活細(xì)胞工作站的使用及常見問題分析

槐玉英 宋瑞龍

摘 要

活細(xì)胞工作站可為體外細(xì)胞提供生存環(huán)境并維持細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的正常生長(zhǎng)繁殖，該設(shè)備便于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間物質(zhì)代謝的追蹤觀察，現(xiàn)已成為生物學(xué)領(lǐng)域中的一種熱門研究手段。本文概述了該設(shè)備的操作方法及常見問題，供大家參考。

關(guān)鍵詞

活細(xì)胞工作站;樣品制備;應(yīng)用;常見問題

中圖分類號(hào)： Q2-33 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.085

Abstract

The live cell imaging system can provide a living environment for cells in vitro and maintain the normal growth and reproduction of cells for a long time.It is convenient for tracking and observing the metabolic of intracellular or intercellular substance.It has become a popular research method in the biological field.This paper outlines the operation and common problems of the live cell imaging system.

Key Words

Live cell imaging system;Sample preparation;Application;Common problems

活細(xì)胞工作站是在倒置熒光顯微鏡基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)觀察活細(xì)胞培養(yǎng)并能連續(xù)采集圖像的成像系統(tǒng)，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的物質(zhì)代謝或信息傳遞進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。目前該設(shè)備常應(yīng)用于觀察細(xì)胞的增殖、遷移（1）、凋亡（2）、內(nèi)吞（3）等過程，可在亞細(xì)胞水平觀察線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，還可觀察病毒感染細(xì)胞后核衣殼的轉(zhuǎn)運(yùn)情況（4）或某些蛋白在病毒感染細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)（5）等。該設(shè)備可以對(duì)多孔板或培養(yǎng)皿內(nèi)的活細(xì)胞進(jìn)行明場(chǎng)或熒光觀察，也可對(duì)固定玻片的樣品進(jìn)行觀察，特別適用于對(duì)活細(xì)胞和組織、沉淀物等進(jìn)行顯微研究，本文以我院購(gòu)買的活細(xì)胞工作站為例，對(duì)設(shè)備配置及使用過程中的常見問題進(jìn)行介紹、歸納。

1 活細(xì)胞工作站的技術(shù)參數(shù)

1.1 熒光顯微鏡主要參數(shù)

配備的蔡司新一代Axio Observer7全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡可以自動(dòng)校準(zhǔn)物鏡，能夠校正由于厚度、介質(zhì)折射率不同引入的相差;配備了6款不同功能的物鏡，5×、10×、20×（平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡）、20×（長(zhǎng)工作距離平場(chǎng)消色差相差物鏡，LD）、40×（LD）、63×（平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡）;電動(dòng)調(diào)焦，最小步進(jìn)≤10nm，調(diào)焦行程≥10mm;分體式TFT觸摸屏，操作方便;具有很強(qiáng)的擴(kuò)展性，可以搭配不同的配件使用，可提供多樣靈活的顯微鏡應(yīng)用平臺(tái)。

1.2 光學(xué)系統(tǒng)

采用新ICCS無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)，具有軸向和徑向雙重色差校正，可反差校正，提高圖像對(duì)比度。

1.3 熒光系統(tǒng)

配有四色LED熒光光源，具有壽命長(zhǎng)，亮度高、色溫恒定、照明均勻，不產(chǎn)生熱量，避免“雜光”漂白/光毒性，可瞬間開啟或關(guān)閉，無須預(yù)熱或冷卻的特點(diǎn);配有多通道熒光濾塊，拍多通道時(shí)只需切換不同激光即可，濾塊不需要切換，兩者的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了無轉(zhuǎn)盤設(shè)計(jì)。

1.4 聚焦系統(tǒng)

具有內(nèi)部自動(dòng)聚焦透鏡，能實(shí)現(xiàn)大范圍內(nèi)尋找并鎖定和記憶多個(gè)焦面，支持自動(dòng)拼圖和多位點(diǎn)采圖過程的多點(diǎn)漂移補(bǔ)償（不同位置可設(shè)置不同聚焦補(bǔ)償offset參數(shù)）。采用光柵投影方式監(jiān)測(cè)焦面的位置變化。

