寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯治療AECOPD的GC-TOFMS血清代謝組學(xué)研究?

張 瑞 黃慶松 趙稼螢 黃雪元

（上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201800）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種慢性非特異性炎癥性疾?。?］。痰濁壅肺證是COPD急性加重期（AECOPD）的最主要證型之一。寬胸理肺湯是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院方邦江教授治療痰濁壅肺型AECOPD經(jīng)驗(yàn)方，筆者在臨床上應(yīng)用寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯治療AECOPD取得了更好的臨床療效［2］。本研究運(yùn)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（GC-TOFMS）技術(shù)觀察寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯治療AEOCPD痰濁壅肺證患者的血清代謝產(chǎn)物變化，同時(shí)構(gòu)建相關(guān)代謝通路，從代謝層面研究中藥復(fù)方的可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 1）診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和病情嚴(yán)重程度分級參照2016年GOLD診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］；中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)按照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［4］。2）納入標(biāo)準(zhǔn)：符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)符合中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)的患者，患者氣流受限程度根據(jù)2016年慢性阻塞性肺疾病全球倡議［3］納入GOLD 2～3級，能夠完成肺功能檢測，第1秒用力呼氣量（FEV1%）為30%～80%，吸入支氣管舒張劑后FEV1/用力肺活量（FVC%）<70%，且年齡60～80歲，病情在1周內(nèi)急性加重期；經(jīng)上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。3）排除標(biāo)準(zhǔn)：COPD并發(fā)呼吸衰竭且需要機(jī)械通氣者；因肺結(jié)核、支氣管哮喘、肺部腫瘤、肺間質(zhì)纖維化、支氣管擴(kuò)張等原因?qū)е碌穆钥却颊撸话l(fā)病時(shí)有嚴(yán)重的心功能不全，肝、腎功能不全者，造血系統(tǒng)等諸臟器功能不全疾病和精神疾病者。

1.2 臨床資料 選取2017年4月至2019年4月上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診及住院AECOPD患者60例，經(jīng)中醫(yī)辨證為痰濁壅肺證，采用隨機(jī)、平行對照方法設(shè)計(jì)，按隨機(jī)數(shù)字表將60例患者納入治療組和對照組各30例。另為進(jìn)行代謝組學(xué)檢測對照，本研究共納入同期在筆者所在醫(yī)院體檢中心體檢的健康受試者30名，年齡60～80歲。治療組男性14例，女性16例；平均年齡（66.20±7.13）歲；病情嚴(yán)重程度GOLD 2 級19例，GOLD 3級11例；平均病程（16.77±6.09）年；平均BMI（21.26±3.17）kg/m2；合并高血壓病者17例，2型糖尿病者16例，冠心病者10例。對照組男性16例，女性14例；平均年齡（65.47±8.43）歲；病情嚴(yán)重程度GOLD 2級17例，GOLD 3 級13例；平均病程（17±6.19）年；平均BMI（21.82±2.87）kg/m2；合并高血壓者15例，2型糖尿病者17例，冠心病者11例。兩組性別構(gòu)成、年齡、病情嚴(yán)重程度、病程、BMI、合并癥等方面資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。

1.3 治療方法 納入研究的AECOPD患者均按照診治指南［5］進(jìn)行治療。對照組為西醫(yī)基礎(chǔ)治療：吸氧、祛痰、平喘、抗感染等。治療組在對照組基礎(chǔ)上加用寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯：麻黃9 g，杏仁12 g，法半夏9 g，全瓜蔞30 g，薤白12 g，橘紅6 g，茯苓15 g，甘草6 g，桃仁10 g，蘇子10 g，地龍9 g，白芥子 10 g，萊菔子 10 g。每日1劑，由筆者所在醫(yī)院中藥房煎制，分兩次口服，每次100 mL，7 d為1個(gè)療程，總共觀察1個(gè)療程。

