基于重組氧化葡萄糖酸桿菌生物合成吡咯喹啉醌

葉潤(rùn)樂(lè)，李灃，丁凡，趙振輝，陳晟，袁建鋒,2

1 浙江師范大學(xué) 行知學(xué)院，浙江 蘭溪 321100

2 浙江師范大學(xué) 浙江省野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004

在大部分細(xì)菌中，吡咯喹啉醌 (Pyrroloquinoline quinone，PQQ)是與膜結(jié)合脫氫酶相關(guān)的非常規(guī)氧化還原輔基，并以非共價(jià)結(jié)合的方式與脫氫酶相結(jié)合[1]，氧化底物并將電子直接傳遞給呼吸鏈。PQQ在生命活動(dòng)中起著重要的作用，如調(diào)節(jié)免疫[2]、清除自由基[3]、防治神經(jīng)損傷[4-5]、促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)[6-7]、應(yīng)用于生物電化學(xué)[8]、參與微生物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]等。研究表明，PQQ在許多生物過(guò)程中都參與反應(yīng)，包括作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，PQQ也被認(rèn)為是第15種維生素[10]。

PQQ廣泛存在于植物、細(xì)菌、動(dòng)物等生物體內(nèi)，但僅部分革蘭氏陰性細(xì)菌可合成PQQ，如扭脫甲基桿菌Methylobacterium extorquens[11-12]、甲基營(yíng)養(yǎng)菌Methylotrophic bacteria[13-14]、成團(tuán)泛菌Pantoea ananatis[15]、氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacter oxydans[16-17]、生絲微菌屬Hyphomicrobium[18]、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae[19]等。關(guān)于PQQ生物合成途徑的研究已有30余年，通過(guò)對(duì)不同生物PQQ合成基因進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)生物之間存在一定的差異，如M. extorquensAM1含有一個(gè)pqqABC/DE操縱子單元，其中的pqqC與pqqD為嵌套融合基因，而pqqFG基因與其他 3個(gè)基因形成另外的操縱子[20-21]；Goosen報(bào)道[22]醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobacter calcoaceticus中只有pqqABCDE基因簇，而不含有pqqF基因；Stover等報(bào)道[23]銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa中pqqABCDE基因簇與pqqF基因相互分離；而在G. oxydanse[16]和K. pneumonia[24]中均以簡(jiǎn)單pqqABCDE基因簇形式存在。然而，PQQ生物合成途徑及其代謝調(diào)控機(jī)制卻仍未完全闡明。Kleef等[18]利用13C同位素標(biāo)記物對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行跟蹤，并通過(guò)磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI) 對(duì)PQQ合成途徑進(jìn)行深入分析發(fā)現(xiàn)，Glu和Tyr是PQQ合成所需的重要氨基酸，這與pqqA基因編碼的保守肽段Glu-X-X-X-Tyr序列相符合，并提出了PQQ生物合成的Glu和Tyr縮合假說(shuō)[25]。

隨著醫(yī)藥、化妝品、保健品、環(huán)境和食品行業(yè)的發(fā)展，PQQ市場(chǎng)需求量逐年增加。目前，全球市場(chǎng)需求100多t，主要供應(yīng)商是日本的三菱瓦斯化學(xué)，另有部分通過(guò)植物提取制備PQQ，但植物含量低、提取難度高，化學(xué)合成則過(guò)程復(fù)雜、收率低、對(duì)環(huán)境易造成污染，不適于推廣。相比之下，生物法制備PQQ具有反應(yīng)條件溫和、合成過(guò)程易于控制、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)PQQ的發(fā)展方向[26]。目前，生物法合成PQQ還未見(jiàn)工業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道，主要存在的問(wèn)題是PQQ產(chǎn)量過(guò)低，生產(chǎn)成本過(guò)高。據(jù)報(bào)道[1]，一部分細(xì)菌能產(chǎn)生極少量PQQ供自身代謝所需，如惡臭假單胞菌P. putida；另外一部分如甲基利用型細(xì)菌，能產(chǎn)PQQ約2–3 mg/L，甚至有的能達(dá)幾十毫克每升。孫繼國(guó)[27]利用不同啟動(dòng)子，分別在大腸桿菌Escherichia coli和K. pneumoniae中表達(dá)5.5 kb的pqqABCDEF基因簇，并在優(yōu)化培養(yǎng)基條件基礎(chǔ)上，PQQ產(chǎn)量為1 700 nmol/L。Meulenberg等[28]在E. coli中克隆表達(dá)來(lái)源于K. pneumoniae的6.7 kbpqq基因簇，PQQ產(chǎn)量?jī)H為280 nmol/L。李盼盼[29]以G. oxydans621H作為出發(fā)菌株，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，并考察前體物對(duì)PQQ合成影響，最終PQQ產(chǎn)量為0.813 mg/L。王朝絢[30]在E. coliBL21(DE3) 中融合表達(dá)PQQ合成基因簇及信號(hào)肽pelB基因，使得PQQ產(chǎn)量提高24%，達(dá)40.73 mg/L。