1.5 活細(xì)胞培養(yǎng)裝置

獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，合適的溫度、二氧化碳、濕度保證細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間存活。

1.6 軟件

具備基本的圖像處理功能，可測(cè)定某一區(qū)域平均熒光強(qiáng)度值，測(cè)量某一直線或曲線的熒光強(qiáng)度分布情況等，對(duì)樣品進(jìn)行時(shí)間序列拍攝、Z軸序列拍攝、圖像景深擴(kuò)展、自動(dòng)拼圖等。

2 樣品的制備

2.1 樣品的處理

石蠟組織切片或冷凍組織切片樣品經(jīng)常規(guī)的免疫熒光抗體標(biāo)記、封片后即可進(jìn)行觀察。

進(jìn)行活細(xì)胞觀察時(shí)，應(yīng)保證無菌操作，宜選用厚度為0.17mm的激光共聚焦培養(yǎng)皿。對(duì)于貼壁性較差的細(xì)胞可對(duì)培養(yǎng)容器進(jìn)行多聚賴氨酸包被處理。

2.2 熒光染料的選擇

在活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察時(shí)，須選擇穩(wěn)定性好，抗淬滅性強(qiáng)，且對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響小的熒光染料，如進(jìn)行DNA染色時(shí)，應(yīng)選用Hoechst，而不用對(duì)細(xì)胞毒性較大的DAPI。

該設(shè)備可進(jìn)行多熒光多通道觀察，但要避免在同一樣品中使用相近光譜的熒光染料，以免造成串色。

3 圖像采集

3.1 單張圖片采集

在“Locate”或“Acquisition”界面進(jìn)行圖像預(yù)覽，設(shè)置曝光時(shí)間，獲取最佳圖片。在“Dimensions”菜單中“Range Indicator”前打勾，作為曝光時(shí)間參考，紅色代表過爆點(diǎn)。

3.2 多通道圖片采集

在“Acquisition”界面下，選中對(duì)應(yīng)的熒光通道進(jìn)行預(yù)覽，通過顯微鏡或者按住鍵盤“Ctrl”滑動(dòng)鼠標(biāo)滑輪調(diào)節(jié)焦面，手動(dòng)或自動(dòng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，切勿過爆。使用Apotome，通過柵格移動(dòng)將非焦面的光擋住，從而獲得較高信噪比的圖片。使用自動(dòng)曝光功能時(shí)，在測(cè)完曝光時(shí)間后就關(guān)掉，否則相機(jī)一直處于自動(dòng)測(cè)量曝光時(shí)間狀態(tài)。點(diǎn)擊拍照并保存。

3.3 Z軸序列圖片采集

選中“Z-Stack”，調(diào)整焦距，確定拍攝目標(biāo)的上限和下限，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置掃描步進(jìn)，調(diào)節(jié)各通道參數(shù)，點(diǎn)擊開始實(shí)驗(yàn)，完成Z軸序列圖片采集。點(diǎn)擊圖片左側(cè)的“Ortho”，選中圖片下方的最大信號(hào)強(qiáng)度投影（MIP），從而生成三維重構(gòu)圖片。此功能適于較厚樣品的觀測(cè)。

3.4 自動(dòng)拼圖

選中“Tiles”，進(jìn)入預(yù)覽和整個(gè)載物臺(tái)視野的分屏界面，通過輸入數(shù)值或移動(dòng)載物臺(tái)到需要采集區(qū)域的邊界來確定拼圖區(qū)域，并進(jìn)行多點(diǎn)設(shè)置。預(yù)覽所選區(qū)域大小合適后開始實(shí)驗(yàn)進(jìn)行拼圖。如果所需拼圖區(qū)域比較大，可先使用低倍物鏡進(jìn)行區(qū)域設(shè)置，然后選擇高倍物鏡，之前的Tile拼圖數(shù)目會(huì)自動(dòng)隨之改變（保持原區(qū)域不變），再根據(jù)實(shí)時(shí)預(yù)覽圖片調(diào)好焦和各通道曝光時(shí)間進(jìn)行拼圖。用軟件的處理功能可以對(duì)拼圖進(jìn)行處理和分析。如果拼圖的視野不平，選擇合適的聚焦策略。