1.4 標(biāo)本采集和制備 治療后兩組患者及健康人群于清晨6∶00左右在室溫下釆取靜脈4 mL，留置于EDTA管中，血液樣本在室溫下自然凝固1 h，收集血清，3 000 r/min離心10 min后收集血漿置于1.5 mL Eppendor f管中，置于液氮萃取后轉(zhuǎn)運(yùn)至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 標(biāo)本檢測和分析 代謝組學(xué)的檢測和分析與上海百趣生物科技有限公司共同完成，包括樣品的處理、GC-TOFMS測試和數(shù)據(jù)處理分析。1）儀器：Agilent 7890A GC-MS色譜儀；PEGASUS HT質(zhì)譜儀，LECO；DB-5MS色譜柱，Agilent；Heraeus Fresco17冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific；Forma 900 series超低溫冰箱，Thermo Fisher Scientific。2）試劑：甲醇，CNW Tech?nologies；氯仿、吡啶、甲氧胺鹽、L-2-氯苯丙氨酸、BST?FA及各化合物標(biāo)準(zhǔn)品，Adamas；FAMEs，REGIS Tech?nologies；純水由Merck Millipore系統(tǒng)制備。3）樣品處理：100 μL血清加入 4倍體積冷甲醇，再加入 10 μL L-2-氯苯丙氨酸沉淀蛋白，離心取上清液低溫減壓干燥；各樣本分別取40 μL混合，制備混合血清進(jìn)行質(zhì)量控制（QC），按相同方法進(jìn)行前處理；提取物用30 μL甲氧胺鹽試劑，80℃孵育30 min后向每個(gè)樣品中加入40 μL BSTFA溶解，70 ℃孵育90 min；之后加入5 μL FAMEs（溶于氯仿），隨機(jī)順序上機(jī)檢測。4）分析條件：采用DB-5MS（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱；進(jìn)樣口溫度280℃，不分流模式，進(jìn)樣量1 μL，載氣（高純氦）流速為3 mL/min；柱箱升溫程序?yàn)?0℃保持1 min后，以10℃/min升至310℃，保持8 min。質(zhì)譜采用標(biāo)準(zhǔn)EI離子源，電離電壓-70 eV，離子源溫度250℃，在全掃描模式下采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量范圍（m/z）50～500，掃描速率12.5 spectr/s。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用ChromaTOF軟件（V 4.3x，LECO）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，應(yīng)用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)定性，匹配質(zhì)譜及保留時(shí)間指數(shù)，將QC樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。得到的峰表輸入Simca 15.0.2件進(jìn)行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）。通過置換檢驗(yàn)，200次隨機(jī)改變分類變量Y的排列順序，得到不同的隨機(jī)Q值后對模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。按照VIP>1，T檢驗(yàn)（T-Test）P<0.05的條件進(jìn)行質(zhì)荷比的篩選后，通過檢索在線數(shù)據(jù)庫（KEGG、HMDB、PubChem）定性可能的差異性代謝物。最后對差異代謝物所在的通路進(jìn)行綜合分析、篩選（包含富集分析和拓?fù)浞治觯?，找到與代謝差異物相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路。

2 結(jié) 果

2.1 各組PCA結(jié)果比較 見圖1。治療后兩組患者與健康組基本處于95%置信區(qū)間，治療組、對照組與健康組主要成分得到了分離，說明各組間代謝物存在顯著差異；從得分圖可見治療組與健康組有靠攏趨勢，與對照組有一定差異，說明治療后治療組與健康組代謝產(chǎn)物接近。

圖1 各組PCA得分散點(diǎn)圖

2.2 各組OPLS-DA及對模型的驗(yàn)證比較 見圖2。治療后兩組患者與健康組的血清樣品OPLS-DA圖中，樣本處于95%置信區(qū)間，治療組與對照組、健康組分布區(qū)域完全分離，說明治療組與對照組能對患者的代謝情況產(chǎn)生影響，且各組代謝情況存在差異。R2Y非常接近1，Q2非常接近1，表明當(dāng)前模型較為真實(shí)可靠，適合解釋各組之間的代謝差異和發(fā)現(xiàn)各組之間的差異性代謝物。置換檢驗(yàn)建立對應(yīng)的OPLS-DA模型獲得隨機(jī)模型的Q2值均小于原模型的Q2值；置換的Y變量比例增大，表面模型具有良好的穩(wěn)健性，擬合良好。

圖2 各組OPLS-DA得分散點(diǎn)圖（左）和置換檢驗(yàn)圖（右）

2.3 兩組治療后差異代謝物變化 見表1，圖3。對治療后兩組患者VIP>1的代謝物保留并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)t檢驗(yàn)，P<0.05的代謝物作為差異代謝物。利用KEGG、HM?DB、PubChem等相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，對代謝物鑒定和代謝通路分析后找到37種差異代謝物，其中12種與本研究相關(guān)有重要貢獻(xiàn)，其中富馬酸、生育酚、D-谷氨酸3種在治療組中呈上升趨勢，其余羥基丙酮、葡萄糖、琥珀半醛、亞油酸甲酯、2-脫氧-D-半乳糖、4-羥基丁酸乙酰酯、二十酸、硬脂酸、木糖9種呈下降趨勢。