綜上，人們已經(jīng)將目光投向微生物法合成PQQ，并進(jìn)行一定嘗試性研究，但目前PQQ產(chǎn)量仍然較低。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，以G. oxydanDSM2343作為研究對(duì)象，通過(guò)代謝工程手段敲除宿主菌副產(chǎn)物乙酸代謝途徑，同時(shí)強(qiáng)化宿主菌PQQ合成模塊，并對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基添加物和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提升PQQ生物合成產(chǎn)量，為PQQ高效生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)相關(guān)菌株及使用質(zhì)粒見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑

PrimeSTAR GXL DNA Polymerase套裝、LATaqDNA聚合酶套裝、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自 TaKaRa公司；無(wú)縫定向克隆試劑盒 (pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit) CU101購(gòu)自TansGene Biotech公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、抗生素 (Cefoxitin、Ampicillin sodium、Kanamycin Sulfate)及分子級(jí)別化學(xué)試劑均購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；酵母抽提物和蛋白胨，購(gòu)自 Oxoid公司；PQQ標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；PCR引物 (表2) 合成及測(cè)序均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

表1 本研究相關(guān)菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this work

表2 本研究相關(guān)引物Table 2 Primers used in this work

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10 (固體平板加入1.5%瓊脂粉)，pH自然。

MP培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨3，酵母提取物5，甘露醇 25 (固體平板加入 1.5%瓊脂粉)，pH 6.0。

PQQ發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖5，酵母粉2，(NH4)2SO40.5，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.5，pH 6.5。

大腸桿菌用LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)；氧化葡萄糖酸桿菌選用 MP培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。

所有培養(yǎng)基或固體平板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入相應(yīng)的抗生素 (抗生素工作濃度 Amp 100 μg/mL，Cef 50 μg/mL，Kan 50 μg/mL)。

1.2 方法

1.2.1 分子生物學(xué)操作方法

基本分子生物學(xué)操作均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 (第四版)》[31]進(jìn)行。

1.2.2 敲除質(zhì)粒pDGOX1081的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中公布G. oxydans621H基因組 (NC_006677) 信息設(shè)計(jì)引物，以G. oxydansDSM2343基因組為模板，1081_HindⅢ_F/1081_Fus_R和 1081_Fus_F/1081_SalⅠ_R為引物，分別PCR擴(kuò)增GOX1081上游約1 072 bp、下游約1 099 bp的同源臂基因片段。以PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收上下游同源臂為模板，1081_Hind Ⅲ_F/1081_SalⅠ_R為引物，重疊PCR將上下游片段融合并克隆于 pEASY-Blunt simple質(zhì)粒，測(cè)序正確后，Hind Ⅲ和SalⅠ雙酶切回收GOX1081上下游融合片段及pJKM質(zhì)粒片段，T4 DNA酶連接線性同源臂及自殺質(zhì)粒片段，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pDGOX1081。

