生物合成3-羥基丙酸的代謝工程研究進展

詹元龍，趙瑞英，崔鴻亮，李華泰，宋志峰，劉長莉

東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040

隨著石化資源的逐步枯竭和氣候的不斷惡化，人們急需從石化經濟向生物經濟轉變。3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP) 是一種可再生生物質，在2004年更新的12種重要平臺化學品中排名第三，美國能源部將3-HP列為21世紀最具潛力的化工產品之一[1]。

3-羥基丙酸，又稱β-羥基丙酸，是一種三碳非手性的有機物分子，分子式為 C3H6O3，分子量為90.08。在化學結構上，與乳酸互為結構異構體，兩端含有一個羥基和一個羧基。3-HP的應用具有多樣化，可用作生產粘合劑、塑料包裝、纖維、清潔劑和樹脂等，也可聚合成聚 3-羥基丙酸酯(P3HP) 或含3-HP的共聚物[2]。3-HP是多種關鍵化合物的合成前體，如丙二酸、1,3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酸甲酯以及具有致癌作用的丙烯酰胺等。

3-HP的合成方法主要分為化學合成法和生物合成法。其中化學合成法生產 3-HP具有成本高、起始材料昂貴以及與環(huán)境不相容等特點。生物合成法中的天然合成途徑又面臨著遺傳背景不清晰、產量低、穩(wěn)定性差、工業(yè)生產實施困難等問題，因此利用代謝工程技術合成 3-HP已成為當今各國的研究熱點。文中對生物合成3-羥基丙酸的代謝工程研究進行概述，并對甘油途徑、丙二酸單酰輔酶A途徑以及 β-丙氨酸途徑進行詳細介紹以及優(yōu)缺點分析，最后對未來3-羥基丙酸的研究方向進行展望。

1 甘油途徑

因甘油價格低廉、來源廣泛，以甘油途徑合成3-HP已成為各國學者的研究熱點，如表1所示。其主要分為兩種途徑：輔酶A依賴途徑和輔酶A非依賴途徑[3]。在輔酶 A依賴途徑中，甘油通過輔酶B12依賴性的甘油脫水酶 (PduCDE) 轉化為3-羥基丙醛(3-HPA)，又經丙醛脫氫酶 (PduP)、磷酸轉移酶(PduL) 和丙酸激酶 (PduW) 的催化作用生成3-HP。輔酶A非依賴途徑中，甘油通過輔酶B12非依賴性的甘油脫水酶催化生成3-HPA，再利用醛脫氫酶將3-HPA氧化成3-HP。目前，國內外對甘油途徑的大部分研究都是輔酶A非依賴途徑。

表1 利用甘油途徑合成3-HP情況Table 1 Synthesis of 3-HP by glycerol pathway

在兩種途徑中，醛脫氫酶需要NAD+作為輔因子，維持NAD+輔因子再生可通過以下兩種方法解決。首先，提供氧氣的供應，增加通氣量后雖然可以維持NAD+在電子傳遞鏈中再生，但氧的存在既抑制輔酶B12的合成又對脫水酶造成失活。其次，可在3-HPA轉化為1,3-丙二醇 (1,3-PDO) 的過程中添加 NADH，利用 1,3-丙二醇氧化還原酶消耗NADH生成NAD+。

1.1 大腸桿菌作為宿主菌株

大腸桿菌E. coli作為一種模式生物，具有遺傳背景清晰、易于改造、對生長環(huán)境要求低等優(yōu)點，此外，在合成途徑中，因其自身含有醛脫氫酶基因，可在表達甘油脫水酶dhaB基因的基礎上，將合成的3-HPA氧化為3-HP。目前，以E. coli為宿主的合成途徑還存在一些問題。首先，E. coli沒有甘油脫水酶基因，需要從其他宿主菌中篩選并導入宿主細胞，宿主對酶的耐受性需要進一步研究。其次，在甘油途徑中需要輔酶 B12的供應，提高了生產成本，不利于工業(yè)生產。除此之外，甘油脫水酶與醛脫氫酶之間的平衡問題同樣需要被考慮。針對以上問題，各國學者開始篩選多種宿主菌的脫水酶以及高效的醛脫氫酶，并在調整酶之間的平衡和抑制副產物合成等方面進行研究。

以重組E. coli為宿主，利用甘油途徑合成3-HP最早被提出是在2001年，Suthers等[4]以甘油為底物，通過篩選來自不同宿主的醛脫氫酶后發(fā)現來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的醛脫氫酶活性最強、效果最佳，并利用基因工程技術將來自肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脫水酶dhaB基因以及來自S. cerevisiae的醛脫氫酶ald4基因在重組E. coli中過表達，生成0.17 g/L的 3-HP，雖然產量不高，但從此拉開了利用甘油合成3-HP的序幕。

