沙門菌血清型多態(tài)性與PFGE分型及其相關(guān)性研究*

施怡茹，趙錦江，盧曉蕓，姚正原，陳洪友，徐秋芳△

上海市青浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 201700；2.上海市疾病預(yù)防控制中心病原所檢定所，上海 200336

沙門菌是一種常見(jiàn)的人獸共患病病原體[1]，可通過(guò)污染食物和水來(lái)感染人和動(dòng)物，是引起食物中毒和食源性疾病的重要致病菌[2-3]。根據(jù)沙門菌菌體抗原(O抗原)和鞭毛抗原(H抗原)的不同，血清分型成為沙門菌分型最主要的分型形式。根據(jù)Kauffman-White抗原標(biāo)準(zhǔn),到目前為止，沙門菌屬已有超過(guò)2 700種血清型，而國(guó)內(nèi)分離并報(bào)道的僅有300多種[4],其中流行的優(yōu)勢(shì)血清型有腸炎、鼠傷寒和德?tīng)柋吧抽T菌等[5]。研究沙門菌的優(yōu)勢(shì)血清型別分布情況、分子分型等可以為沙門菌感染性腹瀉的預(yù)防工作提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株 沙門菌菌株收集時(shí)間為2015年1月至2018年12月，均分離自上海青浦區(qū)內(nèi)各級(jí)醫(yī)院腹瀉門診中初診為疑似細(xì)菌性腹瀉患者的糞便標(biāo)本和肛拭子標(biāo)本?；颊咧髟V以腹瀉癥狀為主，腹瀉次數(shù)>3次/天，糞便性狀異常，為水樣便、稀便、黏液便或膿血便等。

1.2儀器與試劑 蛋白酶K、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶為Takara生物工程有限公司產(chǎn)品；SeaKem Gold瓊脂糖粉為美國(guó)Cambraex Bio Rockland公司產(chǎn)品；Gelred染色液為美國(guó)Biotium公司產(chǎn)品；Vitek 2 GN生化鑒定板條為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；沙門菌診斷血清為丹麥國(guó)家血清研究院SSI、泰國(guó)S&A公司的產(chǎn)品；磺胺增菌液(SBG)、XLD平板、沙門菌顯色平板、腸道綜合生化鑒定管等相關(guān)增菌液和培養(yǎng)基均購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、美國(guó)伯樂(lè)公司CHEF Mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、GELDocTMXR凝膠成像儀、美國(guó)Applied Maths公司BioNumerics 7.1分析軟件。

1.3方法

1.3.1腹瀉患者標(biāo)本多病原菌的檢測(cè) 收集疑似細(xì)菌性腹瀉患者的糞便標(biāo)本和肛拭子標(biāo)本，按照《上海市腹瀉病監(jiān)測(cè)實(shí)施方案(2014年試行版)》中的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程對(duì)副溶血性弧菌、霍亂弧菌、志賀菌、沙門菌、致瀉性大腸埃希菌、彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等7類腸道病原菌進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離鑒定，所有分離菌株均由上海市疾病預(yù)防控制中心病原檢定所復(fù)核鑒定。

1.3.2沙門菌血清分型 采用玻片凝集試驗(yàn)，血清型鑒定按照沙門菌血清診斷操作步驟進(jìn)行，根據(jù)測(cè)得的抗原式確定沙門菌的血清型。

1.3.3脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)基因分型 參考美國(guó)CDC PulseNet USA的方法[6]。以H9812參考菌株作分子量標(biāo)準(zhǔn)，該菌株由上海市疾病預(yù)防控制中心提供，所有菌株均用XbaⅠ酶切，PFGE圖譜用BioNumerics 7.1軟件分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清型分布 本研究共收集到384株人腹瀉源性沙門菌，分為34個(gè)血清型、10個(gè)血清群。主要血清群包括B群(34.60%)、C1群(13.80%)、D群(21.90%)和E1群(15.60%)，見(jiàn)表1。

表1 384株沙門菌的血清型分布情況

續(xù)表1 384株沙門菌的血清型分布情況

2.2各年份間的比較 2015年有20個(gè)血清型別，2016年29個(gè)，2017年19個(gè)，2018年17個(gè)。2015-2018年，各年份間鼠傷寒沙門菌構(gòu)成比比較，僅2016年和2017年間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.06，P<0.05)，其余各年份之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各年份間腸炎沙門菌構(gòu)成比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 2015-2018年鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌的構(gòu)成比

