規(guī)模化白羽肉種雞場沙門氏菌的分離與鑒定

郭龍宗

摘 ?要：本研究對2013～2016年規(guī)?；B(yǎng)殖場雞沙門氏菌感染情況進行了調(diào)查研究，并對采集的雛雞、毛蛋、環(huán)境等樣品進行了沙門氏菌的分離鑒定，結(jié)果顯示：2013～2016年所有采集樣品沙門菌的平均分離率為3.8%，分離菌株以腸炎沙門氏菌為主。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;種雞場;分離與鑒定

沙門氏菌（Salmonella）感染可引起禽類各種急性和慢性疾病，這些疾病在許多國家引起了重大的經(jīng)濟損失。隨著現(xiàn)代家禽商業(yè)化養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，沙門氏菌的傳播更加復(fù)雜[1]。目前全球已知的沙門氏菌血清型有近2500種，其中禽類已報道有38種，分屬于6個血清群[2]。許多血清型的沙門氏菌能通過食物鏈傳染給人，從而引起人類的食物中毒，因此沙門氏菌病是具有重要意義的人畜共患病之一，對醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生學(xué)均具有十分重要的意義[3]。目前我國常見的致病性沙門氏菌血清型包括腸炎、鼠傷寒、雞白痢和雞傷寒等[4]，不但嚴重影響我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，而且與食品安全問題密切相關(guān)。本研究對2013～2016年規(guī)?；B(yǎng)殖場雞沙門氏菌感染情況進行了調(diào)查研究，并對采集樣品進行了沙門氏菌的分離鑒定，現(xiàn)將研究成果報道如下。

1 ?材料與方法

1.1 ?試劑 ?普通營養(yǎng)瓊脂（NA），購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;SS瓊脂、麥康凱瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯，購自北京中海生物科技有限公司;XLT4瓊脂、TTB（四硫磺酸鈉煌綠增菌液）、BS（亞硫酸鉍）瓊脂、SC增菌肉湯、XLD瓊脂，購自青島海博生物技術(shù)有限公司;沙門氏菌單因子血清購自福建寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;微量生化反應(yīng)管購自杭州天河;PCR引物，由上海英淮捷基貿(mào)易有限公司合成;Easy Pure Genomic DNA Kit核酸提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR反應(yīng)試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖、氯化鈉、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 ?樣品的采集與處理

1.2.1 ?樣品的采集 ?采集自煙臺、威海、濰坊地區(qū)的55個祖代、父母代和商品代生產(chǎn)場，共計91個批次種雞群。每個場連續(xù)跟蹤4年，自2013～2016年，種雞場每批種雞孵化的健康雛雞、中途死亡毛蛋每月送檢4～6次，每次送檢25枚，從卵黃囊進行沙門氏菌分離試驗，同時每月對魚粉、籠養(yǎng)雞舍灰塵、平養(yǎng)雞舍墊料等環(huán)境樣本進行沙門氏菌分離。

1.2.2 ?環(huán)境樣本中沙門氏菌的分離 ?魚粉、飼料、墊料、灰塵樣本：無菌稱取25g樣品放入225mL的液體連四硫酸鹽增菌液或SC增菌液中，混勻，于37℃溫箱中培養(yǎng)24h?；\養(yǎng)場采集的糞便拭子、肛門拭子可以直接放入液體連四硫酸鹽增菌液中，根據(jù)送檢樣品采取5個樣品合樣;平養(yǎng)場鞋套法采集樣品，可用滅菌的棉簽蘸取無菌的生理鹽水使棉簽的棉團稍濕潤，涂抹鞋套采樣的一面，然后放入液體連四硫酸鹽增菌液中，根據(jù)送檢樣品采取5個樣品合樣，棉簽增菌一般采用試管增菌，試管內(nèi)加入10mL增菌培養(yǎng)液。胎糞樣本：取1mL樣品接種至10mL增菌液試管中。增菌培養(yǎng)液于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，接種麥康凱、SS、DHL、普通培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h后觀察記錄結(jié)果。

