利用基因組編輯技術(shù)構(gòu)建擬南芥雙突變體iqm5-1 flc

李惠梅 范甜 呂天曉 周玉萍 田長恩

摘 要

本研究組前期發(fā)現(xiàn)，擬南芥IQM5基因突變引起開花推遲，可能是提升了開花抑制因子FLC的轉(zhuǎn)錄本水平所致。然而 ，缺乏遺傳學(xué)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用基因組編輯技術(shù)構(gòu)建FLC的編輯載體，轉(zhuǎn)化IQM5基因的T-DNA插入突變體iqm5-1，通過抗生素抗性篩選和測序得到雙突變體iqm5-1 flc，為確定IQM5通過FLC調(diào)控開花提供了遺傳材料。

關(guān)鍵詞

IQM5;FLC;基因組編輯;雙突變體;擬南芥

中圖分類號： Q943.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457 . 2020 . 14 . 67

擬南芥的IQM家族共有6個成員， N-端有一段序列與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白同源， C-端則有一段與核糖體失活蛋白天花粉素同源的序列。IQM家族各成員可能在不同環(huán)境條件和不同發(fā)育階段所起作用各不相同[1-2]。本研究組發(fā)現(xiàn)在幼苗、莖、蓮座葉、花序葉和花蕾中，均存在 IQM5.1 和 IQM5.2 的兩種轉(zhuǎn)錄本，不過，不同組織器官中二者的比例不盡相同[3]。在擬南芥中，已探明春化、光周期、赤霉素、年齡途經(jīng)、自主以及溫度等6條調(diào)控開花時(shí)間的遺傳途徑。開花抑制因子FLC能直接抑制包括FT、SOC1和FD在內(nèi)的開花整合基因的表達(dá)[4]。本研究組發(fā)現(xiàn)，IQM5的T-DNA插入突變體iqm5-1和iqm5-2在長日照或短日照下均呈現(xiàn)晚花表型;FLC在野生型植株的莖、葉中均微弱表達(dá)，但在突變體iqm5-1和iqm5-2的莖、葉中表達(dá)量均顯著增高[5]。因此，推斷IQM5基因突變引起開花推遲，可能是提升了開花抑制因子FLC的轉(zhuǎn)錄本水平所致[5]。本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)構(gòu)建雙突變體iqm5-1 flc，為確定IQM5通過FLC調(diào)控開花提供遺傳材料。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料：iqm5-1（CSHL_GT18219）是Landsberg erecta（Ler）生態(tài)型的IQM5 T-DNA 插入突變體，來源于Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， USA。載體：pYLsgRNA-AtU3d、pYLsgRNA-AtU3b、pYLCRISPR/ Cas9-Pubi-H菌種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士友好贈送。菌種：大腸桿菌E.coli DH5α及農(nóng)桿菌GV3101菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。試劑：Bsa I核酸內(nèi)切酶購于NEB公司，其他試劑盒與工具酶均購自TAKARA生物工程有限公司;MS鹽（Murashige&Skoog ）購自Sigma公司;潮霉素、Yeast Extract、Typtone和Agar M等為生工生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品 。測序及引物合成：由生工生物工程（上海）有限公司及完成。引物序列 （均為5′→3′）：SP-L1：GCGGTGTCATCTATGTTACTAG，SP-R：CGACATAGATGCAATAACTTCG;3D-FLC-F：GTCACCTTCTCCAAACGTCGCAA，3D-FLC-R：AAACTTGCGACGTTTGGAGAAGG;3B-FLC-F：GTCAGGAGAAGCTGTAGAGCTTGC，3B-FLC-R：AAACGCAAGCTCTACAGCTTCTCC;Cas9-FLC-F：GCGGTACACGTGGCAATCTT，Cas9-FLC-R：ACAACATCGAGCACGCATCA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

