HPLC-MS/MS法在伊馬替尼、達(dá)沙替尼與尼洛替尼治療CML患者血藥濃度監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

王 磊，孫文利,楊梓藝，劉 瑞,王紅春,劉紅星,2△

1.河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院,河北廊坊 065201;2.北京陸道培血液病研究院,北京100176

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是骨髓造血干細(xì)胞克隆性增殖形成的惡性腫瘤，占成人白血病的15%[1]，全球年發(fā)病率為(1.6～2.0)/10萬。中國CML患者較西方更為年輕化，國內(nèi)幾個(gè)地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示CML中位發(fā)病年齡為45～50歲，而西方國家CML的中位發(fā)病年齡為67歲[2-5]。CML患者常伴隨BCR/ABL基因突變，而伊馬替尼能特異性靶向抑制由BCR/ABL1基因編碼的癌蛋白的酪氨酸激酶活性，提高了CML患者的生存率，同時(shí)伊馬替尼易誘發(fā)耐藥和患者不耐受。達(dá)沙替尼和尼洛替尼已經(jīng)在世界范圍內(nèi)被批準(zhǔn)為伊馬替尼不耐受和伊馬替尼耐藥患者的治療藥物[6]。達(dá)沙替尼作為CML二線治療用藥，其可抑制BCR/ABL1激酶和SRC家族激酶以及多種其他腫瘤中異?；罨募っ?，包括C-Kit、促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞(EPH)受體激酶和血小板衍生生長因子受體β(PDGFR)，可克服以下原因?qū)е碌囊榴R替尼耐藥：BCR/ABL1過表達(dá)、BCR/ABL1激酶區(qū)域突變、激活包括SRC家族激酶在內(nèi)的其他信號(hào)通路和多藥耐藥基因過表達(dá)[7-16]。尼洛替尼是一種氨基嘧啶衍生物，與伊馬替尼相比，能更加有效和選擇性地抑制BCR-ABL1的未突變形式和大多數(shù)突變形式的酪氨酸激酶活性[17-22]。尼洛替尼對(duì)Ph+白血病治療有效[19]，已被批準(zhǔn)用于伊馬替尼不耐受和伊馬替尼耐藥的Ph+CML慢性期(CML-CP)和CML急性期(CML-AP)患者的治療。在CML患者的酪氨酸激酶抑制劑治療中，治療性藥物監(jiān)測(cè)是一種新的劑量?jī)?yōu)化策略，以獲得更快、更有效的臨床療效[20]，本實(shí)驗(yàn)室采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對(duì)伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)，以期獲得此種藥物最佳療效和避免不良反應(yīng)及治療失敗的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 主要檢測(cè)儀器：AB Sciex 4000Qtrap質(zhì)譜儀(配有Shimadzu 20A色譜系統(tǒng))、Analyst V1.5.2工作站(AB公司)。主要試劑：色譜甲醇(Fisher公司)、蒸餾水(廣州屈臣氏)、色譜甲酸(邁瑞達(dá)科技有限公司)、色譜乙酸銨(邁瑞達(dá)科技有限公司)；伊馬替尼、伊馬替尼-d8、達(dá)沙替尼、達(dá)沙替尼-d8、尼洛替尼、尼洛替尼-d3均為HPLC級(jí)，購自Toronto Research Chemicals公司。

1.2方法

1.2.1液相色譜及質(zhì)譜條件 采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×50 mm,5 μm)，柱溫60 ℃，流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相A為0.1%甲酸甲醇溶液(A)，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液，進(jìn)樣量為1 μL。梯度洗脫：0.01～0.30 min，60%A；0.30～0.50 min，A相濃度線性改變至90%；0.50～0.70 min，A相濃度線性改變至100%；0.70～0.90 min，A相濃度為線性改變至90%；0.90～1.10 min，A相濃度線性改變至60%，保持1.90 min后停止。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正離子檢測(cè),監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；離子噴射電壓為4 500 V；輔助加熱氣溫度(TEM)為500 ℃；霧化氣(Gas1)為55psi；輔助加熱氣(Gas2)為55psi；氣簾氣：30 psi；碰撞氣壓力：中等；用于定量分析的離子反應(yīng)：伊馬替尼 m/z 494.3→394.1，達(dá)沙替尼 m/z 488→401，尼洛替尼 m/z 530.2→289.2；各種質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品貯備液與內(nèi)標(biāo)貯備液的配制 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品伊馬替尼2.500 mg、達(dá)沙替尼 1.000 mg、尼洛替尼 5.000 mg，分別置于3個(gè)小燒杯中，用適量甲醇溶解，分別轉(zhuǎn)移至3個(gè)10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，得0.25 mg/mL伊馬替尼、0.10 mg/mL達(dá)沙替尼和0.50 mg/mL尼洛替尼貯備液。然后分別用甲醇-超純水(1∶1配制)依次稀釋貯備液，得到7個(gè)梯度(1～7號(hào))的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、25.0 μg/mL；達(dá)沙替尼的濃度分別為10、50、100、250、500、1 000、2 500 ng/mL；尼洛替尼的濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、25.0 μg/mL。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品伊馬替尼-d8 1.000 mg、達(dá)沙替尼-d8 1.000 mg，尼洛替尼-d3 1.000 mg，分別置于3個(gè)小燒杯中，用適量甲醇溶解，分別轉(zhuǎn)移至3個(gè)10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，得0.10 mg/mL伊馬替尼-d8母液、0.10 mg/mL達(dá)沙替尼-d8母液和0.10 mg/mL尼洛替尼-d3母液，作為內(nèi)標(biāo)貯備液。分別移取各內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇稀釋，配成一定濃度的混合內(nèi)標(biāo)液使用。