2 ?沙門氏菌的鑒定

2.1 ?沙門氏菌的分離純化及生化鑒定 ?在SS平板上挑取無色半透明或中間帶黑色的可疑菌落進行染色鏡檢，取上述可疑菌落分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、DHL瓊脂平板、SS瓊脂平板以及麥康凱瓊脂、XLT4瓊脂平板上，以獲取單個菌落，置37℃溫箱培養(yǎng)24h再進行鑒別觀察，挑取DHL（或SS或麥康凱或普通營養(yǎng)瓊脂）平板上可疑單個菌落（同時在其他鑒別培養(yǎng)基上符合沙門氏菌特征），傳入肉湯，置37℃溫箱中培養(yǎng)24h后進行生化鑒定。

2.2 ?沙門氏菌單因子血清平板凝集 ?首先用A-F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照，以確定該分離菌為沙門氏菌，能夠被A-F多價O血清凝集者，再依次用O1、O2、O4、O5、O9、O12因子血清做凝集試驗后來判定O群。

H因子血清檢查包括第1相和第2相。先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以最終確定其血清型。

2.3 ?PCR鑒別

2.3.1 ?樣品DNA的提取 ?參照Easy Pure Genomic DNA Kit的使用說明提取樣品DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 ?引物及PCR反應(yīng)體系 ?根據(jù)黃金林等設(shè)計的引物（P1、P2）進行PCR擴增，P1引物序列為：5'-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G-3'，P2引物序列為：5'-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3'， 擴增目的片段為495bp，作為沙門氏菌的通用檢測方法;參照陸廣富等設(shè)計的引物（P3、P4），P3引物序列為：5'-TGT GTT TTA TCT GAT GCT GCA AGA G-3'，P4引物序列為：5'-CGT TCT TCT GGT ACT TCA GAT GAC-3'，擴增目的片段為293bp，將擴增結(jié)果與沙門氏菌生化試驗結(jié)果及分離鑒定進行比較確定最終結(jié)果。引物由上海英淮捷基貿(mào)易有限公司合成。

PCR體系為25μL：2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，ddH2O為7μL，模板為3.5μL。P1、P2 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，53℃退火2min，72℃延伸1.5min，共計30個循環(huán);最后72℃延伸10min。P3、P4 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，共計30個循環(huán);最后72℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束，取7μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

3 ?結(jié)果

3.1 ?2013～2016年種雞場沙門氏菌分離結(jié)果 ?2013～2016年共檢測種雞場沙門氏菌樣品107442份，其中雛雞樣品51825份、毛蛋樣品53989份、環(huán)境樣品1628份，從所有樣品中共分離到4085株沙門氏菌，沙門氏菌分離率為3.8%，見表1。沙門氏菌分離陽性樣品主要來源于毛蛋，其次是墊料和魚粉。

3.2 ?沙門氏菌的分離純化結(jié)果 ?將雛雞、毛蛋卵黃囊等樣品分別接種到營養(yǎng)瓊脂平板和SS平板;雞舍墊料、灰塵、魚粉等環(huán)境樣本則首先通過液體連四硫酸鹽肉湯進行預(yù)擴增，然后接種不同的鑒別培養(yǎng)基，經(jīng)37℃ 24h培養(yǎng)后，挑取陽性菌落進行鏡檢，并分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂、DHL瓊脂、SS瓊脂以及麥康凱瓊脂等鑒別培養(yǎng)基上進行分離純化。沙門氏菌在普通培養(yǎng)基和麥康凱、SS培養(yǎng)基上形成直徑為2～4mm、圓形且邊緣平滑、稍隆起且有光澤菌落，在DHL培養(yǎng)基上則呈現(xiàn)中心黑色的菌落，部分菌株在SS培養(yǎng)基上也能長成黑色菌落，見圖1。

3.3 ?生化反應(yīng)試驗結(jié)果 ?沙門氏菌革蘭氏染色可見革蘭氏陰性、平直不形成芽孢的桿菌，見圖2。沙門氏菌經(jīng)鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后，獲取單個陽性菌落，對于可疑菌落，繼續(xù)進行血清凝集試驗，并同時再挑取單個菌落置于肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)，進行生化鑒定。