1.2.3 GOX1081基因敲除

敲除質(zhì)粒 pDGOX1081通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化于E. coliS17-1感受態(tài)細(xì)胞。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子E. coliS17-1/pDGOX1081和輔助菌E. coliHB101在LB培養(yǎng)基37 ℃下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8，G. oxydansDSM2343在MP培養(yǎng)基30 ℃下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，三菌以1︰1︰1的比例混合，按三親本雜交[32]的方法將敲除質(zhì)粒 pDGOX1081 轉(zhuǎn)化G. oxydansDSM2343。通過(guò)在含Cef和Kan (終濃度均為50 μg/mL) 的MP固體培養(yǎng)基上篩選獲取一次重組菌。

挑取一次重組陽(yáng)性菌單菌落，在無(wú)抗MP培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；取適量菌液，在含有10%蔗糖和50 μg/mL Cef抗生素的MP平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)3 d后長(zhǎng)出單菌落，即為二次重組菌。選用1081_Seq_F/1081_Seq_R為引物，采用菌落PCR鑒定篩選GOX1081基因敲除的陽(yáng)性重組菌，并命名為G. oxydansT1。

1.2.4 PQQ合成模塊強(qiáng)化重組菌的構(gòu)建

以G. oxydansDSM2343基因組為模板，Add_0169_F/pqq_Fuse0169_R、pqq_Fuse0169_F/0169_Fusepqq_R、0169_Fusepqq_F/tldD_Fuse0169_R及tldD_Fuse0169_F/Add_tldD_R為引物，PCR分別擴(kuò)增第1個(gè)內(nèi)源性啟動(dòng)子P0169、pqqABCDE基因簇、第2個(gè)內(nèi)源啟動(dòng)子P0169和tldD基因片段，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收相應(yīng)基因片段。穿梭表達(dá)質(zhì)粒pUCpr經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalⅠ處理后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收pUCpr線性質(zhì)粒片段。所有基因片段按全式金無(wú)縫定向克隆試劑盒要求操作，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒 pUCpr-1。經(jīng)測(cè)序正確后，pUCpr-1電穿孔轉(zhuǎn)化G. oxydansT1感受態(tài)細(xì)胞。采用 GenePulser Bacteria Ⅱ預(yù)設(shè)程序(2.5 kV，200 ?，25 μF) 進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，時(shí)間常數(shù)在 4.5–5 ms。電擊后經(jīng) 30 ℃、220 r/min預(yù)培養(yǎng)4–6 h，并涂布于含有 100 μg/mL Amp 及 50 μg/mL Cef抗生素的MP平板培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，獲取陽(yáng)性重組菌G. oxydansT2。

1.2.5 生物量及PQQ檢測(cè)

分光光度法測(cè)定培養(yǎng)液濁度OD600，并通過(guò)細(xì)胞干重DCW建立線性對(duì)應(yīng)關(guān)系DCW=0.353 5×OD600+0.120 4，R2= 0.999 7計(jì)算生物量。

發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)離心、0.22 μm膜過(guò)濾等預(yù)處理后，采用課題組建立的HPLC測(cè)定PQQ含量[33]。HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相為甲醇︰水 (含0.06 mol/L磷酸)=7︰3，流速0.5 mL/min，色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18，進(jìn)樣量 10 μL，柱溫 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，PQQ保留時(shí)間為6.8 min。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=77.677 7X–841.166 4，R2=0.999 1由峰面積計(jì)算PQQ濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 GOX1081基因敲除

G. oxydansDSM2343中，GOX1081基因編碼丙酮酸脫羧酶 (Pyruvate decarboxylase)，催化丙酮酸脫羧形成乙醛，進(jìn)一步通過(guò)依賴于 NADP+的乙醛脫氫酶作用，產(chǎn)生乙酸。2013年，Peters等[34]證實(shí)G. oxydansDSM2343中副產(chǎn)物乙酸的代謝主要與GOX1081相關(guān)。