1.2.3上樣檢測(cè)前處理 取待測(cè)標(biāo)本100 μL置于1.5 mL EP管中，然后加入0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液100 μL，渦旋振蕩0.5 min，再加入混合內(nèi)標(biāo)液800 μL，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液檢測(cè)。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別在7個(gè)1.5 mL EP管中加入空白血漿90 μL，并加入含有各濃度梯度伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液10 μL；得伊馬替尼濃度分別為50、100、250、500、1 000、2 000、2 500 ng/mL，達(dá)沙替尼濃度分別為1、5、10、25、50、100、250 ng/mL，尼洛替尼濃度分別為50、100、250、500、1 000、2 000、2 500 ng/mL；按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)，分別以伊馬替尼/伊馬替尼-d8峰面積比值(Y)對(duì)伊馬替尼濃度(X)，達(dá)沙替尼/達(dá)沙替尼-d8峰面積比值(Y)對(duì)達(dá)沙替尼濃度(X)，尼洛替尼/尼洛替尼-d3峰面積比值(Y)對(duì)尼洛替尼濃度(X)，作線性回歸分析，得到伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5回收率、精密度試驗(yàn) 分別在3個(gè)1.5 mL EP管中加入空白血漿90 μL，并加入含有伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼的2、3、5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)混合工作液各10 μL；得伊馬替尼的濃度分別為100、250、1 000 ng/mL，達(dá)沙替尼的濃度分別為5、10、50 ng/mL，得尼洛替尼的濃度為100、250、1 000 ng/mL；按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，各濃度日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)回收率及日內(nèi)精密度，并連續(xù)測(cè)定5 d以計(jì)算日間精密度，精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。

1.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在3個(gè)1.5 mL EP管中加入空白血漿90 μL，并加入含有伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼2、3、5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)混合工作液各10 μL；得伊馬替尼濃度分別為100、250、1 000 ng/mL，達(dá)沙替尼濃度分別為5、10、50 ng/mL，伊馬替尼濃度分別為100、250、1 000 ng/mL；取1批標(biāo)本按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理后置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，放置72 h后分別測(cè)定各標(biāo)本的濃度；其余標(biāo)本于4 ℃冰箱中放置72 h后取出放至室溫，然后按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，考察其穩(wěn)定性。

1.2.7臨床應(yīng)用 收集2015年11月至2018年5月于河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院服用伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼治療的CML患者血漿標(biāo)本共530例，其中伊馬替尼治療患者標(biāo)本249例，達(dá)沙替尼治療的患者標(biāo)本278例，尼洛替尼治療的患者標(biāo)本3例。納入研究的患者均肝腎功能均正常，自愿簽署了知情同意書；伊馬替尼和達(dá)沙替尼均為1天1次給藥，而尼洛替尼為1天2次給藥。臨床標(biāo)本采集時(shí)間為患者下一次服藥前，采集靜脈血3 mL，混勻，EDTA抗凝，對(duì)由于抽血錯(cuò)誤和服藥錯(cuò)誤導(dǎo)致的異常值標(biāo)本予以剔除。室溫(20～25 ℃)下標(biāo)本存放時(shí)間不超過4 h，當(dāng)日進(jìn)行HPLC-MS/MS法檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1色譜質(zhì)譜行為 伊馬替尼-d8、達(dá)沙替尼-d8、尼洛替尼及尼洛替尼-d3二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖，見圖1。伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼質(zhì)譜色譜圖見圖2，血中沒有物質(zhì)干擾伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼的測(cè)定，出峰時(shí)間分別是1.72、2.15、2.64 min，各個(gè)峰型良好，可采用面積定量。