表1 兩組差異代謝物變化趨勢比較

圖3 兩組患者代謝物的熱圖

2.4 兩組血漿差異性代謝物的代謝通路分析 將鑒定的12個(gè)差異性代謝物導(dǎo)入KEGG http：//www.ge?nome.jp/kegg/和 Metabo Analyst http：//www.metaboana?lyst.ca/數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建中藥復(fù)方治療AECOPD痰濁壅肺證的相關(guān)代謝通路，總共發(fā)現(xiàn)15條代謝通路，主要相關(guān)的4條代謝通路，代謝通路分析的結(jié)果以氣泡圖所示（見圖4）。按影響值從大到小依次為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，丁酸鹽代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，淀粉與蔗糖代謝，其影響值分別為0.33、0.08、0.06、0.02。見表2。

3 討論

圖4 寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯治療AECOPD痰濁壅肺證血清代謝通路富集分析

表2 代謝通路結(jié)果一覽表

目前普遍的認(rèn)識為AECOPD不僅與氣道炎癥有關(guān)，還是一個(gè)全身系統(tǒng)性炎癥，筆者前期的研究已證明血液中某些炎癥因子水平顯著升高［6-7］。中醫(yī)學(xué)COPD歸屬“肺脹”范疇，古代眾多醫(yī)家認(rèn)為COPD的發(fā)生多由久病肺虛，痰濁潴留，每因再感外邪誘使病情發(fā)作加重，病機(jī)以痰為根本。痰濁壅肺為最常見證型之一，臨床表現(xiàn)上，急性發(fā)作期患者咳、痰、喘及炎癥明顯加重，此階段痰涎較多。寬胸理肺湯由瓜蔞薤白半夏湯、三拗湯、二陳湯3方組成，已經(jīng)證明臨床療效顯著［6-7］，現(xiàn)已進(jìn)入國家中醫(yī)藥管理局診療規(guī)范指南選用方劑。筆者前期基于AECOPD痰濁壅肺證患者進(jìn)行了大量中藥復(fù)方臨床療效和藥物作用機(jī)制方面的研究［2，6］，發(fā)現(xiàn)寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯能更好改善AECOPD患者臨床癥狀，減輕血清炎癥反應(yīng)。

本研究基于GC-TOFMS代謝組學(xué)技術(shù)來評價(jià)西醫(yī)規(guī)范治療基礎(chǔ)上使用寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯后，與單西藥對照組比較，患者的代謝產(chǎn)物有何變化，以探討中藥復(fù)方的作用機(jī)制。結(jié)果篩選出12個(gè)差異代謝物（包括氨基酸、脂肪酸、糖），血清中上調(diào)代謝物比較有意義的是富馬酸、生育酚、D-谷氨酸3種；下調(diào)物質(zhì)中比較有意義的是羥基丙酮、葡萄糖、琥珀半醛、亞油酸甲酯、2-脫氧-D-半乳糖、4-羥基丁酸乙酰酯、二十酸、硬脂酸、木糖。通路富集表明差異代謝物在體內(nèi)主要涉及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，丁酸鹽代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、淀粉與蔗糖代謝4條代謝途徑。

脂類代謝紊亂和炎癥有密切的關(guān)系，游離脂肪酸可以活化巨噬細(xì)胞，吞噬脂滴，形成泡沫細(xì)胞，釋放大量炎性因子，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程［8］。炎癥過程中，脂質(zhì)分解使能源的主要來源增強(qiáng)，游離的脂肪酸含量增高。本試驗(yàn)檢測出中西醫(yī)結(jié)合給藥后硬脂酸、二十酸、亞油酸甲酯等脂肪代謝產(chǎn)物較單純西藥組有回調(diào)趨勢，說明中藥可能是通過降低機(jī)體的脂肪氧化降解過程，減少炎癥因子的釋放，從而恢復(fù)AECOPD導(dǎo)致的機(jī)體脂肪酸代謝紊亂，達(dá)到抗炎作用的。