在GOX1081無(wú)痕敲除過(guò)程中，pJKM 含有RP4基因[35]，能高效指導(dǎo)同源重組，使得pDGOX1081整合到宿主基因組。同時(shí)，pJKM攜帶有sacB基因，其編碼分泌型蔗糖果聚糖酶(Levansucrase)，催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且將果糖聚合成高分子量的果聚糖。高分子量果聚糖積累對(duì)細(xì)胞存在潛在的毒性作用，可造成細(xì)胞死亡，從而引入反向篩選壓力。因此，在含10%的蔗糖平板上培養(yǎng)，可以獲取二次同源交換重組菌，產(chǎn)生目標(biāo)基因被敲除或者回復(fù)為野生型兩種表型[36]。結(jié)果如圖 1所示，在篩選的 23株突變菌株中，有7株產(chǎn)生陽(yáng)性突變，即GOX1081基因被敲除，而16株回復(fù)為野生型，即通過(guò)pJKM介導(dǎo)的同源臂敲除，二次重組成功率約為30.43%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，以sacB基因介導(dǎo)的無(wú)痕重組敲除效率較低，使得二次篩選工作繁瑣，如pK18mobsacB和pK19mobsacB。而pJKM中，在sacB基因的上游插入Ptac雜合啟動(dòng)子，從而增強(qiáng)sacB基因的表達(dá)，提高宿主反向篩選壓力，增加二次重組發(fā)生幾率。

2.2 PQQ合成模塊融合表達(dá)

通過(guò)全式金無(wú)縫定向克隆試劑盒，構(gòu)建P0169啟動(dòng)子、pqqABCDE基因簇及tldD基因融合表達(dá)質(zhì)粒pUCpr-1，并轉(zhuǎn)化獲取重組菌G. oxydansT2。廣宿主表達(dá)質(zhì)粒，如pBBR1MCS系列，以及tufB基因啟動(dòng)子，是氧化葡萄糖酸桿菌中常用的表達(dá)調(diào)控元件。pBBR1MCS系列屬于組成型表達(dá)系統(tǒng)，蛋白表達(dá)量較低。本實(shí)驗(yàn)用pUCpr載體為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，具有 pUC19遺傳特性和G. oxydansDSM2343內(nèi)源質(zhì)粒片段 Par-Rep蛋白基因。Rep蛋白是質(zhì)粒復(fù)制蛋白，Par蛋白則與紡錘絲的動(dòng)力機(jī)制有關(guān)，起著調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制的作用[25]，因此，pUCpr為大腸桿菌及氧化葡萄糖酸桿菌的穿梭表達(dá)質(zhì)粒，具有較高的表達(dá)量。P0169啟動(dòng)子大小104 bp，其中-35 (TTGGTA) 及-10 (TATAAC) 區(qū)域?yàn)镋. coliσ70和枯草芽孢桿菌B. subtilisσ43識(shí)別位點(diǎn)，且其間隔序列為 19 bp，這與E. coli((17±1) bp) 和B. subtilis((18±1) bp) 非常相似(圖2)，說(shuō)明P0169啟動(dòng)子在Gluconobacter中具有強(qiáng)的啟動(dòng)活性[37]。

圖1 菌落PCR篩選GOX1081基因敲除Fig. 1 Screening for G. oxydans DSM2343 GOX1081 deletion mutants. M: 10 000 marker; C: control.

圖2 P0169啟動(dòng)子序列Fig. 2 Schematic representation of the P0169 promoter sequence.

另外，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，G. oxydans中tldD基因與大腸桿菌中tldD有51%的同源性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，tldD基因與PQQ合成相關(guān)，功能類(lèi)似于其他PQQ合成生物中的pqqF基因[25]，可有效提升PQQ的合成[16]。

