絡(luò)風寧1號方對心梗大鼠血管內(nèi)皮功能的治療作用?

孫 天 王 顯

（1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

本文通信作者王顯教授及其團隊認為急性心血管事件的臨床特點與風證動搖不定的特點相類似，表現(xiàn)為發(fā)病迅速、病情變化多端，病位在心絡(luò)，創(chuàng)新提出動脈粥樣硬化絡(luò)風內(nèi)動學說［1-2］，并已經(jīng)得到鄧鐵濤教授、王永炎院士、陳可冀院士及一批專家的認可并共同發(fā)表了胸痹心痛絡(luò)風內(nèi)動證診斷專家共識［3］。根據(jù)絡(luò)風內(nèi)動學說研發(fā)的絡(luò)風寧1號方由徐長卿、地龍、三七、冰片組成，具有祛風通絡(luò)、活血化瘀作用［4-5］。本實驗旨在研究絡(luò)風寧1號方對心梗大鼠血管內(nèi)皮的保護作用，為其防治心血管疾病機制提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，SPF級，體質(zhì)量（250±10）g，由北京維通利華實驗動物中心提供，實驗動物許可證編號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑 絡(luò)風寧1號方，組成：徐長卿、地龍、三七、冰片組成（劑量保密，處方專利申請中），由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥房提供；卡托普利片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號1306032）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號F3056114）；戊巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司，批號H31021742）；內(nèi)皮素（ET）放免試劑盒、一氧化氮（NO）放免試劑盒、前列環(huán)素（PGI2）放免試劑盒、血栓素A2（TXA2）放免試劑盒均購自北京華英生物技術(shù)研究所；血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號162321）、內(nèi)皮細胞蛋白C受體（EPCR）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號162013）均購自北京尚柏生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 JA1003N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；ALC-V8型呼吸機，上海奧爾科特生物科技有限公司；3K15型離心機，北京博勱行儀器有限公司；BCD 185B型冷凍箱，長嶺（集團）股份有限公司；r-911全自動方免計數(shù)儀，中國科技大學實業(yè)總公司。752-P型紫外分光光度計，上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；MultiSkan FC酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。BX60型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；SPOT-Ⅱ數(shù)碼成像系統(tǒng)，Diagnostic Instruments公司；MetaMorph圖像分析系統(tǒng)，Vniversal Imaging公司。

1.4 造模與分組 SD大鼠稱重并按隨機數(shù)字表法均分為假手術(shù)組、模型組、絡(luò)風寧1號組、聯(lián)合用藥組、卡托普利組。采用大鼠左冠狀動脈前降支結(jié)扎的方法制備心肌梗死模型。用1%的戊巴比妥鈉腹腔注射（0.5 mL/100 g）全身麻醉后，背部固定在手術(shù)板上，行經(jīng)喉氣管插管術(shù)，連接呼吸機，以80次/min，吸呼比1∶2，潮氣量0.7～0.8 mL輔助呼吸。在左側(cè)第3、4肋間切開皮膚，逐層鈍性分離肌層，撕裂心包膜使心臟充分暴露，進針位置在主動脈根部約3 mm處，用5/0帶線縫合針結(jié)扎左冠前降支，當心電圖Ⅰ導聯(lián)顯示ST段顯著抬高后，肉眼觀察結(jié)扎部位以下心肌變灰白，搏動減弱，徹底止血后逐層縫合關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組手術(shù)過程相同，僅穿線不結(jié)扎。術(shù)后肌肉注射青霉素連續(xù)3 d。手術(shù)全部過程嚴格無菌操作。造模中假手術(shù)組和絡(luò)風寧1號組各死亡1只大鼠。

1.5 給藥方法 成模后當日絡(luò)風寧1號組及聯(lián)合用藥組予含生藥量4.81 g/（kg·d）的絡(luò)風寧1號方湯劑，卡托普利組及聯(lián)合用藥組予卡托普利藥液7.5 mg/（kg·d），假手術(shù)組及模型組予相同體積蒸餾水。各組均每天灌胃2次，連續(xù)給藥4周。