由于甘油脫水酶的性質不穩(wěn)定，醛脫氫酶活性較低，導致兩種酶在宿主菌中不能平衡表達，使中間代謝產物3-羥基丙醛 (3-HPA) 不斷積累產生毒性，為解決此類問題，各國學者對此進行了研究。韓國 Park團隊在重組E. coli中，過表達來自K. pneumonia的dhaB基因和來自E. coli的aldH基因，搖瓶培養(yǎng)后獲得0.58 g/L的3-HP，產率為0.02 g/(L·h)[5]，之后將分批補料培養(yǎng)基進行優(yōu)化，改變物化參數使產率提高到0.43 g/(L·h)[6]。為提高醛脫氫酶的活性和甘油脫水酶的穩(wěn)定性，Rathnasingh等[7]在E. coli中導入激活因子gdrAB以及過表達來自巴西固氮菌Azospirillum brasilens中活性較高的醛脫氫酶KGSADH，產量達到38.7 g/L，產率高達1.32 g/(L·h)。之后又在9株不同耐酸的重組E. coli中同時過表達3種基因，最終在E. coliW3100和E. coliW兩種宿主菌中分別產生15.3 g/L和41.5 g/L的3-HP，解決了宿主對酸耐受程度的問題[8]。若想使產量達到新的突破，僅利用傳統技術對目的基因篩選及表達是不夠的，因此 Seok等[9]運用合成生物學技術，引入一種新型合成選擇裝置，該裝置無需昂貴的儀器或密集型的勞動程序就可以篩選出定向進化的醛脫氫酶KGSADH，將酶的催化效率提高2.79倍，最終獲得優(yōu)化的3-HP生產菌株。該裝置可作為高通量篩選工具用于設計3-HP的合成途徑，為后續(xù)研究提供一個新的思路，使代謝工程技術不只停留在基因篩選和表達等方面。

篩選高活性的醛脫氫酶可解決活性較低的問題，但一味提高醛脫氫酶活性會起到相反作用，因此只有維持酶之間的平衡表達才能使產量最大化。Lim等[10]發(fā)現可在重組宿主菌體內表達 5個非翻譯區(qū)來優(yōu)化表達水平，進而使翻譯速率形成差異，在此基礎上，通過微調dhaB1基因的表達，使酶之間活性達到平衡狀態(tài)，測試后發(fā)現4種不同的重組菌株經搖瓶培養(yǎng)后可使3-HP產量提高2.4倍，達到40.51 g/L。在此之后，Park團隊[11]通過使用核糖體結合位點 (RBS) 組成的合成調節(jié)盒來微調兩個基因之間的表達，使醛脫氫酶的表達活性提高8倍，在分批補料培養(yǎng)中產生高達56.4 g/L的3-HP，產率達到1.18 g/(L·h)，以此證明調控酶活的平衡在3-HP生產中的重要性。

在3-HP的合成過程中會伴隨著一些副產物的生成，副產物不僅能利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分促進自身生長代謝，工業(yè)生產時還涉及到產物分離困難等問題。理論上在表達高活性的醛脫氫酶以及調節(jié)酶之間平衡的基礎上，敲除副產物合成途徑中的關鍵基因可使產量得到改善。Jung等[12]敲除甘油抑制因子glpR和促進乙酸合成的ackA-pta基因以及催化3-HPA生成1,3-PDO的yqhD基因，發(fā)酵培養(yǎng)后獲得42.1 g/L的3-HP，產率達到1.32 g/(L·h)。在此之后，研究人員將高活性的醛脫氫酶與敲除副產物合成基因的方法有效結合，在重組E. coliBL21(star) 中過表達來自短乳桿菌Lactobacillus breris的dhaB-dhaR基因以及來自銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa的半醛脫氫酶PSALDH，并破壞途徑中的glpK、yqhD基因，培養(yǎng)36 h后產生57.3 g/L 3-HP，使產率提高至1.59 g/(L·h)[13]。為使醛脫氫酶的活性最大化，Chu等[14]從17種醛脫氫酶篩選出來自貪銅菌Cupriavidus necator的醛脫氫酶gabD4基因，并基于同源建模進行定點、飽和誘變，獲得的突變菌株的活性提高1.4倍，同時又對乙酸、乙醇等副產物的合成基因ackA-pta、yqhD進行敲除，最終在分批補料生物反應器中獲得71.9 g/L的3-HP，產率高達1.8 g/(L·h)，是迄今為止以E. coli為宿主利用甘油途徑合成3-HP的最高產量。但該實驗仍有可提升的空間，后續(xù)研究可在此基礎上繼續(xù)調整酶之間的表達以及篩選更合適的宿主菌使產量進一步提高。