2.3 不同重組菌生物合成PQQ

對(duì)野生菌、重組菌G. oxydansT1及G. oxydansT2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別考察發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間段的生物量和 PQQ產(chǎn)量，結(jié)果如圖 3所示。GOX1081基因的敲除，切除了乙酸代謝途徑[34]，發(fā)酵48 h后，重組菌G. oxydansT1及G. oxydansT2的生物量達(dá) (3.69±0.01) g/L 和 (3.58±0.01) g/L，較野生菌 ((2.58±0.02) g/L) 提高 43.02%和38.76%。G. oxydansT2中表達(dá)了PQQ合成模塊的基因，其生物量較重組菌G. oxydansT1略有降低。以上結(jié)果說(shuō)明副產(chǎn)物乙酸是影響氧化葡萄糖酸桿菌的生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[34]。而對(duì)于PQQ的合成，發(fā)酵48 h后，野生菌產(chǎn)量為(0.148 5±0.001 2) mg/L，重組菌G. oxydansT1和 T2的產(chǎn)量為 (0.716 5±0.001 23) mg/L和(3.058 0±0.011 2) mg/L，結(jié)果顯示，融合表達(dá)pqqABCDE及tldD基因后，可以有效提高氧化葡萄糖酸桿菌的PQQ產(chǎn)量，因此G. oxydansT2為較理想的PQQ生產(chǎn)菌株。

2.4 不同添加物對(duì)重組菌合成PQQ的影響

圖3 野生菌、重組菌G. oxydans T1及T2生物量和PQQ產(chǎn)量Fig. 3 Biomass and PQQ production of wild strain (■, □),G. oxydans T1 (●, ○) and G. oxydans T2 (▲, ?).

據(jù)文獻(xiàn)證實(shí)，Glu和Tyr是PQQ合成的重要氨基酸，與pqqA表達(dá)肽段的保守氨基酸一致[16,25]。因此考察不同濃度 Glu和 Tyr的添加對(duì)重組菌G. oxydansT2合成PQQ的影響。取配制好的50 mL搖瓶 5個(gè)，按 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L加入Glu；另取 5個(gè)搖瓶，按 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L加入Tyr，在30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測(cè)定PQQ產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖4A。當(dāng)Glu和Tyr的添加量都為4.0 g/L時(shí)，PQQ的合成量最大，隨著添加的增加反而產(chǎn)量又下降，說(shuō)明Glu和Tyr作為前體可以促進(jìn)PQQ的合成[38]，而過(guò)多濃度氨基酸的添加將影響發(fā)酵體系的 pH值和離子強(qiáng)度，從而影響PQQ的合成。在添加Glu和Tyr的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察Fe2+對(duì)PQQ合成的影響，即在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L 和 9.0 mg/L FeSO4·7H2O，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng) 48 h后測(cè)定 PQQ產(chǎn)量，結(jié)果如圖 4B所示。FeSO4·7H2O 的添加與重組菌G. oxydansT2 合成PQQ的能力具有正相關(guān)性，當(dāng)添加量為 5.0 mg/L時(shí) PQQ合成最高，達(dá)(6.673 4±0.112 4) mg/L，而隨后PQQ產(chǎn)量下降，說(shuō)明 Fe2+對(duì) PQQ的合成在一定范圍內(nèi)具有促進(jìn)作用。

圖4 不同濃度添加物 Glu、Tyr (A) 和 Fe2SO4·7H2O (B)對(duì)G. oxydans T2合成PQQ的影響Fig. 4 Effect of different additives on PQQ synthesis by G. oxydans T2. (A) Glu and Tyr. (B) Fe2SO4·7H2O.

綜合以上結(jié)果可知，不同添加物對(duì)PQQ的合成具有不同程度的影響，為進(jìn)一步明確不同添加物之間的顯著特性和交互關(guān)系，對(duì) Glu、Tyr和FeSO4·7H2O設(shè)計(jì)L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)，分別考察A：Glu添加量 (3.5 g/L，4.0 g/L，4.5 g/L)、B：Tyr添加量 (3.5 g/L，4.0 g/L，4.5 g/L) 和 C：FeSO4·7H2O(4.5 mg/L，5.0 mg/L，5.5 mg/L) 的條件下G. oxydansT2合成PQQ產(chǎn)量。由表3結(jié)果可知，從極差R值的大小可以看出各因素的主要次序是：A (Glu)>B (Tyr)>C (FeSO4·7H2O)，其中 Glu 和 Tyr是影響PQQ產(chǎn)量的主要因素，而 FeSO4·7H2O的影響較??；最佳因素水平為A2B3C1，即當(dāng)Glu添加量為4.0 g/L、Tyr添加量為 4.5 g/L、FeSO4·7H2O 添加量為4.5 mg/L時(shí)，重組菌G. oxydansT2的PQQ產(chǎn)量可達(dá) 18.392 8 mg/L。從方差分析表來(lái)看(表4)，A (Glu) 因素在培養(yǎng)基一致的條件下起最顯著作用，B (Tyr) 作用次之，而 C (FeSO4·7H2O) 在考察范圍內(nèi)對(duì)PQQ的合成影響不大。說(shuō)明PQQ的合成與Glu和Tyr有關(guān)，與PQQ縮合假說(shuō)一致[25]。

