扶正通絡(luò)解毒湯對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度、MMP-9、MDA及SOD的影響?

范才清 陳 姚 張 帆 蒲建璐

（四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610000）

急性心肌梗死（AMI）是患者冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)供血不足或中斷供血情況，導(dǎo)致心肌組織持續(xù)性處于缺血缺氧狀態(tài)進(jìn)而引發(fā)心肌壞死性病變［1］。國(guó)內(nèi)外研究表明，除心功能降低外，AMI患者在病理上還表現(xiàn)為心肌組織鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、心室重構(gòu)和氧自由基生成。上述病理表現(xiàn)涉及多項(xiàng)觀察指標(biāo)，如心肌游離鈣、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）［2-3］。研究上述指標(biāo)的變化趨勢(shì)，對(duì)于揭示AMI發(fā)病機(jī)制、評(píng)估療效、為AMI治療提供新的方向具有積極意義。在中醫(yī)理論中，AMI屬于“卒心痛”范疇，心脈瘀阻、心氣內(nèi)虛是本病的病因病機(jī)［4］。中藥方劑扶正通絡(luò)解毒湯由黃芪、丹參、水蛭、黃連、當(dāng)歸等中藥材組成，具有通絡(luò)解毒、益氣活血的功效［5］，可針對(duì)AMI病因病機(jī)對(duì)癥治療，取得顯著療效，但目前尚缺少中藥治療AMI與西醫(yī)理論中心肌組織鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、心室重構(gòu)和氧自由基生成調(diào)節(jié)關(guān)系的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究［6］。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方式探討了扶正通絡(luò)解毒湯對(duì)AMI大鼠模型血清MMP-9、MDA、SOD活性及心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度的影響及相關(guān)作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60只健康的無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD大鼠，均為雄性，體質(zhì)量200～300 g，周齡10～12周，實(shí)驗(yàn)前體檢身體健康、活動(dòng)正常、心臟功能和心電圖譜正常，預(yù)計(jì)生存期大于6個(gè)月，由上海劍鈍生物科技有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK（滬）：2019-0013。AMI大鼠模型構(gòu)建、飼養(yǎng)和后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均與上海劍鈍生物科技有限公司合作完成。造模前籠養(yǎng)大鼠7 d適應(yīng)環(huán)境，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，濕度（60±10）%，飲用水為純凈水，飼料符合GB14924.3-2010標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)周期4～6周，嚴(yán)格按國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法規(guī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 扶正通絡(luò)解毒湯（組成：黃芪、銀耳各30 g，丹參、生地黃、梔子、白芍各15 g，麥冬12 g，柴胡、紅花、川芎、當(dāng)歸、連翹、檀香、金銀花各10 g，水蛭、黃連各6 g，甘草7 g。藥材由成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)技所大藥房提供，將上述藥材浸泡后用400 mL水煎煮沸，去渣取藥汁，繼續(xù)煎煮濃縮至原液質(zhì)量濃度為2 g/mL）。鹽酸地爾硫片（合心爽，天津田邊制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020126），0.9%氯化鈉溶液（青島日水生物，10801-1），克賽依諾肝素鈉注射液（NOFI WIN?THROP INDUSTRIE，規(guī)格0.6 mL∶6 000 A×aIU，2支）。

1.3 試劑與儀器 PBS緩沖液（上海鼓臣生物技術(shù)有限公司）、戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司）、大鼠血清MMP-9酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海美軒生物科技有限公司，MEXN-R0581）、SOD ELISA試劑盒（上海創(chuàng)祥生物）、MDA ELISA試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司）、組織鈣離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒（杰美基因，GMS50097.2）；大鼠血清CK-MB ELISA檢測(cè)試劑盒（濰坊祺翔生物科技有限公司，MB-6930）、大鼠cTnI ELISA檢測(cè)試劑盒（江西江藍(lán)純生物試劑有限公司，JLC14924）。BLS-X2獸用彩超機(jī)（徐州貝爾斯電子科技有限公司），ST-960多功能酶標(biāo)儀（科華），6/0可吸收縫線（博達(dá)），D-16C臺(tái)式小型冷凍離心機(jī)（賽多利斯），BS124S電子分析天平（賽多利斯），LS-20ECG動(dòng)物心電圖記錄分析儀（北京拜安吉科技有限公司），HX-101E小型動(dòng)物呼吸機(jī)（成都秦盟科技有限公司），UV754N紫外分光光度儀（青島路博）。