以E. coli為宿主生產3-HP，具有遺傳背景清晰、對生長環(huán)境要求低以及可利用廉價的碳源甘油為底物等優(yōu)點，但在途徑中表達來自外源的甘油脫水酶基因、補充昂貴的輔酶 B12以及維持 NAD+再生仍然是急需攻克的問題。最近對巨大芽孢桿菌以及脫氮菌的研究顯示可通過去除基于核糖開關的反饋抑制系統來增加輔酶 B12合成，可將此引入甘油合成途徑解決輔酶B12添加的問題[15]。

1.2 肺炎克雷伯氏菌作為宿主菌株

與E. coli相比，肺炎克雷伯氏菌K. pneumoniae自身具有dhaB基因，并能夠在微氧或厭氧的條件下合成輔酶 B12，在很大程度上解決輔酶 B12添加的問題，降低了生產成本，無疑成為替代E. coli最好的選擇。但是該菌株可在醫(yī)院環(huán)境中迅速傳播而引起人類感染，引起公眾健康問題，并且其遺傳背景也并不清晰。在K. pneumoniae中，甘油途徑分為還原途徑和氧化途徑。甘油被甘油脫水酶還原生成3-HPA后，部分3-HPA繼續(xù)被還原為1,3-PDO，而另一部分3-HPA則被醛脫氫酶氧化為3-HP。利用K. pneumoniae生產3-HP的研究方向主要在關鍵酶的篩選、副產物合成基因的敲除以及高效啟動子的篩選和優(yōu)化等幾個方面。

敲除副產物合成基因并篩選高活性的醛脫氫酶能有效減少副產物生成，提高目標產物的產量。研究首先集中在抑制關鍵副產物 1,3-PDO的合成上，Ashok等[16]通過表達醛脫氫酶puuC基因，并從染色體中刪除編碼1,3-PDO氧化還原酶的dhaT基因，產生3.60 g/L的3-HP，又通過微氧分批補料培養(yǎng)獲得16.00 g/L的3-HP。之后在硝酸鹽作為電子受體的潛在用途的研究中發(fā)現該菌株在厭氧條件下可產生 22.50 g/L的 3-HP[17]，產率提高至0.45 g/(L·h)。但在菌株生長后期，乳酸的生成抑制了 3-HP的生長，使產量無法繼續(xù)提高，應通過其他技術手段進行優(yōu)化、改善和解決乳酸生成的問題。于是為抑制乳酸的形成，Jiang等[18]使用兩階段分批補料發(fā)酵技術，同時敲除乳酸和1,3-PDO的合成基因ldhA、dhaT，構建了3種代謝工程化菌株過表達來自E. coli的醛脫氫酶，通過控制通氣速率，該菌株在38 h內產生61.90 g/L的3-HP，產率提升至 0.58 g/(L·h)。兩階段分批補料發(fā)酵的使用，是3-HP培養(yǎng)技術新的突破。為實現3-HP產量最大化，Ko等敲除多種副產物合成基因抑制乳酸、琥珀酸、1,3-PDO的生成，并將dhaB和gdrAB基因過表達以及在糖酵解途徑減少甘油同化、增加甘油流向共生產和改變通氣速率等方法，最終合成 43.00 g/L的 3-HP[19]。該方法對副產物合成途徑進行更深程度的研究，抑制副產物生成和培養(yǎng)條件優(yōu)化，但產量并未實現新的突破，后續(xù)可選取更高活性的醛脫氫酶進行研究。

啟動子控制目的基因表達，篩選不同強度的啟動子，可提高關鍵酶的活性進而提高產量。使用K. pneumoniae中天然啟動子驅動醛脫氫酶ald4基因的異源表達，獲得的3-HP產量低且表達量無法得到控制[20]。于是馬春路等[21]選用含有卡那霉素抗性基因的Pkan啟動子在菌中過表達aldH基因，培養(yǎng)后獲得15.28 g/L的3-HP。Li等[22]發(fā)現IPTG誘導型tac啟動子能過表達puuC基因，又通過阻斷副產物合成途徑并優(yōu)化發(fā)酵條件，分批補料培養(yǎng)獲得83.80 g/L的3-HP，產率高達1.16 g/(L·h)。在最新的研究中，Zhao等[23]利用K. pneumoniaeDSM 2026為宿主菌株，使用3個串聯重復tac啟動子過表達puuC基因，并在培養(yǎng)過程中維持中性的pH值和補充酵母提取物，使3-HP產量高達102.61 g/L，是迄今為止通過甘油途徑合成3-HP的最高產量，實驗選用乳酸對丙酮酸回流的方式導致發(fā)酵后期乳酸完全消失，解決后續(xù)3-HP和乳酸難以分離的問題。以K. pneumoniae為宿主可有效解決E. coli面臨的輔酶B12的添加、外源甘油脫水酶基因表達等問題。研究過程中對高效醛脫氫酶的篩選、副產物合成基因的敲除以及高強度啟動子的選擇對最終產量有著重要的影響，后續(xù)研究中可結合合成生物學中生物傳感器調控機制和調控因子進行研究。