2.3PFGE聚類分型結(jié)果 收集的菌株中341株沙門菌完成了PFGE并運(yùn)用Bio Numerics 7.1軟件進(jìn)行聚類分析，以Dice系數(shù)計(jì)算相似度，UPGMA法建樹?；蚪MDNA片段得到較好分離，按1.0的相似系數(shù)，341株沙門菌產(chǎn)生了203種PFGE帶型，按相似系數(shù)0.75分為73個(gè)聚類大簇。相同血清型的菌株基本具有相同的圖譜型別或聚集在一起；存在部分沙門菌的血清型不同，但分型后仍表現(xiàn)出較高的基因同源性。

80株腸炎沙門菌產(chǎn)生28種帶型，最優(yōu)勢(shì)的PFGE型有14株，與該帶型相似性大于90%的有50株，該優(yōu)勢(shì)聚類共64株，占80.0%；77株鼠傷寒沙門菌產(chǎn)生54種帶型；41株倫敦沙門菌產(chǎn)生17種帶型，相似度大于85%的優(yōu)勢(shì)聚類有30株，占73.2%；17株德?tīng)柋吧抽T菌產(chǎn)生13種帶型；14株羅森沙門菌產(chǎn)生9種帶型；12株嬰兒沙門菌產(chǎn)生9種帶型；5株紐波特沙門菌產(chǎn)生5種帶型。

3 討 論

2015—2018年上海市青浦區(qū)的沙門菌血清型別呈現(xiàn)多態(tài)性的特征，各年份優(yōu)勢(shì)血清型基本穩(wěn)定，均以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為優(yōu)勢(shì)血清型，常見(jiàn)血清型為倫敦沙門菌、德?tīng)柋吧抽T菌、羅森沙門菌、嬰兒沙門菌等。同國(guó)內(nèi)其他省市比較，雖然均以腸炎和鼠傷寒沙門菌最為常見(jiàn)，但青浦區(qū)亦發(fā)生了一定的血清型流行變遷[4]。

PFGE分型顯示，流行的人源性沙門菌是多克隆的，由腸炎沙門菌的2種基因帶型(1種聚類簇)和倫敦沙門菌1種基因帶型的克隆株占主導(dǎo)。某些血清型的菌株具有較高的遺傳同源性，基本位于同一聚類簇中，如腸炎、火雞、阿貢納、倫敦、姆班達(dá)卡等沙門菌，其遺傳基因相對(duì)保守。某些血清型別的菌株分型后存在多種帶型且同源性較低，如鼠傷寒、紐波特、乙型副傷寒、德?tīng)柋?、利奇菲爾德等沙門菌，呈現(xiàn)出較高的遺傳多態(tài)性，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5-6]。上述幾種血清型別的沙門菌在多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型(MLVA)、PFGE、多位點(diǎn)序列分型(MLST)分析中，均呈現(xiàn)一致的遺傳保守性或多態(tài)性[7]。有不同血清型別的菌株分型后仍表現(xiàn)出較高的基因同源性，在本研究的菌株中，有1株腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌的PFGE帶型一致，2株湯卜遜沙門菌與嬰兒沙門菌PFGE帶型一致，該現(xiàn)象符合之前的文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]。

沙門菌的血清型別和PFGE分型之間存在一定的相關(guān)性，但并非完全對(duì)應(yīng)。血清型別的鑒定作為沙門菌的分型分類方法已有80多年歷史，現(xiàn)仍是國(guó)際微生物檢測(cè)機(jī)構(gòu)認(rèn)定的微生物學(xué)初篩的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，所以準(zhǔn)確、快速的血清型鑒定對(duì)沙門菌引起疾病的防控具有重要的意義。PFGE被視為多種病原菌分子分型和溯源分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9-10]，也可以為血清凝集試驗(yàn)或核實(shí)血清型別的準(zhǔn)確性提供一定幫助。建立沙門菌的PFGE指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，加強(qiáng)對(duì)流行克隆株和優(yōu)勢(shì)聚類的菌株，以及變異較大的菌株的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和研究，有利于研究散發(fā)病例的菌株之間的基因型差異及聯(lián)系，提高對(duì)傳染病的預(yù)警能力，為食源性疾病暴發(fā)的追蹤溯源和病原菌的確定提供有力的科學(xué)依據(jù)。