1.4 分組與造模 見(jiàn)表1。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分為造模組與假手術(shù)組，每組30只。造模組采用改良冠脈結(jié)扎手術(shù)法制作AMI大鼠模型，術(shù)前以2.5 mL/kg腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，大鼠肌腱反射消失后實(shí)施手術(shù)，取仰臥位，注射肝素鈉，鼠頸前區(qū)除毛、備皮，分離右頸部外靜脈和氣管，連接呼吸機(jī)，潮氣量6 mL/kg，吸氣∶呼氣比為1∶2，呼吸頻率80次/min，胸前取備皮，連接心電監(jiān)護(hù)裝置（心電圖），沿著鎖骨中線做縱切口，剝離皮膚，L4～L5肋間鈍性分離肌層，開胸，剪開心包，輕壓胸廓，暴露心臟，在肺動(dòng)脈圓錐、左心耳間，距冠狀動(dòng)脈起始2～3 mm處用6/0縫線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，此時(shí)大鼠左室前壁變白、心跳減弱，將心臟還納胸腔，關(guān)胸、縫合切口，術(shù)后1～5 min內(nèi)大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背向上抬高≥0.1 mV或病理性Q波作為手術(shù)成功的標(biāo)志。假手術(shù)組僅開胸，不給予冠脈結(jié)扎，術(shù)后2 h抽取鼠尾靜脈血測(cè)定CK-MB活性、cTnI濃度，造模組大鼠血清CK-MB活性比值及cTnI水平較假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），證明造模成功。

表1 兩組大鼠術(shù)后2 h血清CK-MB比值及cTnI水平比較（±s）

表1 兩組大鼠術(shù)后2 h血清CK-MB比值及cTnI水平比較（±s）

與假手術(shù)組比較，△P<0.05

組別造模組假手術(shù)組cTnI（μg/L）1.97±0.46△0.92±0.21 n 30 30 CK-MB2/CK-MB1 1.86±0.42△1.25±0.17

1.5 干預(yù)方法 采用隨機(jī)數(shù)表法將造模成功的30只AMI大鼠分為3組，各組10只，參照60 kg標(biāo)準(zhǔn)成人臨床用藥劑量，利用體表面積-劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系換算灌胃藥液劑量1 mL/100 g。中藥組予扶正通絡(luò)解毒湯：用0.9%氯化鈉溶液將扶正通絡(luò)解毒湯2 g/mL稀釋為1.4 g/mL，灌胃劑量為8 g/kg。西藥組予鹽酸地爾硫片溶液：將30 mg鹽酸地爾硫卓片研成粉末后，加0.9%氯化鈉溶液稀釋為0.75 g/L，灌胃劑量2.6 mg/kg。模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組均在成模24 h后通過(guò)灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，期間檢測(cè)和比較3組大鼠相關(guān)指標(biāo)水平。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血清MDA、MMP-9濃度和SOD活性：在給藥前后抽取鼠尾靜脈血約1 mL置于不含熱原和內(nèi)毒素的試管中，3 000 r/min離心10 min取上清液在2 h內(nèi)完成檢測(cè)，不能在2 h內(nèi)完成檢測(cè)的血清樣本及試劑盒均應(yīng)保存在4℃環(huán)境中。檢測(cè)時(shí)利用96孔板上樣，每組待測(cè)血清樣本做3個(gè)復(fù)孔，按照ELI?SA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求操作，主要步驟為：預(yù)處理→上樣（標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)品稀釋液，平行樣本）→加帶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的一抗→封孔，37℃孵育60 min→洗板（PBS緩沖液洗滌5次）→加二抗，封板，37℃避光孵育15 min→加顯色液、終止液→利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值。檢測(cè)方法為雙抗夾心法，利用酶標(biāo)儀測(cè)定血清MDA、MMP-9和SOD吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度值和單位酶活值。2）比色法測(cè)定梗死區(qū)心肌游離鈣離子濃度：給藥第7日，在抽血完成后處死各組大鼠，通過(guò)手術(shù)取出大鼠心臟組織，在顯微鏡引導(dǎo)下將梗死區(qū)心肌剪成小塊，稱質(zhì)量后用PBS溶液清洗，利用液氮冷凍并碾成粉末，加入裂解液后孵育30 min制成心肌細(xì)胞液，16 000 r/min離心5 min，取上清，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求，利用比色法測(cè)定心肌游離鈣離子濃度，分光光度儀的檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)研究資料之間進(jìn)行對(duì)比分析，計(jì)量資料表示為（）形式，組間兩兩配對(duì)比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料（%）組間兩兩比較采取χ2檢驗(yàn)；組內(nèi)資料兩兩比較采取單因素方差分析，3組及以上資料比較則采取Z檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清MMP-9、MDA和SOD水平比較見(jiàn)表2。給藥7 d后，與給藥前相比，3組AMI大鼠的血清MMP-9、MDA濃度和SOD活性改善水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MMP-9、MDA濃度：中藥組<西藥組<模型組；SOD活性：中藥組>西藥組>模型組。