1.3 其他宿主菌

脫氮假單胞菌Paracoccus denitrificans在有氧條件下能夠合成輔酶B12，保證NAD+有效再生，被認為是利用甘油生產3-HP最理想的菌株，Zhou等[24]在P. denitrificans中引入來自K. pneumoniae的ALDH途徑，過表達dhaB、gdrAB、puuC基因后，搖瓶發(fā)酵可積累 4.92 g/L的 3-HP。但以P. denitrificans為宿主面臨的問題是在生成 3-HP的同時，3-HP被氧化成丙二酸并將3-HP作為生長的碳源，后續(xù)研究可通過敲除轉化丙二酸的相關基因方面入手。Kalantari等[25]以枯草芽孢桿菌B. subtilis生產3-HP，該菌株可在高溫下生長，節(jié)省發(fā)酵過程中的冷卻步驟，節(jié)約生產成本，通過異源表達K. pneumoniae的ALDH途徑，敲除甘油激酶編碼基因glpK，阻斷甘油向3-磷酸甘油的代謝通路，構建的重組菌株最終合成10.00 g/L的3-HP。

其他宿主菌利用甘油途徑合成 3-HP雖能解決輔酶再生、發(fā)酵過程中低溫冷卻的問題，但仍面臨著遺傳背景不清晰、合成產量低等問題，研究人員需要對相關代謝途徑進一步研究來解決此類問題。

目前對甘油途徑的研究主要以E. coli和K. pneumoniae為主。E. coli具有遺傳背景清晰、對生長環(huán)境要求低以及利用廉價的碳源為底物等優(yōu)點，但在途徑中表達外源甘油脫水酶基因、補充昂貴的輔酶B12以及維持NAD+再生仍然是急需攻克的問題，未來的研究可在E. coli中通過去除基于核糖開關的反饋抑制系統來增加輔酶B12合成。以K. pneumoniae為宿主可有效解決輔酶B12的添加、外源甘油脫水酶基因表達等問題，研究過程中對高效醛脫氫酶的篩選、副產物合成基因的敲除以及高強度啟動子的選擇對最終產量有著重要的影響，后續(xù)研究中可結合合成生物學中生物傳感器調控機制和調控因子進行研究。其他宿主菌利用甘油途徑合成3-HP的研究應主要解決遺傳背景不清晰，合成產量低等問題。

2 丙二酸單酰輔酶A途徑

丙二酸單酰輔酶 A途徑主要是利用乙酰輔酶A羧化酶 (ACC) 將來自于葡萄糖的中間產物乙酰輔酶 A還原成丙二酸單酰輔酶A，又通過丙二酸單酰輔酶A還原酶 (MCR) 生成3-HP，其中丙二酸半醛 (MSA) 是丙二酸單酰輔酶A合成3-HP的中間體。該途徑中葡萄糖轉化成乙酰-CoA產生2 mol NADH、1 mol ATP和1 mol CO2，乙酰-CoA利用1 mol CO2和1 mol ATP羧化成丙二酰輔酶A，隨后利用2 mol NADPH將丙二酰輔酶A還原成3-HP。該途徑能夠在能量上很好地平衡，具有較高的轉化效率。目前對丙二酰輔酶A途徑的研究主要通過改善關鍵酶的催化作用、平衡酶之間的活性、增加輔因子和能量供應以及解決細胞毒性等幾個方面，如表2所示。

2.1 大腸桿菌作為宿主菌株

在丙二酸單酰輔酶A途徑中，大腸桿菌E. coli自身含有能夠將乙酰輔酶 A轉化為丙二酸單酰輔酶A的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)，在培養(yǎng)過程中，可誘導acc基因過表達，避免外源基因的添加而造成代謝負擔。

韓國Park團隊[26]將acc、pntAB基因以及來自橙色綠屈撓菌Chloroflexus aurantiacus的mcr基因在E. coli體內共表達，在24 h內累積0.19 g/L的3-HP，理論上抑制副產物的合成會提高目標產物，但對合成副產物的相關基因pta-ackA、ldhA、sucAB敲除后，產量并未得到改善。此研究首次證明從葡萄糖生產3-HP代謝通路的可行性，但因MCR酶的活性較低限制了3-HP的高產，后續(xù)可通過增加前體物質和NADPH的供應以及對mcr基因進行改造使酶活提高進而提高3-HP產量。

