥菜SOC1、AGL24啟動子的重組質(zhì)粒pAbAi-SOC1和pAbAi-AGL24由本實驗室前期已構(gòu)建，可直接用于本研究。

1.4 HDA9突變體雙熒光素酶載體構(gòu)建

以FHDA9-SK和 RHDA9-SK為引物組合進行 PCR擴增，亞克隆芥菜HDA9突變體，并連接到雙熒光素酶表達載體 pGreenⅡ62-SK，經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切和測序驗證后分別命名為pGreenⅡ62-SK-HDA9D172A、 pGreenⅡ62-SKHDA9H174A和 pGreenⅡ62-SK-HDA9D261A。芥菜SOC1、AGL24啟動子的重組質(zhì)粒pGreenⅡ0800-LUC-SOC1和 pGreenⅡ0800-LUC-AGL24由本實驗室前期構(gòu)建，已轉(zhuǎn) GV3101菌株 (含 pSoup質(zhì)粒)，可直接用于本研究。

1.5 酵母單雜交鑒定蛋白-DNA互作

參考酵母單雜交試劑盒操作手冊，以pAbAi-SOC1、pAbAi-AGL24的 Y1HGold轉(zhuǎn)化子菌株為樣本，分別制備酵母感受態(tài)細胞。將pGADT7-HDA9D172A、pGADT7-HDA9H174A和pGADT7-HDA9D261A分別轉(zhuǎn)入上述感受態(tài)細胞，獲得酵母融合子 Y1HGold (SOC1+HDA9D172A)、Y1HGold (SOC1+HDA9H174A)和Y1HGold (SOC1+HDA9D261A)、Y1HGold (AGL24+HDA9D172A)、Y1HGold (AGL24+HDA9H174A) 和 Y1HGold(AGL24+HDA9D261A)。在 SD/Leu和 SD/Leu/AbA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3–5 d，觀察是否有菌落出現(xiàn)。同時，將p53-AbAi和pGADT7-53質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到Y(jié)1HGold作為陽性對照；將質(zhì)粒pAbAi-SOC1和pGADT7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y1HGold作為SOC1啟動子的陰性對照；將pAbAi-AGL24和pGADT7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y1HGold作為AGL24啟動子的陰性對照。按本實驗室前期分別篩選出的SOC1和AGL24啟動子在酵母平板上的AbA抑菌濃度 (分別為100 ng/mL和 350 ng/mL) 配制酵母培養(yǎng)基。將上述酵母菌液分別稀釋1倍、10倍和50倍后，點樣于SD/-Leu平板及其 AbA抗性酵母平板 SD/-Leu/AbA100或SD/-Leu/AbA350，檢測 HDA9突變體與SOC1、AGL24啟動子之間是否相互作用。

1.6 雙熒光素酶檢測蛋白-DNA互作

將載體 pGreenⅡ62-SK-HDA9D172A、pGreenⅡ62-SK-HDA9H174A、 pGreenⅡ62-SK-HDA9D261A和pGreenⅡ62-SK分別轉(zhuǎn)化GV3101菌株 (含pSoup質(zhì)粒)。單菌落經(jīng) PCR陽性鑒定后，擴大培養(yǎng)，按OD600的比值1︰9將pGreenⅡ0800-LUC-SOC1或pGreenⅡ0800-LUC-AGL24分別與pGreenⅡ62-SK-HDA9D172A、 pGreenⅡ62-SK-HDA9H174A和pGreenⅡ62-SK-HDA9D261A菌液混勻，作為實驗組。pGreenⅡ0800-LUC-SOC1或 pGreenⅡ0800-LUC-AGL24分別與pGreenⅡ62-SK-HDA9菌液按OD600比值 1︰9混勻，作為陽性對照。同樣將pGreenⅡ0800-LUC-SOC1或 pGreenⅡ0800-LUCAGL24分別與pGreenⅡ62-SK混勻后作為陰性對照。分別侵染本氏煙葉片后 60 h取樣，置于GloMax?-Multi+多功能檢測儀，測定雙熒光素酶并計算酶活性比值，SPSS軟件方差分析，LSD法多重比較，顯著性水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥菜HDA9序列分析及其突變體克隆