表3 不同添加物正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results of different additives

表4 方差分析表Table 4 The analysis of ANOVA

2.5 G. oxydans T2合成PQQ發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1 碳源的選擇

碳源對(duì)于氧化葡萄糖酸桿菌而言顯得比較重要，主要是氧化葡萄糖酸桿菌含有豐富的膜結(jié)合蛋白，能高效氧化多種底物，并分泌到發(fā)酵液中。比如以葡萄糖為底物，可以產(chǎn)生葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸和 5-酮基-D-葡萄糖酸，使得發(fā)酵液 pH迅速下降[39]，為此選擇合適的碳源就至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)選用果糖、蔗糖、木糖、山梨醇、甘露醇、甲醇、乙醇及甘油作為唯一碳源，添加量為0.5%，葡萄糖作為對(duì)比，其他無(wú)機(jī)鹽和前體添加物一致，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定重組菌G. oxydansT2的生物量及PQQ產(chǎn)量，結(jié)果如圖5A所示。當(dāng)以甲醇為唯一碳源時(shí)，其細(xì)胞干物質(zhì)和 PQQ產(chǎn)量為最高，分別是(4.897 6±0.223 4) g/L 和 (29.765 7±0.687 7) mg/L，較葡萄糖對(duì)照組分別提高了 37.41%和 61.83%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[25]，在G. oxydans621H中的甲醇脫氫酶以PQQ為輔助因子，同時(shí)甲醇又提供良好的能量來(lái)源。另外，G. oxydans621H中還含有山梨醇脫氫酶、甘露醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶，因此山梨醇、甘露醇及葡萄糖作為碳源時(shí)，重組菌G. oxydansT2也能較好地生長(zhǎng)。相比之下，以果糖、蔗糖及木糖為碳源時(shí)，生長(zhǎng)欠佳，推測(cè)該菌中相關(guān)代謝基因活性不高。因此，甲醇可以作為較理想的碳源用于合成PQQ。

以甲醇作為唯一碳源，考察不同濃度的甲醇(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%) 對(duì)菌體的生長(zhǎng)及PQQ合成的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5B，甲醇濃度在2.0%–3.5%范圍內(nèi)，G. oxydansT2菌體量和PQQ產(chǎn)量均逐步提升，以 3.5%的添加量為最高，分別為(5.665 4±0.351 2) g/L 和 (34.001 2±0.732 4) mg/L，而當(dāng)甲醇濃度增加到4.0%時(shí)，菌體量和PQQ均有所下降，說(shuō)明高濃度的底物對(duì)重組菌具有一定的抑制作用，導(dǎo)致合成PQQ的酶活性下降。

2.5.2 發(fā)酵條件

在優(yōu)化了前體添加物和碳源的基礎(chǔ)上，繼續(xù)考察接種量 (2%、4%、6%、8%、10%)、起始pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5) 和培養(yǎng)溫度 (26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃) 對(duì)重組菌G. oxydansT2 合成PQQ的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。接種量對(duì)PQQ的合成影響較大，當(dāng)接種量為 6%時(shí)，PQQ合成量最大，可達(dá) (45.785 6±1.176 9) mg/L；而pH對(duì)PQQ合成的影響相對(duì)小一點(diǎn)，以pH 6.5為最佳，PQQ產(chǎn)量達(dá) (48.789 4±1.223 1) mg/L；溫度對(duì)重組菌G. oxydansT2合成PQQ有一定的影響，當(dāng)培養(yǎng)溫度為 28 ℃時(shí)，PQQ合成量最大，可達(dá)(51.324 1±0.899 7) mg/L，說(shuō)明溫度對(duì)菌株內(nèi)酶的活性具有重要影響，進(jìn)而影響PQQ的合成，最終PQQ產(chǎn)量是出發(fā)菌株的345.62倍。