為改善關鍵酶的催化作用，趙廣團隊[27]對途徑中的mcr基因進行改造，通過將mcr基因分成兩個功能結構域MCR的N末端和MCR的C末端區(qū)域，發(fā)現當MCR的兩個功能區(qū)域拆分后，酶活有較大提升，又通過定點誘變技術進行改造，E. coli在48 h后累積0.15 g/L的3-HP。后續(xù)發(fā)現MCR-C端表達量及酶活均低于MCR-N端，推測兩個結構域的活性不平衡是導致MCR整體酶活低的主要原因，通過飽和誘變和定點突變來提高MCR-C的酶活，采用染色體整合技術控制MCR-N端酶活，最后結合發(fā)酵條件的優(yōu)化及補料分批培養(yǎng)3-HP產量可達40.60 g/L，產率高達0.56 g/(L·h)，是已知利用丙二酸單酰輔酶A途徑合成3-HP的最高產量[28]。趙廣團隊對關鍵酶MCR的研究使丙二酸單酰輔酶輔酶A途徑合成3-HP的產量達到一個新的高度，在此基礎上可參考Park團隊，對合成副產物基因進行敲除以及提高輔因子供應進而提高產量。

表2 利用丙二酸單酰輔酶A途徑合成3-HP情況Table 2 Synthesis of 3-HP using the malonyl-CoA pathway

筆者所在團隊在mcr基因功能區(qū)域分離的基礎上，引入美國華盛頓大學Liu Di設計的FapR生物傳感器，構建根據細胞內丙二酸單酰輔酶A濃度來調節(jié)acc基因表達的負反饋系統，有效解決acc基因過度表達所產生的毒性問題，將含有目的基因的質粒在重組E. coliBL21(DE3) 中進行表達，獲得相應產量的3-HP。此項技術已申請2項發(fā)明專利。

除了對關鍵酶進行改造，通過篩選不同的宿主-載體系統，也可使產量進一步提高。Cheng等[29]在E. coli中表達來自兼性厭氧菌谷氨酸棒狀菌Corynebacterium glutamicum的acc基因和來自C. aurantiacus的mcr基因，通過選擇不同的宿主-載體系統，最終確定宿主E. coliBL21(DE3) 和pET28a的組合生產3-HP最有效，在后續(xù)發(fā)酵過程中補充NaHCO3和生物素，分批補料培養(yǎng)36 h后，獲得10.08 g/L的3-HP，產率為0.4 g/(L·h)。

在上述研究中，實驗均以葡萄糖作為底物，Lee等[30]打破常規(guī)，選取醋酸鹽為底物并敲除副產物合成基因。過表達mcr基因和編碼乙酰-CoA合成酶的acs基因，同時刪除編碼乙醛酸分流途徑阻遏物的iclR基因，并添加淺藍菌素來減少碳流向脂肪酸合成，最后在8.98 g/L的醋酸鹽中獲得3.00 g/L的3-HP，之后的研究應針對mcr密碼子優(yōu)化提高關鍵酶活性以及解決輔因子循環(huán)等問題。

2.2 釀酒酵母菌作為宿主菌株

與E. coli相比，釀酒酵母S. cerevisiae同樣是重要的安全模式菌株，體內含有將乙酰輔酶 A還原成丙二酸單酰輔酶A的acc基因，過表達后利用丙二酸單酰輔酶A途徑與mcr基因合成3-HP。不同的是其可以在酸性條件下生產，增強了宿主菌對產物的耐受性，培養(yǎng)后的產物大部分為游離的3-HP，在工業(yè)生產中可節(jié)省下游分離提取的費用。

在合成途徑中，除了對目的基因表達和副產物合成基因敲除以外，輔因子和能量供應也必不可少。Chen等[31]以S. cerevisiae為宿主菌株，在過表達acc、mcr基因基礎上，同時過表達adh2、ald6以及acsSE基因，并敲除合成副產物編碼胞質蘋果酸合酶的mls1基因，最后加入甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPNsm，使3-HP 的產量提高到原來的3倍，達到0.46 g/L，但產率僅為0.006 g/(L·h)。Kildegaard等[32]為改善乙酰輔酶A的供應，將pdc1、ald6、acsL641P基因一起過表達，再通過轉移NADP依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶gapdh基因，提高mcr作用所需的NADPH，增強輔因子的供應，使重組S. cerevisiae合成 9.80 g/L的 3-HP，產率提升至0.1 g/(L·h)。副產物合成基因的敲除以及輔因子和能量的供應可有效提高3-HP的產量，但產量低下無法達到工業(yè)生產要求，可通過對關鍵酶的篩選以及宿主-載體系統的選擇等方面進行改善，以及引入合成生物學技術對此進行研究。