芥菜HDA9基因cDNA序列為1 284 bp，編碼426個氨基酸。參考Luo等將此與擬南芥HDA2、HDA5、HDA6、HDA9、HDA15、HDA18 以及hsHDAC8序列比對[17]：HDAC家族成員的酶活性位點高度保守，分別為Asp (D)、His (H) 和Asp (D)，其中芥菜HDA9的這3個位點分別位于第172位、174位和261位 (圖1)。利用重疊延伸PCR技術(shù)分別將上述位點突變?yōu)?Ala (A)，構(gòu)建芥菜 HDA9的3個突變體HDA9D172A、HDA9H174A和HDA9D261A。PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測和測序結(jié)果 (圖2) 均表明，上述 HDA9突變體構(gòu)建成功。ExPASy SWISSMODEL同源建模和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，芥菜HDA9的這3個突變體均不會改變蛋白三維空間結(jié)構(gòu)。

2.2 重組載體構(gòu)建與鑒定

將上述芥菜HDA9的3個突變體分別融合到酵母表達載體 pGADT7，構(gòu)建酵母融合質(zhì)粒pGADT7-HDA9D172A、pGADT7-HDA9H174A和pGADT7-HDA9D261A。經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定和測序表明，目的片段的序列及插入方向完全正確。此外，酵母質(zhì)粒 pAbAi-SOC1和pAbAi-AGL24為本實驗室前期構(gòu)建，可直接用于后續(xù)酵母單雜交檢測。

將芥菜HDA9的3個突變體融合到雙熒光素酶載體pGreenII 62-SK，獲重組載體pGreenⅡ62-SK-HDA9D172A、 pGreenⅡ62-SK-HDA9H174A和pGreenⅡ62-SK-HDA9D261A。經(jīng) PCR檢測正確的陽性菌落擴大培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒，然后雙酶切鑒定和測序分析，結(jié)果表明上述融合載體構(gòu)建成功。此外，pGreenⅡ0800-LUC-SOC1和 pGreenⅡ0800-LUC-AGL24載體已由本實驗室前期構(gòu)建，可直接用于后續(xù)實驗。

2.3 芥菜HDA9突變體與SOC1、AGL24啟動子酵母單雜交鑒定

本實驗室蔣煒等發(fā)現(xiàn)芥菜HDA9能與開花整合子SOC1和AGL24的啟動子相互作用[5]。但是，去乙?；窰DA9是否會利用其關(guān)鍵活性位點調(diào)控它與開花整合子的作用？為此，本研究深入檢測芥菜HDA9活性位點的一系列突變體與開花整合子的相互作用。

圖1 芥菜HDA9和擬南芥菜HDA2、HDA5、HDA6、HDA15、HDA18及人hsHDAC8催化結(jié)構(gòu)域[17]Fig. 1 The conserved catalytic sites of Brassica juncea HDA9 compared with Arabidopsis thaliana HDA2, HDA5,HDA6, HDA15, HDA18, HDA19 and human hsHDAC8[17]. The red boxes indicate three conserved amino acids that are responsible for chelating Zn2+ in hsHDAC8.

圖2 芥菜HDA9的3個突變體 (HDA9D172A、HDA9H174A和HDA9D261A) 的突變區(qū)域測序峰圖Fig. 2 Sequencing peak maps in the mutation sections of HDA9D172A, HDA9H174A and HDA9D261A. Rectangular boxes indicate the mutation sites of HDA9D172A, HDA9H174A and HDA9D261A in (A), (B) and (C), respectively.

將酵母重組質(zhì)粒 pGADT7-HDA9D172A、pGADT7-HDA9H174A和 pGADT7-HDA9D261A分別轉(zhuǎn)化到酵母獵物菌株Y1H (pAbAi-SOC1) 或Y1H(pAbAi-AGL24)，作為實驗處理組；空載體pGADT7也轉(zhuǎn)化到酵母獵物菌株作為陰性對照；質(zhì)粒pGADT7-p53轉(zhuǎn)化到Y(jié)1H (p53-AbAi) 作為陽性對照。所有處理組合、陽性對照和陰性對照均可以在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基 SD/-Leu上生長(圖3–4)，說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌，可用于后續(xù)實驗。

將上述酵母雜交菌分別稀釋 1倍、10倍和50倍后點樣于SD/-Leu/AbA抗性培養(yǎng)基進一步檢測。結(jié)果表明，Y1H (SOC1+HDA9D172A)、Y1H(SOC1+HDA9H174A) 和Y1H (SOC1+HDA9D261A)均能在 SD/-Leu/AbA100平板生長且呈現(xiàn)白色菌落；陽性對照Y1H (p53-AbAi+pGADT7-53) 也可在該平板長出白色酵母菌；但陰性對照不能生長(圖 3)。由此說明突變體 HDA9D172A、HDA9H174A和HDA9D261A仍能夠與開花整合子SOC1的啟動子相互作用。

圖3 芥菜HDA9突變體與SOC1啟動子酵母單雜交Fig. 3 Interaction identification between SOC1 promoter and HDA9 mutants via yeast one-hybrid. Growth of the fusion yeast strain with different dilutions on the defect medium SD/-Leu (A) and SD/-Leu/AbA100 (B).