表2 各組大鼠干預(yù)前后血清MMP-9、MDA濃度及SOD活性比較（±s）

表2 各組大鼠干預(yù)前后血清MMP-9、MDA濃度及SOD活性比較（±s）

與本組干預(yù)前比較，?P<0.05；與中藥組同時(shí)期比較，△P<0.05；與西藥組同時(shí)期比較，▲P<0.05

組別中藥組（n=10）西藥組（n=10）模型組（n=10）時(shí)間干預(yù)前干預(yù)后干預(yù)前干預(yù)后干預(yù)前干預(yù)后MMP-9（nmol/L）465.42±48.17 276.54±24.82*464.98±49.06 382.45±30.95*△465.89±50.47 459.46±48.74*▲MDA（nmol/mg）3.05±0.41 1.24±0.21*3.02±0.35 2.05±0.19*△3.04±0.43 2.97±0.41*▲SOD（nU/mg）5.12±0.95 20.72±2.14*5.14±1.03 13.25±2.95*△5.09±0.91 5.02±1.05*▲

2.2 各組大鼠梗死區(qū)心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度比較 見(jiàn)表3。給藥第7日，3組大鼠梗死區(qū)心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）：中藥組<西藥組<模型組。

表3 各組大鼠梗死區(qū)心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度比較（nmol/L，±s）

表3 各組大鼠梗死區(qū)心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度比較（nmol/L，±s）

與中藥組比較，?P<0.05；與西藥組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別中藥組西藥組模型組n 10 10 10梗死區(qū)心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度159.62±9.74#△208.18±8.43*△321.82±15.19*#

3 討論

AMI是一種發(fā)病率、致死率和致殘率較高的心腦血管疾病。AMI病因的十分復(fù)雜，一般認(rèn)為，冠動(dòng)脈供血供氧不足是誘發(fā)AMI的主因［7］，而國(guó)內(nèi)外近年來(lái)的研究則指出，AMI的發(fā)生和進(jìn)展還很有可能與下述原因有關(guān)。1）心肌細(xì)胞游離Ca2+負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)心肌舒縮功能，其濃度水平也與心肌細(xì)胞興奮程度呈正相關(guān)，而AMI發(fā)生后患者心肌游離Ca2+出現(xiàn)超載，患者心臟收縮和舒張出現(xiàn)障礙，引發(fā)心力衰竭［8-9］。2）心肌組織持續(xù)性缺血缺氧會(huì)引發(fā)心室重構(gòu)，心肌組織通過(guò)分泌MMPs來(lái)降解心肌膠原蛋白和基底膜，重塑心臟適應(yīng)性。而研究也提示，此時(shí)患者血清中MMP-9的濃度較正常水平顯著升高［10-11］。（3）AMI發(fā)生后，患者大腦中氧自由基的產(chǎn)生明顯加快，此時(shí)SOD會(huì)因清除過(guò)多氧自由基而消耗，并產(chǎn)生大量生物毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA，從而損傷患者腦細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，引發(fā)腦梗死等不良反應(yīng)［12］。西醫(yī)針對(duì)AMI成因和進(jìn)展趨勢(shì)，采用鈣離子阻滯劑如硫氮酮等藥物治療，以抑制心肌鈣離子內(nèi)流、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、松弛心血管平滑?。?3］，臨床研究結(jié)果顯示，應(yīng)用硫氮酮治療AMI的有效率為60%～70%，對(duì)于室上性心動(dòng)過(guò)速的療效優(yōu)秀，高達(dá)88%～94%，對(duì)于心血管血氧供應(yīng)改善十分顯著［14］。不過(guò)硫氮酮對(duì)于抗氧化指標(biāo)和心室重構(gòu)的影響少有文獻(xiàn)提及，也具有較多的不良反應(yīng)和禁忌證，因此應(yīng)探尋一種更為安全有效的AMI治療方案，以便獲得更理想的療效和預(yù)后［15］。