圖5 不同碳源 (A) 和不同甲醇濃度 (B) 對(duì)菌體生長(zhǎng)及合成PQQ的影響Fig. 5 Effect of different carbon resources (A) and methanol concentration (B) on cell growth and PQQ synthesis.

圖6 不同接種量 (A)、 不同起始pH (B) 和不同培養(yǎng)溫度 (C) 對(duì)G. oxydans T2合成PQQ的影響Fig. 6 Effect of different inoculum (A), initial pH (B)and temperature (C) on PQQ production by G. oxydans T2.

3 討論

氧化葡萄糖酸桿菌是典型的工業(yè)應(yīng)用微生物，本研究以氧化葡萄糖酸桿菌作為研究對(duì)象，通過(guò)基因工程手段，無(wú)痕敲除表達(dá)丙酮酸脫羧酶GOX1081基因，有效提高生物量 43.02%，同時(shí)PQQ產(chǎn)量提高 382.49%。說(shuō)明在G. oxydansDSM2343中，經(jīng)丙酮酸脫羧酶途徑產(chǎn)生乙酸對(duì)G. oxydans的生長(zhǎng)具有影響[34]，同時(shí)也是碳流競(jìng)爭(zhēng)影響PQQ合成的原因。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提升PQQ的合成，本研究采用強(qiáng)化PQQ合成模塊的策略在內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子 P0169下，融合表達(dá)pqqABCDE基因簇和與之合成相關(guān)的tldD基因[39]，構(gòu)建重組菌G. oxydansT2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，在內(nèi)源性啟動(dòng)子下，PQQ合成模塊的表達(dá)得到強(qiáng)化，同時(shí)也說(shuō)明菌體生物量和PQQ基因拷貝數(shù)是影響PQQ合成的關(guān)鍵因素。2016年，Wang等[40]利用廣宿主質(zhì)粒pBBR1MCS-2、pqqA啟動(dòng)子、tufB啟動(dòng)子以及tldD基因在G. oxydansWSH-003中研究單個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)對(duì)PQQ合成的影響，發(fā)現(xiàn)單個(gè)基因的作用pqqB>pqqA>pqqD>pqqC>pqqE，這也為G. oxydans合成PQQ提供了一定的借鑒。

目前，大量的代謝工程研究表明[41]，當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑表達(dá)加強(qiáng)時(shí)，產(chǎn)物與底物之間的不匹配往往也是影響最終產(chǎn)量的因素。本研究對(duì)重組菌培養(yǎng)基添加物進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果證實(shí)了這個(gè)結(jié)論，當(dāng)增加底物 Glu和 Tyr時(shí)能較大程度地提升PQQ產(chǎn)量。進(jìn)一步對(duì)碳源、接種量、起始pH、培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終重組菌G. oxydansT2的PQQ產(chǎn)量為 (51.324 1±0.899 7) mg/L，是出發(fā)菌株的345.62倍。目前，微生物合成PQQ的產(chǎn)量在100–200 mg/L左右，如Methylovorussp.和K. pneumoniae[11,13-14,40]。氧化葡萄糖酸桿菌具有大量依賴于PQQ的膜結(jié)合脫氫酶，內(nèi)源性合成PQQ一直是氧化葡萄糖酸桿菌高效催化氧化的瓶頸，因此，還有大量的工作可做，來(lái)提高氧化葡萄糖酸桿菌合成PQQ的能力。本研究利用代謝工程手段有效提高了G. oxydansDSM2343合成PQQ的能力，后期可進(jìn)一步對(duì)補(bǔ)料發(fā)酵條件進(jìn)行考察，建立 PQQ的分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝，為 PQQ的工業(yè)化生產(chǎn)做鋪墊。