圖4 芥菜HDA9突變體與AGL24啟動子酵母單雜交Fig. 4 Interaction identification between AGL24 promoter and HDA9 mutants via yeast one-hybrid. Growth of the fusion yeast strain with different dilutions on the defect medium SD/-Leu (A) and SD/-Leu/AbA100 (B).

同樣，將酵母雜交融合菌 Y1H (AGL24+HDA9D172A)、 Y1H (AGL24+HDA9H174A)、 Y1H(AGL24+HDA9D261A)以及陽性對照菌株 Y1H(p53-AbAi+pGADT7-53) 分別涂布于 SD/-Leu/AbA350平板，也都可長出白色酵母菌；但陰性對照不能生長 (圖 6)。由此表明，HDA9D172A、HDA9H174A和 HDA9D261A突變體與另一個開花整合子AGL24的啟動子仍能夠互作。

綜上分析可知，芥菜去乙酰化酶 HDA9的3個活性位點 (第172、174和261位) 突變之后并不會導(dǎo)致它與開花整合子SOC1、ALG24的相互作用消失。

2.4 芥菜HDA9突變體與SOC1、AGL24啟動子雙熒光素酶鑒定

利用雙熒光素酶系統(tǒng)進一步檢測芥菜 HDA9活性位點突變之后與開花信號整合子的作用關(guān)系，設(shè)計了雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的實驗 (圖5)。

將 pGreenⅡ62-SK-HDA9D172A、pGreenⅡ62-SK-HDA9H174A和 pGreenⅡ 62-SK-HDA9D261A分別與 pGreenⅡ0800-LUC-SOC1菌液混勻作為實驗處理組合；pGreenⅡ62-SK-HDA9和 pGreenⅡ62-SK分別與 pGreenⅡ0800-LUC-SOC1菌液混勻，作為陽性和陰性對照。結(jié)果表明，HDA9突變體組合的酶活性比值 (LUC/REN) 均極顯著高于陰性對照，但又極顯著低于HDA9未突變的陽性對照 (圖6)。由此說明，芥菜HDA9蛋白突變之后仍然能夠與開花整合子SOC1結(jié)合，但結(jié)合強度會顯著降低。

同樣，將pGreenⅡ62-SK-HDA9D172A、pGreenⅡ62-SK-HDA9H174A和 pGreenII62-SK-HDA9D261A分別與 pGreenⅡ0800-LUC-AGL24菌液混勻，浸染本氏煙，檢測酶活性及比值 (圖 7)，結(jié)果表明，HDA9D172A、HDA9H174A和 HDA9D261A均能夠與AGL24的啟動子結(jié)合，但結(jié)合強度也顯著降低。

綜上表明，芥菜HDA9第172、174和261位的氨基酸突變后，會顯著降低其與開花整合子SOC1、AGL24啟動子的結(jié)合強度。由此暗示，芥菜HDA9的這3個關(guān)鍵位點在一定程度上調(diào)節(jié)其與SOC1、AGL24啟動子的結(jié)合作用。這為基于去乙?；窰DA9調(diào)控芥菜開花時間等深入研究提供了新的突破口。

圖5 雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的實驗設(shè)計示意圖Fig. 5 Schematic diagram of experimental design of dual luciferase detection system.

圖6 芥菜HDA9突變體與SOC1啟動子作用的雙熒光素酶檢測Fig. 6 Interaction identification of HDA9 mutants and SOC1 promoter via dual luciferase system. The experiments were conducted at three replicates per experiment and the data was analyzed at P<0.01. Double stars (**) showed extremely significant differences compared with positive and negative controls.

圖7 芥菜HDA9突變體與AGL24啟動子作用的雙熒光素酶檢測Fig. 7 Interaction identification of HDA9 mutants and AGL24 promoter via dual luciferase system. The experiments were conducted at three replicates per experiment and the data was analyzed at P<0.01. Double stars (**) showed extremely significant differences compared with positive and negative controls.