3.5 手動(dòng)拼圖

調(diào)整好各通道參數(shù)，開始實(shí)驗(yàn)獲取一實(shí)時(shí)的全景圖，滾動(dòng)鼠標(biāo)滾輪放大或縮小區(qū)域，調(diào)焦獲取圖片;軟件會(huì)自動(dòng)生成另一預(yù)覽藍(lán)框，可拖動(dòng)藍(lán)框修改拼圖視野，獲取圖片，重復(fù)多次直至完成全部拼圖采集;以上的圖片采集結(jié)束后，利用軟件進(jìn)一步處理后重新輸出方完成。由于拼圖需要對(duì)載物臺(tái)和相機(jī)的相對(duì)位置進(jìn)行精確校正，所以不要碰撞載物臺(tái)和隨意擰動(dòng)相機(jī)。

3.6 時(shí)間序列圖片采集

選中“Time Series”，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置拍攝的時(shí)間間隔和總時(shí)間，點(diǎn)擊開始實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間序列采集。

3.7 Z軸序列+拼圖

選中“Z-Stack”和“Tiles”，調(diào)整各通道拍攝參數(shù)后，在“Z- Stack”界面，設(shè)定拍攝目標(biāo)的上限和下限;調(diào)整拼圖大小，點(diǎn)擊開始實(shí)驗(yàn)進(jìn)行采集。

4 常見問題分析

1）視野的一邊出現(xiàn)暗區(qū)

查看Apotome是否完全插入，Apotome插入時(shí)聽到“咯噔”聲之后才是已經(jīng)完全插入;檢查物鏡下方的黑色插片，出現(xiàn)視野有黑斑時(shí)可將插片拔出。

2）軟件中僅顯示了全視野的局部區(qū)域

“Locate””Acquisition”中相機(jī)的“Binning”是否為1×1;“Acquisition ROI”中的“Size”是否為最大（2752×2208）。

3）熒光燈亮，但是鏡下是黑的看不到熒光

應(yīng)首先排除樣品問題，正常情況下，將相應(yīng)通道的熒光強(qiáng)度調(diào)到20%即可看到熒光;查看二分鏡是否旋轉(zhuǎn)到對(duì)應(yīng)的數(shù)字。

4）軟件中已經(jīng)選擇了某熒光通道，且激光強(qiáng)度也已修改，但顯微鏡沒有光亮。

查看觀察方式是否已經(jīng)改為鏡下觀察;TFT觸摸屏上的“RL”是否是“On”的狀態(tài)，“TL”是“Off”狀態(tài) （“RL”是反射光/熒光觀察模式，“TL”是透射光觀察），進(jìn)行明場(chǎng)觀察和微分干涉（DIC）觀察。

5）微分干涉觀察時(shí)，圖片質(zhì)量很差，細(xì)胞輪廓模糊不清

所用的培養(yǎng)容器是否是玻璃底的;所用物鏡是否配置了DIC觀察方式;確認(rèn)物鏡下方插槽內(nèi)是否插入了匹配的DIC棱鏡。

6）聚焦策略選用完美聚集時(shí)，儀器報(bào)錯(cuò)顯示找不到樣品位置

查看軟件中完美聚焦是否已正常運(yùn)行，將儀器和軟件全部重新啟動(dòng)一次;轉(zhuǎn)換一下其他鏡頭觀察，排除鏡頭損壞或使用錯(cuò)誤鏡頭導(dǎo)致的;所用的培養(yǎng)皿質(zhì)量不合格，皿底厚度不一，導(dǎo)致折射率不同而不能運(yùn)用完美聚焦功能。