大多數(shù)沙門氏菌分離株能發(fā)酵葡萄糖（產(chǎn)酸和產(chǎn)氣）、衛(wèi)矛醇、甘露醇、麥芽糖和黏酸鹽，不發(fā)酵乳糖、蔗糖、丙二酸鹽、水楊苷，不水解尿素或明膠，不產(chǎn)生吲哚，符合副傷寒沙門氏菌的生化特性。部分沙門氏菌不能發(fā)酵衛(wèi)矛醇，而能發(fā)酵丙二酸鹽，符合亞利桑那菌的生化特性，見圖3、表2。

3.4 ?單因子血清凝集法鑒定沙門氏菌 ?參照沙門氏菌血清型與單因子血清凝集試驗結(jié)果對照表。將經(jīng)生化試驗初步鑒定的菌株進行單因子血清凝集試驗以確定分型，選取部分菌株的單因子血清凝集試驗結(jié)果，如表2所示，大多數(shù)沙門氏菌分離株為腸炎沙門氏菌和亞利桑那沙門氏菌，與生化反應(yīng)試驗結(jié)果一致。

3.5 ?PCR鑒定結(jié)果 ?挑取8個沙門氏菌菌株提取細菌基因組DNA，進行PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示：P1、P2引物均擴增出長度為495bp的條帶，符合目的片段大小，見圖4。

P3、P4引物均擴增出長度為293bp的條帶，符合目的片段大小，見圖5。8個分離株均為腸炎沙門氏菌。

3.6 ?2013～2016年分離及鑒定沙門氏菌情況 ?挑選2013～2016年部分典型菌落，經(jīng)接種鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)以及生化反應(yīng)試驗、單因子血清凝集試驗鑒定的菌株有66株，鑒定結(jié)果為：腸炎沙門菌59株，亞利桑那菌6株，疑似沙雷氏菌1株。

4 ?討論

2013～2016年規(guī)?；子鹑夥N雞場共送檢107442份沙門菌樣品，共分離出4085株沙門氏菌，沙門氏菌的平均分離率為3.8%。沙門氏菌分離陽性樣品主要來源于毛蛋，其次是墊料和魚粉。毛蛋對于種雞群是否感染沙門氏菌具有明顯的病原學(xué)指示效應(yīng)，雞蛋的孵化溫度為37.5℃，該溫度同樣適合細菌的繁殖，沙門氏菌在孵化雞胚中生長、擴散，更容易被檢出。歐盟27個成員國在2009年和2010年對肉雞進行沙門氏菌監(jiān)測的結(jié)果表明，沙門氏菌平均分離率為5.0%和4.1%[5]。越南對302份肉雞糞便進行沙氏氏菌的檢測，沙門氏菌的檢出率是7.9%[6]。我們通過對種雞群沙門氏菌的持續(xù)跟蹤檢測，沙門氏菌分離率為3.8%，均低于歐盟和越南的分離率，這也反映出種雞群的生物安全措施明顯要好于商品代雞場。

本研究中2013～2016年規(guī)模化白羽肉種雞養(yǎng)殖場的沙門氏菌分離菌株以腸炎沙門氏菌為主，這與張春萍等對北京地區(qū)不同養(yǎng)殖場沙門氏菌的血清型研究結(jié)果一致，美國2010年從肉雞中分離的沙門菌主要以腸炎和肯塔基沙門氏菌為主，而歐盟2010年分離的血清型主要為腸炎和鴨沙門氏菌[7]。我們在規(guī)?；子鹑夥N雞場并未分離到雞白痢和雞傷寒沙門氏菌，上游國外引種雞群已經(jīng)實現(xiàn)對雞白痢和雞傷寒沙門氏菌的凈化。根據(jù)我們的研究結(jié)果證明，引進國內(nèi)后的白羽肉種雞若采取良好的生物安全控制措施，可以有效預(yù)防這兩個常見病原的感染。

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