為解決關鍵酶活性的問題，Shi等[33]以S. cerevisiae為研究對象，對acc1基因的 Ser659和Ser1157兩個位置進行定點突變，使acc1基因活性得到增強，從而促進 3-HP 的合成，使 3-HP產量為0.28 g/L。David[34]以Liu Di設計的FapR生物傳感器為基礎，在S. cerevisiae中開發(fā)一種新型傳感器，引入酵母啟動子TEF1控制mcr基因表達以及過表達 PHXT1啟動子控制下的抑制劑fas1基因，兩個基因在FapR控制的代謝途徑下，25 h產生約0.80 g/L的3-HP，產量雖然不高，但在方法和技術上已得到創(chuàng)新并開展了新的研究思路，之后的研究可以此為基礎，從其他菌中篩選出高活性的關鍵酶以及增強輔因子的供應來提高產量。

釀酒酵母S. cerevisiae作為真核模式生物，可生長在酸性條件下，解決菌株不耐酸的問題。但產量低仍是該途徑的關鍵問題，后續(xù)應篩選具有更高活性的乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A，并對酶之間的平衡問題進行研究。

2.3 其他宿主菌

近些年，也報道過一些其他宿主菌利用丙二酸單酰輔酶A途徑合成3-HP。Lan等[35]以伊隆-蓋塔斯乳腺球菌Synechococcus elongatusPCC 7942為宿主菌，通過將msrMs、mcrSt基因整合到染色體上，最后合成0.67 g/L的3-HP，證明使用藍細菌將CO2光合轉化為3-HP的可行性，利用CO2代替了廉價碳源使用，解決成本高等問題。Lian等[36]以激烈火球菌Pyrococcus furiosus為宿主菌，過表達acc、mcr、mrs基因生成3-HP，在此基礎上將來自勤奮生金球菌Metallosphaera sedula的碳酸酐酶CA和生物素蛋白連接酶BPL分別添加至該途徑，3-HP產量達0.12 g/L和0.37 g/L。實驗表明輔助蛋白質在代謝工程中對異源表達極為重要。

啟動子對目標基因的控制同樣受到研究者的關注。Wang等[37]以集胞藻Synechocystissp.為宿主，通過表達acc基因和生物素酶增強前體丙二酰輔酶 A的供應，更換啟動子和培養(yǎng)條件增加mcr基因的表達，并且過表達NAD(P) 轉氫酶基因來改善NADPH供應，6 d后產生0.84 g/L的3-HP。Yang等[38]使用工程化扭脫甲基桿菌Methylobacterium extorquensAM1，通過增加啟動子強度和mcr拷貝數未提高產量。Suyama等[39]以重組裂殖酵母S. pombe為宿主，在高度表達的hsp9啟動子作用下，編碼Cut6p和CaMCR基因，在補充乙酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)31 h，3-HP產量達7.60 g/L。通過對啟動子修飾與更換，使3-HP的產量得以改善。

利用其他宿主菌合成 3-HP的遺傳背景不清晰，并面臨著產量低、不能工業(yè)化生產等問題。之后的研究應主要集中在代謝途徑的具體分析以及應用合成生物學技術對相關基因進行控制和表達等方面。

以丙二酸單酰輔酶 A途徑合成 3-HP主要以E. coli和S. cerevisia為主，E. coli的遺傳背景清晰，自身含有能夠將乙酰輔酶 A轉化為丙二酸單酰輔酶A的乙酰輔酶A羧化酶ACC，在培養(yǎng)過程中，可誘導acc基因過表達，避免外源基因的添加而造成代謝負擔。未來的發(fā)展方向可引入轉錄抑制因子FapR，抑制acc基因過表達產生的毒性。與E. coli相比，S. cerevisiae同樣是重要的安全模式菌株，不同的是其可以在酸性條件下生產，增強了宿主菌對產物的耐受性，培養(yǎng)后的產物大部分為游離的3-HP，在工業(yè)生產中可節(jié)省下游分離提取的費用，但合成產量低仍是急需解決的重要問題，今后應在關鍵酶平衡的問題上進行研究。

3 β-丙氨酸途徑

β-丙氨酸是微生物體內廣泛存在的代謝產物，可通過多種氨基酸發(fā)生轉氨作用以及丙酮酸轉化而形成，并作為中間體合成 3-HP。研究者使用基因組代謝模型發(fā)現該途徑比丙二酸單酰輔酶 A途徑具有更高的理論得率，目前已經在E. coli和S. cerevisiae中成功構建β-丙氨酸途徑，并獲得較高的產量。