3 討論

3.1 HDA9與RPD3/HDA1亞家族成員高度保守

去乙酰化酶HDACs參與基因表達、DNA修復(fù)和應(yīng)激反應(yīng)等[19]。真核生物中HDAC家族可分為 3個亞族：RPD3/HDA1 (Reduced potassium dependence 3/Histone deacetylase 1)、SIR2 (Silent information regulator 2)和 HD2 (Histone deacetylase 2)[20-21]。其中，RPD3/HDA1亞族又進一步分為3類：Ⅰ類包括HDA19、HDA6、HDA7和HDA9；Ⅱ類包括HDA5、HDA15和HDA18；Ⅲ類僅包括HDA2[3,22]。本研究克隆的芥菜HDA9屬于RPD3/HDA1亞族第Ⅰ類，與HDAC家族成員具有高度的保守性，3個關(guān)鍵活性位點與擬南芥 HDA2、HDA5、HDA6、HDA15、HDA18以及人類 hsHDAC8完全一致，分別為天冬氨酸、組氨酸和天冬氨酸，它們分別位于芥菜HDA9蛋白的第172、174和261位。

3.2 HDA9介導(dǎo)開花信號整合子調(diào)控開花時間

擬南芥HDA9基因突變后會打破種子休眠并加速種子萌發(fā)[23]，也可調(diào)節(jié)大量非生物脅迫應(yīng)答基因的表達水平[24]。擬南芥HDA9也可參與開花時間調(diào)控[4-5]。HDA9與 AHL22相互作用并調(diào)節(jié)FT基因表達，控制開花[25]。另外，開花信號整合子SOC1和AGL24整合光周期、春化等多條開花途徑。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，芥菜HDA9不能與SOC1和AGL24蛋白相互作用，但是可與其啟動子相互結(jié)合，調(diào)節(jié)開花時間[5]。此外，擬南芥hdf5突變體植株中FLC和MAF1表達增加；HDA5能夠與FLD、FVE蛋白相互作用，也能與HDA6蛋白互作[17]。HDA5和HDA6可通過調(diào)節(jié)FLC基因的表達調(diào)控開花時間[26]。在擬南芥hda5和hda6突變植株中，2個下游開花整合子FT和SOC1的轉(zhuǎn)錄水平均降低[17]。由此暗示，HDA9與HDA5、HDA6類似，通過調(diào)節(jié)開花整合子的基因表達調(diào)控開花時間。

3.3 HDA9通過其關(guān)鍵活性位點調(diào)控開花整合子

Vannini等研究表明，在人類HDAC8的3個酶活性位點中 (Zn2+螯合位點)，每一個氨基酸位點突變均會影響蛋白結(jié)合底物，因此導(dǎo)致酶活性完全喪失[16]。與此類似，擬南芥HDA5的這3個保守位點 (D198、H200、D2) 被丙氨酸替換后，體外表達的 GST-HDA5原核蛋白也會失去酶活性。由此表明 HDA5的第 198、200和 291位均為金屬離子螯合所必需[17]。Luo等對擬南芥HDA5組蛋白去乙酰酶的研究表明，它的3個保守氨基酸分別突變成丙氨酸后，失去了組蛋白去乙?；富钚訹17]。另外，在野生芥菜ALS基因突變的抗除草劑研究中，發(fā)現(xiàn)第 23號野生芥菜株系，它的ALS編碼蛋白的122位點突變成丙氨酸后，導(dǎo)致ALS酶的敏感性降低，顯示出對除草劑的抗性[27]。李素云等在人體鼻咽癌組織STGC3基因研究中，STGC3基因單堿基突變，絲氨酸突變?yōu)楸彼釙r，突變的STGC3蛋白質(zhì)不改變功能基團[28]。以上述研究為借鑒，本實驗將芥菜HDA9的3個活性位點突變成丙氨酸，并對突變體蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，芥菜HDA9的這3個突變體均不會改變蛋白三維空間結(jié)構(gòu)和親水性。本研究中利用酵母單雜交和雙熒光素酶系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，芥菜 HDA9的 3個突變體 HDA9D172A、HDA9H174A和 HDA9D261A仍然與SOC1、AGL24的啟動子結(jié)合，但是結(jié)合強度會顯著削弱。由此暗示，芥菜HDA9的第172、174和261位氨基酸能在一定程度上調(diào)控其與開花整合子的相互作用。如果將這些位點突變成疏水性且羧基解離常數(shù)接近的亮氨酸或異亮氨酸后又會如何調(diào)控開花整合子呢？或者換成其他親水或酸性氨基酸會有怎樣的生物學(xué)功能？由此可見，去乙?；窰DA9調(diào)控抽薹開花的精細作用機制仍需后續(xù)深入研究。