近年來(lái)，臨床越來(lái)越重視將中醫(yī)辨證論治或中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病。中醫(yī)理論將AMI歸為“胸痹”“卒心痛”范疇，認(rèn)為AMI的病機(jī)分為稟賦不足、瘀血阻心、痰瘀閉心、情志致郁、寒邪凝滯等。AMI患者的共同病證為心絡(luò)不通，雖原因各異，但均應(yīng)活血散結(jié)、解毒通絡(luò)。中醫(yī)認(rèn)為濁毒是炎癥因子、氧自由基，而鈣調(diào)紊亂、心室結(jié)構(gòu)改變則是“阻絡(luò)”表現(xiàn)［16］。扶正解毒通絡(luò)湯方中含有丹參、黃芪、黃連、梔子、麥冬、水蛭等中藥材，從組方配伍上分析，丹參歸心、肝經(jīng)，可活血祛瘀，通經(jīng)止痛；黃芪可補(bǔ)益正氣；丹參、黃芪二者為君藥，主治胸痹心痛。水蛭可破血通經(jīng)、黃連可清熱解毒，水蛭、黃連為臣藥，主治心經(jīng)實(shí)熱。麥冬可潤(rùn)肺清心、瀉熱生津；柴胡可和解表里，疏肝解郁，升陽(yáng)舉陷；白芍可養(yǎng)血調(diào)經(jīng)止痛，麥冬、白芍和柴胡均為佐藥，主治熱病心煩、胸脅脹痛。連翹、甘草為使，可清熱、解毒、散結(jié)、消腫、調(diào)和諸藥，主治心氣虛，心悸怔忡?；趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)代藥理學(xué)也表明，扶正通絡(luò)解毒湯中的丹參酮ⅡA可顯著縮小心肌梗死范圍，復(fù)方丹參注射液則具有抗心肌缺血、減少心肌細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、抑制Ca2+內(nèi)流的功效；黃芪則富含多糖、皂苷類、黃酮類和氨基酸化學(xué)物質(zhì)，黃芪總皂苷具有抗氧化、清除氧自由基等藥理作用，黃芪甲苷則具有舒張血管平滑肌、緩解肌漿網(wǎng)、保護(hù)腦細(xì)胞等藥理作用，可有效預(yù)防心室重構(gòu)、保護(hù)心肌組織；其余中藥材則具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血壓、抗疲勞、抗炎等藥理作用［17］，這些都是扶正解毒通絡(luò)湯治療AMI的理論基礎(chǔ)。

至今為止，雖有文獻(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞游離Ca2+、MMP-2、MMP-9和心肌抗氧化指標(biāo)水平與AMI療效和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了研究，證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與AMI患者的療效評(píng)估、轉(zhuǎn)歸預(yù)后具有關(guān)聯(lián)性，但仍缺少將中藥療效與心肌細(xì)胞游離Ca2+、MMP-2、MMP-9和心肌抗氧化指標(biāo)聯(lián)系起來(lái)的研究［18］。本研究結(jié)果顯示，給藥后3組AMI模型大鼠的血清MMP-9、MDA濃度、SOD活性及梗死區(qū)心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明扶正通絡(luò)解毒湯可促進(jìn)AMI模型大鼠的MMP-9、MDA濃度和SOD單位活性水平的改善，也能降低缺血心肌組織內(nèi)游離鈣離子濃度水平。這一結(jié)果值得進(jìn)一步研究。