COPD患者在急性加重期引起急性炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)時(shí)趨化素增多，損害糖代謝過程［9］。血糖可能是影響AECOPD預(yù)后的一個(gè)新的預(yù)測因子，因血糖升高的可能原因有胰島素抵抗、治療時(shí)加用糖皮質(zhì)激素、急性應(yīng)激時(shí)升糖激素分泌增多等［10］。AECOPD患者如伴有高血糖狀態(tài)時(shí)，其血清炎性反應(yīng)程度明顯升高，凝血功能紊亂加劇，肺功能損傷程度進(jìn)一步加重［11］。亦有研究表明內(nèi)毒素刺激后的小鼠較正常小鼠呈現(xiàn)高血糖和高血乳酸含量［12］。以上研究均證實(shí)高血糖與炎癥有密切的關(guān)系。本研究結(jié)果表明加入中藥治療后可以回調(diào)葡萄糖、半乳糖、木糖含量，使糖酵解恢復(fù)。葡萄糖減少亦可能是被大量優(yōu)先氧化以提供能量，使脂肪分解減少，脂肪酸減少，最終氨基酸代謝開始逐漸恢復(fù)正常。

谷氨酸是蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成成分，在生物機(jī)體起著重要的作用，D-谷氨酸是其衍生物。谷氨酸大部分由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLT-1，GLAST）攝取，被谷氨酰胺合成酶（Gs）轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，谷氨酰胺再被轉(zhuǎn)運(yùn)合成谷氨酸，參與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)。谷氨酰胺是體內(nèi)含量最多的條件必需氨基酸之一，作為免疫系統(tǒng)的主要能量來源，能促進(jìn)蛋白合成，在改善COPD患者營養(yǎng)及免疫功能上具有顯著效果［13］。谷氨酰胺可促進(jìn)常年腸道細(xì)胞ATP生成，是腸內(nèi)能量生成的最大貢獻(xiàn)者，并能提高機(jī)體抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)［14］。近期發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺可抑制COPD患者炎性細(xì)胞中p38MAPK通路的活化，并下調(diào)IL-8的表達(dá)，達(dá)到抗炎作用［15］。本研究中中藥干預(yù)后機(jī)體內(nèi)D-谷氨酸增高，提示中藥具有調(diào)節(jié)能量代謝與抗炎作用。

在丁酸鹽代謝通路中4-羥基丁酸乙酰酯可轉(zhuǎn)化為琥珀半醛，琥珀半醛可在琥珀酸半醛脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為琥珀酸，后者是TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，在線粒體生成ATP的過程中起關(guān)鍵作用。琥珀酸可以通過直接抑制PHD酶的活性，調(diào)節(jié)HIF-1α信號傳導(dǎo)，作為炎癥中的一種物質(zhì)代謝信號，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中炎癥的發(fā)生［16］。琥珀酸在TCA循環(huán)中可被琥珀酸脫氫酶（SDH）轉(zhuǎn)化為富馬酸，中西醫(yī)結(jié)合組較西藥對照組治療后富馬酸量增多，說明中藥復(fù)方可能加強(qiáng)4-羥基丁酸乙酰酯轉(zhuǎn)化為富馬酸過程，增強(qiáng)SDH活性，導(dǎo)致琥珀酸含量消耗性減少，促進(jìn)TCA循環(huán)產(chǎn)能，具有抑制炎癥反應(yīng)和改善能量代謝作用。生育酚是維生素E的水解產(chǎn)物。維生素E、生育酚均具有強(qiáng)烈的抗氧化作用，具有保護(hù)血管內(nèi)皮、減少氧化自由基對血管壁破壞的作用［17-18］。COPD患者氧化應(yīng)激及其引起的炎癥反應(yīng)程度較高，抗氧化治療成為目前治療的熱點(diǎn)［19］。血中維生素E水平偏低與急性呼吸道感染程度相關(guān)［20］。中西醫(yī)結(jié)合組較西藥組生育酚含量升高，說明中藥復(fù)方具有抗氧化應(yīng)激及抗炎作用。

綜上所述，本研究采用GS-MS代謝組學(xué)技術(shù)對寬胸理肺湯聯(lián)合三子養(yǎng)親湯干預(yù)AECOPD痰濁壅肺證患者血清內(nèi)源性代謝物的規(guī)律進(jìn)行研究。代謝組學(xué)檢測結(jié)果提示，中藥復(fù)方聯(lián)合常規(guī)西藥治療后血漿代謝物與單純西藥治療后代謝物不同，中藥復(fù)方可能是通過影響能量代謝、糖代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝及提高抗氧化、抗炎作用達(dá)到治療的作用。