Liao等[40]首次在E. coli中構建 β-丙氨酸途徑，提出可通過丙氨酸 2,3-氨基變位酶 (AAM)的轉氨作用將 α-丙氨酸轉化為 β-丙氨酸，再通過β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶 (BAPAT) 轉化形成丙二酸半醛，最后利用3-羥基丙酸脫氫酶 (HPDH) 的還原作用形成 3-HP。在此基礎上，Song等[41]在E. coli中開發(fā)另一種新的 β-丙氨酸途徑，使用來自富馬酸鹽的天冬氨酸，此途徑比草酰乙酸的途徑具有更高的性能，通過表達來自E. coli的ydfG基因和來自P. aeruginosa的pa0132基因，并將基因組中的強啟動子tac替代sdhC基因的天然啟動子，經搖瓶培養(yǎng)和分批補料培養(yǎng)分別產生3.69 g/L和31.10 g/L的3-HP，使產率達到0.63 g/(L·h)。

Jessen等[42]發(fā)現S. cerevisiae中的γ-氨基丁酸轉氨酶 (GABT) 同樣可以將β-丙氨酸轉化為丙二酸半醛，成功在S. cerevisiae中構建β-丙氨酸途徑。近幾年，該課題組又在不同宿主菌中發(fā)現多種可將β-丙氨酸轉化為丙二酸半醛的氨基轉移酶，并已成功申請專利[43]。Borodina等[44]利用 β-丙氨酸作為前體，將蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus中編碼 β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶yhxA基因與來自E. coli的ydfG基因在S. cerevisiae中過表達，再通過表達天然細胞質天冬氨酸氨基轉移酶aat2基因和兩種丙酮酸羧化酶pyc1、pyc2基因來改善L-天冬氨酸的供應，最后在分批補料培養(yǎng)中獲得13.70 g/L的3-HP，產率為 0.17 g/(L·h)。Kildegaard 等[45]在S. cerevisiae中比較丙二酸單酰輔酶A途徑與β-丙氨酸途徑利用木糖生產3-HP的能力，結果表明，在分批補料培養(yǎng)中β-丙氨酸途徑可獲得6.09 g/L的3-HP，而丙二酸單酰輔酶A途徑僅獲得2.30 g/L。

E. coli和S. cerevisiae的遺傳背景清晰，是典型的模式菌株，該途徑可將不同種類的氨基酸轉化為 β-丙氨酸，在通過不同活性的轉氨酶將其轉化為丙二酸半醛，進而還原成 3-HP。β-丙氨酸途徑可獲得高產的 3-HP，但其合成途徑十分復雜，在生長過程中容易造成代謝負擔，此外，β-丙氨酸途徑通常使用常見的代謝中間體為底物，在發(fā)酵過程中會伴隨著多種副產物的合成，使產品分離十分困難。未來應對 β-丙氨酸途徑作進一步的研究找出其他更簡單的代謝通路，并篩選高活性的轉氨酶以及掌握更有效的產品分離技術。

4 其他途徑

Luo等[46]利用丙酰輔酶A途徑，在重組E. coli中將來自皺褶假絲酵母Candida rugosa的丙酰基-CoA脫氫酶 PACD和來自埃氏巨型球菌Megasphaera elsdenii的pct、hpcd基因共表達，使產量達到0.72 g/L。后又敲除途徑中琥珀酸CoA轉移酶ygfH基因和檸檬酸甲酯合成酶prpC基因，使菌株在搖瓶實驗中產生2.17 g/L的3-HP，因途徑中需補充額外的丙酸鹽，導致生產成本提高，不利于工業(yè)化生產。

Holo等首次提出3-HP固碳循環(huán)途徑，研究發(fā)現3-HP是C. aurantiacus固碳途徑的中間代謝產物。通過研究，單循環(huán)固碳途徑被逐步完善，但卻發(fā)現在途徑中無法確認固定產物乙醛酸代謝機制的問題，因此Fuchs等提出3-HP是一種雙循環(huán)偶聯途徑，并通過實驗闡述了乙醛酸代謝機制中未解決的問題以及對特征酶進行純化、鑒定，最后確立3-HP雙循環(huán)偶聯途徑[47]。該途徑利用CO2為底物，可減少生產成本，在循環(huán)過程中吸收和同化大氣環(huán)境中有機酸等物質，解決環(huán)境污染的問題，在未來可開展綠色工業(yè)生產。

Yu等[48]發(fā)現一種具有高度底物耐受性的丙腈水解酶，其可將 3-羥基丙腈 (3-HPN) 轉化為3-HP。將含有該腈水解酶基因的重組大腸桿菌，使用海藻酸鈣包埋和化學交聯固定化的方法將靜息細胞固定在藻酸鈣上，通過不斷地重復利用以及分離、純化，最終從30批中獲得184.7 g/L 3-HP，轉化率高達36.9 g/(L·h)。通過細胞的固定方法增強了它們對底物的耐受性、穩(wěn)定性、重復利用性進而提高產量，但3-HPN本身也是一種重要化學品，其作為底物添加提高了生產成本，不利于工業(yè)化生產。