質(zhì)粒提取、PCR、酶切、DNA片段回收與純化方法參照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。載體構(gòu)建參考CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)方法[6]進(jìn)行：在FLC基因中設(shè)計(jì)2對靶點(diǎn)接頭3D-FLC-F/R和3B-FLC-F/R，分別退火連成小片段，重組插入經(jīng)BsaI線性化的載體pYLsgRNA-AtU3d和pYLsgRNA-AtU3b中;經(jīng)gRNA表達(dá)盒擴(kuò)增后重組入經(jīng)BsaI線性化的雙元載體pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H;熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR鑒定及測序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，再利用農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化突變體iqm5-1;收獲成熟種子，經(jīng)潮霉素抗性篩選得到T0代幼苗，移至土壤培養(yǎng);在靶點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物Cas9-FLC-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，篩選基因編輯成功株系，在后代中繼續(xù)篩選純合轉(zhuǎn)化植株。

2 結(jié)果與分析

本研究利用CRISPR/Cas9對擬南芥iqm5-1的FLC基因進(jìn)行編輯。首先，分別將靶點(diǎn)接頭3D-FLC-F/R和3B-FLC-F/R退火連成小片段，插入pYLsgRNA-AtU3d-FLC和pYLsgRNA-AtU3b-FLC，經(jīng)gRNA表達(dá)盒擴(kuò)增，得到預(yù)期產(chǎn)物（圖1-A）。其次，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入線性化的pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽性菌落（圖1-B）;進(jìn)一步，從陽性菌落提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，菌落PCR鑒定結(jié)果符合預(yù)期（圖1-C）;最后，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥突變體iqm5-1，收獲種子經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得候選植株，對其進(jìn)行PCR鑒定獲得預(yù)期產(chǎn)物（圖1-D），外送測序獲得預(yù)期的基因組編輯植株。

將上述候選編輯植株后代繼續(xù)進(jìn)行抗性篩選和序列分析，成功獲得1株純合雙突變體iqm5-1 flc。在該雙突變體中，iqm5-1 已經(jīng)報(bào)道[5];flc的突變?nèi)鐖D2所示：從FLC起始密碼子ATG的A開始，在第74與第75位堿基間插入1個堿基（T），該堿基的插入導(dǎo)致其后序列發(fā)生移碼突變，并提前終止，產(chǎn)生僅有39個氨基酸殘基的突變蛋白，而野生型FLC有196個氨基酸殘基。

3 討論

本研究組前期發(fā)現(xiàn)，IQM5 的2個T-DNA插入突變體iqm5-1和iqm5-2在長日照或短日照條件下均呈現(xiàn)晚花表型，且其莖、葉中FLC的表達(dá)量均顯著增高。因此，IQM5基因突變可能通過提升開花抑制因子FLC的轉(zhuǎn)錄本水平而實(shí)現(xiàn)[5]。不過，缺乏遺傳材料。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)方法，成功編輯了突變體iqm5-1中的FLC基因，篩選得到雙突變體iqm5-1 flc，為確定IQM5通過FLC調(diào)控開花提供了遺傳材料。

參考文獻(xiàn)

[1] 田長恩， 周玉萍. 植物具IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2013，48 （4）： 447-460.

[2] ZhouYP， Chen YZ， Yamamoto KT， Duan J， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J]. Acta Physiol Plant， 2010，32： 191–198.

[3] 弓路平， 蕭文慧， 周玉萍，黃小玲，田長恩. 擬南芥 IQM5.2 的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（5）：69-74.

[4]張藝能， 周玉萍， 陳瓊?cè)A，黃小玲，田長恩. 擬南芥開花時(shí)間調(diào)控的分子基礎(chǔ)[J]. 植物學(xué)報(bào)，2014， 49 （4）： 469–482.

[5] Gong LP， Cheng JZ， Zhou YP， Huang XL， Tian CE. Disruption of IQM5 delays flowering possibly through modulating the juvenile-to-adult transition[J].Acta Physiol Plant，2017，39：21.1-10.

[6] Ma XL， Liu YG. CRISPR/Cas9-based multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Curr ?Protoc Mol ?Biol ， 2016， 115：31.6.1-31.6.21.