注：A為伊馬替尼-d8；B為達(dá)沙替尼-d8；C為尼洛替尼；D為尼洛替尼-d3。

圖2 伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼質(zhì)譜色譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.001 17X+0.006 17(r=0.999 5)，表明伊馬替尼在50～2 500 ng/mL線性關(guān)系較好，可用于定量，其最低定量限為5 ng/mL；達(dá)沙替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.013 7X+0.000 435(r=0.999 2)，表明達(dá)沙替尼在1～250 ng/mL線性關(guān)系較好，可用于定量；尼洛替尼的回歸方程：Y=1.1e+0.03X+1.05e+0.04(r=0.998 5),表明尼洛替尼在50～2 500 ng/mL線性關(guān)系較好，可用于定量。見圖3。

注：A為伊馬替尼；B為達(dá)沙替尼；C為尼洛替尼。

2.3方法學(xué)評(píng)價(jià) 伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼的相對(duì)回收率和日內(nèi)、日間精密度見表2。伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼的相對(duì)回收率在90.0%～110.0%，日內(nèi)及日間精密度RSD均小于5%，表明該方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性均較好。

表2 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4穩(wěn)定性考察結(jié)果 在4 ℃條件下，血漿標(biāo)本/處理后的血漿標(biāo)本放置72 h后，伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼濃度均基本保持不變，在此條件下測(cè)定CML患者血漿中伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼濃度的穩(wěn)定性良好，見表3。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5臨床應(yīng)用結(jié)果 伊馬替尼血藥濃度為1 400(1 030～1 845)ng/mL，符合伊馬替尼有效谷濃度>1 000 ng/mL的要求，有個(gè)別幾例患者檢測(cè)結(jié)果偏高，易產(chǎn)生急性毒性，與臨床符合。達(dá)沙替尼血藥濃度為7(3～14)ng/mL，符合達(dá)沙替尼100 mg每日1次給藥谷濃度<2.5 ng/mL的要求，其不良反應(yīng)較??；峰濃度>50 ng/mL，表明達(dá)沙替尼吸收較好，有效。尼洛替尼3例，結(jié)果均在線性范圍內(nèi)。見圖3。由此可見，建立的HPLC-MS/MS法能滿足臨床對(duì)伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼血藥濃度檢測(cè)的需求。

圖4 血藥濃度結(jié)果箱式圖

3 討 論

伊馬替尼和達(dá)沙替尼二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖詳見王磊等[22]的前期研究。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼，前處理采用甲醇蛋白沉淀，高速離心的方法去除蛋白，各峰型良好，出峰時(shí)間短，3 min內(nèi)各檢測(cè)物均被檢測(cè)。另外采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，可最大限度避免基質(zhì)效應(yīng)的影響。該方法檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度好，可滿足臨床對(duì)CML患者血藥濃度檢測(cè)的需求。

酪氨酸激酶抑制劑的藥物濃度監(jiān)測(cè)仍處于初級(jí)階段，但已經(jīng)積累的證據(jù)表明，基于藥物動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的劑量調(diào)整對(duì)大多數(shù)CML患者接受酪氨酸激酶抑制劑治療有益[20]。CML患者酪氨酸激酶抑制劑血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)合BCR-ABL監(jiān)測(cè)，能更好地實(shí)現(xiàn)CML患者的無病生存，提高CML患者的生存率[21-22]。進(jìn)行酪氨酸激酶抑制劑血藥濃度檢測(cè)有助于保證治療效果，另外，還可以避免不良反應(yīng)，能為適時(shí)減少劑量提供參考依據(jù)，一定程度上減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本課題組建立的HPLC-MS/MS法可同時(shí)檢測(cè)一代和二代酪氨酸激酶抑制劑，有助于CML患者合理使用藥物，避免藥物劑量不足導(dǎo)致的療效欠佳和劑量過大導(dǎo)致的毒性反應(yīng)；同時(shí)，還有助于避免耐藥的發(fā)生，可為患者更換酪氨酸激酶抑制劑提供參考。酪氨酸激酶抑制劑血藥濃度檢測(cè)有望被臨床納入日常血藥濃度監(jiān)測(cè)的范圍，尤其對(duì)長期服用酪氨酸激酶抑制劑的CML患者尤為重要。