在最新的研究中，Liu等[49]以脂肪酸FAs為原料，在分析多種途徑的限制因素后，在E. coli中成功構建脂肪酸代謝途徑，并通過組合代謝工程和發(fā)酵條件的優(yōu)化，發(fā)酵培養(yǎng)后產生 52.00 g/L的3-HP，產率為 1.56 g/(L·h)。利用脂肪酸為原料生產 3-HP，雖然能獲得大量產物，但脂肪酸本身也作為一種重要的有機物可用于化妝品、涂料、脂肪酸鹽的生產，用其作原料會增加生產成本，不利于工業(yè)化生產，后續(xù)研究應集中在利用廉價物質作為碳源來生產3-HP。

5 途徑優(yōu)缺點

甘油作為生產生物柴油的副產品，價格低廉、來源廣泛，代謝通路中涉及的兩種關鍵酶來源廣、背景清晰。但該途徑仍面臨著一些問題，如菌株對產物的耐受性較低、3-HPA積累產生的毒性、E. coli中輔酶B12供應以及K. pneumoniae的安全性等。后續(xù)研究可篩選適應低pH條件的微生物進行發(fā)酵，找出活性更高的醛脫氫酶或降低甘油脫水酶活性來調節(jié)酶之間的平衡以及使用來自酪酸梭菌的不依賴B12的甘油脫水酶來解決輔酶B12供應的問題。

在利用丙二酸單酰輔酶A途徑合成3-HP的生產過程中可使用廉價的碳源葡萄糖、木糖等原料作為底物，并在培養(yǎng)工程菌的過程中不需要輔酶B12的供應，從而降低了生產成本，且該途徑代謝通路簡單，便于操作。然而該途徑還存在合成產量低、較低的菌株耐受性以及acc基因過度積累產生毒性等問題。為解決上述問題，應對途徑中的關鍵基因進行篩選或根據途徑中涉及的蛋白質晶體結構，設計出具有所需特性的酶來提高活性，通過篩選3-HP的耐受基因或菌株來解決產物耐受性的問題。筆者所在團隊為控制途徑中acc基因和mcr基因之間平衡表達，引入含有FapR調控因子的生物傳感器，可有效解決acc基因過度積累產生的毒性問題。

β-丙氨酸途徑作為微生物體內廣存的代謝產物，前體來源廣泛，并已證明合成 3-HP的產量可高于丙二酸單酰輔酶 A途徑。但其合成途徑復雜，在培養(yǎng)過程中容易造成代謝負擔，未來的研究可找出其他更簡單的代謝通路，篩選高活性的轉氨酶以及掌握更有效的產品分離技術來提高3-HP的產量。

在對其他途徑的研究中發(fā)現，E.coli可利用丙腈水解酶，通過固定化細胞獲得高產量的 3-HP，但其代謝途徑背景不清晰，添加前體物質三羥基丙腈又提高了生產成本。其他途徑中也同樣需要添加昂貴的前體物質，不利于工業(yè)化生產，應對代謝調控機制進一步分析、調整，并添加廉價的前體物質作為碳源合成3-HP。

6 總結與展望

近些年來，3-HP作為重要的平臺化合物，受到各國學者的廣為關注，生物合成3-HP所需的原料來源廣，生產成本低，對環(huán)境的影響較小。但野生菌合成3-HP的產量低、穩(wěn)定性差，工業(yè)生產實施困難，因此需要利用代謝工程技術對代謝途徑進行研究，近幾年研究主要通過更換不同的宿主、底物、代謝途徑以及敲除副產物合成基因，平衡酶之間的活性，增加前體和輔助因子的供應等方法來提高3-HP的產量，并在研究中引入合成生物學技術，開發(fā)了可動態(tài)調節(jié)轉錄因子的生物傳感器。但迄今為止仍存在以下問題：1) 輔酶B12的供應提高生產成本；2) 產物積累產生的毒性問題；3) 菌株對產物的耐受性較低，產量無法提高。

未來 3-HP的合成方向需要以節(jié)約、環(huán)保為理念，利用廉價或可再生的物質為碳源。針對上述問題，提出未來的發(fā)展方向：1) 最近對巨大芽孢桿菌以及脫氮菌的研究顯示，可去除途徑中的反饋抑制系統來增加輔酶B12合成，可將此方法引入途徑中解決輔酶 B12的供應問題。2) 篩選高活性的關鍵酶并對酶之間的平衡進行調整，可有效減少產物積累產生的毒性。3) 篩選出具有高底物耐受性的宿主菌。4) 在途徑中結合合成生物學中生物傳感器調控因子以及CRISPR-Cas系統，3-HP產量有望得到進一步加強。下游工藝涉及的原位產品分離回收、副產物的處理以及產品純度等問題仍需新的技術手段來解決。各國學者致力于此項技術的研究，相信3-HP工業(yè)化生產的前景將會日益精進。