5 維護(hù)和管理

1）所有使用者需提前在網(wǎng)上進(jìn)行預(yù)約，經(jīng)管理者審核通過后方可使用。為使儀器得到高效地使用，預(yù)約者不能按時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的，需提前取消預(yù)約。未經(jīng)培訓(xùn)者，不得擅自上機(jī)操作。

2）嚴(yán)格遵守儀器的操作規(guī)程，尤其是開關(guān)機(jī)流程，避免因操作不當(dāng)造成儀器的損壞。實(shí)驗(yàn)過程中遇到報(bào)錯(cuò)現(xiàn)象，必須聯(lián)系管理員或工程師，不得強(qiáng)行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免造成不必要的損失。

3）進(jìn)行玻片觀察時(shí)，活細(xì)胞培養(yǎng)裝置就不必打開。進(jìn)行活細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)，分別打開完美聚集，SMC2009（控制移動(dòng)載物臺(tái)），apotome插件（一個(gè)光切系統(tǒng)），顯微鏡控制器，活細(xì)胞培養(yǎng)控制器，顯微鏡和電腦，最后打開軟件。使用細(xì)胞培養(yǎng)裝置前要確認(rèn)一下通氣瓶?jī)?nèi)的水是否夠加滿，通氣瓶?jī)?nèi)的水需是高壓過的超純水。

4）二氧化碳?xì)馄康拈_關(guān)，有兩個(gè)氣壓表，右邊的總閥的（一直開著），用的時(shí)候氣壓閥擰緊（擰緊是開）氣壓表指到0.1的時(shí)候不超過0.2正好。經(jīng)常使用氣瓶閥門不用關(guān)，長(zhǎng)期不用必須將氣瓶關(guān)掉防止漏氣，以免造成二氧化碳的浪費(fèi)。

5）打開軟件時(shí)，需在驗(yàn)證通過后方可將樣品放到顯微鏡上。

6）對(duì)于不常用的物鏡，最好取下保存于物鏡盒內(nèi)，防止操作不當(dāng)對(duì)其造成損壞或因長(zhǎng)期不用不好打理。復(fù)消色差物鏡移動(dòng)的時(shí)候容易撞到六孔板的底部，拍照時(shí)只針對(duì)單孔，且僅觀察載玻片或玻底皿樣品。油鏡使用后，擦鏡紙蘸取酒精小心擦拭，防止損壞鏡頭。所有物鏡定期用棉棒進(jìn)行擦拭。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將物鏡調(diào)到最小倍數(shù)并降到最低。

7）熒光樣品的觀測(cè)，在上機(jī)前最好在自己實(shí)驗(yàn)室用普通熒光顯微鏡觀察是否有熒光，細(xì)胞的狀態(tài)是否良好。

8）進(jìn)行活細(xì)胞觀察時(shí)，需提前一小時(shí)將溫度的控制器打開，防止熱脹冷縮細(xì)胞會(huì)隨著視野的移動(dòng)而發(fā)生飄焦現(xiàn)象。軟件的細(xì)胞培養(yǎng)欄中的“M”代表六孔板的底座，“P”代表培養(yǎng)皿的底座，觀察六孔板時(shí)打開“P”，觀察培養(yǎng)皿時(shí)打開“M”。開始活細(xì)胞熒光觀察實(shí)驗(yàn)后，室內(nèi)保持遮光環(huán)境，避免外源光影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

9）光學(xué)部件對(duì)外界環(huán)境要求較高，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行除塵和凈化，室內(nèi)配有除濕機(jī)、空氣凈化器和空調(diào)，確保儀器環(huán)境良好。

10）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，做好儀器和室內(nèi)的清潔工作。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嚴(yán)禁用U盤/硬盤拷貝，可通過校內(nèi)網(wǎng)盤上傳或光盤刻錄，避免系統(tǒng)感染病毒。

6 結(jié)語

高端精密儀器是保證、提高科研水平的必要條件，但設(shè)備管理員的專業(yè)素養(yǎng)，是保證設(shè)備的安全性、可靠性，降低運(yùn)行成本，協(xié)助使用者得到最佳的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終提高設(shè)備綜合使用效益的前提條件。

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