1.6 標本采集與檢測 1）血管內(nèi)皮活性物質(zhì)檢測。硝酸還原酶法檢測血漿NO，ELISA法檢測血漿PGI2、ET、TXA2含量、血清sEPCR、sTM含量。2）心梗面積測定。取大鼠心臟用4℃預(yù)冷生理鹽水洗去血污，剪去心房、右心室（保留室間隔）及血管、脂肪組織，取左心室-20℃速凍后切片，沿心尖向基底部以2 mm為標準連續(xù)切片，放入1%TTC磷酸緩沖液中，置于恒溫37℃水浴箱染色15 min。染色后梗死區(qū)心肌呈灰白色，未梗死區(qū)呈磚紅色。將梗死心肌與未梗死心肌剝離分別稱質(zhì)量，以梗死心肌占左室心肌質(zhì)量百分比表示梗死范圍。3）心肌組織取材時選擇在左室最大橫徑處橫切，并用4%的多聚甲醛固定備用，制作石蠟切片，用于常規(guī)組織學染色。

1.7 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后3 d，心梗大鼠飲食、活動均減少。實驗過程中，模型組大鼠精神萎靡，活動減少，毛豎欠光澤，舌頭呈絳紫色。其余各用藥干預(yù)組大鼠精神萎靡漸好轉(zhuǎn)，毛豎略帶光澤，舌頭轉(zhuǎn)為紫色。

2.2 各組大鼠血漿NO、PGI2、ET、TXA2含量比較 見表1。模型組血漿NO、PGI2含量明顯低于假手術(shù)組（P<0.01），絡(luò)風寧1號組、聯(lián)合用藥組、卡托普利組大鼠血漿NO、PGI2高于模型組（P<0.05或P<0.01），絡(luò)風寧1號組與聯(lián)合用藥組NO、PGI2與卡托普利組比較無明顯差異（P>0.05）。模型組血漿ET、TXA2含量明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），絡(luò)風寧1號組、聯(lián)合用藥組、卡托普利組大鼠血漿ET、TXA2低于模型組（P<0.05或P<0.01）；絡(luò)風寧1號組與聯(lián)合用藥組ET、TXA2與卡托普利組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 各組大鼠血清中sEPCR、sTM含量比較 見表2。與假手術(shù)組相比，模型組、絡(luò)風寧1號組、聯(lián)合用藥組、卡托普利組血清sEPCR、sTM含量增高（P<0.01）；與模型組比較，假手術(shù)組、絡(luò)風寧1號組、聯(lián)合用藥組、卡托普利組血清sEPCR、sTM含量均降低（P<0.05或P<0.01）；與卡托普利組比較，假手術(shù)組、聯(lián)合用藥組血清sEPCR、sTM含量降低，模型組、絡(luò)風寧1號組血清sEP?CR、sTM含量升高，其中假手術(shù)組、模型組、絡(luò)風寧1號組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

表1 各組大鼠血漿NO、PGI2、ET、TXA2含量比較（±s）

表1 各組大鼠血漿NO、PGI2、ET、TXA2含量比較（±s）

與假手術(shù)組比較，?P<0.01，??P<0.05；與模型組比較，#P<0.01，##P<0.05；與卡托普利組比較，△P<0.01，△△P<0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組絡(luò)風寧組聯(lián)合用藥組卡托普利組n 7 8 7 8 8 NO（μmol/L）119.69±15.50#△72.98±9.12*△△85.93±13.29*101.94±20.29**#91.85±10.86*##PGI2（pg/mL）213.53±11.15#△154.59±24.81*△167.99±26.11*197.54±18.25#184.26±16.34*#ET（pg/mL）58.40±18.83#92.87±11.74*△△73.95±14.40##71.99±15.42##74.04±17.98##TXA2（pg/mL）122.76±27.18#161.26±7.58*△127.69±25.72#127.06±35.79#125.98±22.00#

表2 各組大鼠血清sEPCR、sTM含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清sEPCR、sTM含量比較（pg/mL，±s）

組別假手術(shù)組模型組絡(luò)風寧1號組聯(lián)合用藥組卡托普利組n 7 8 7 8 8 sEPCR 214.68±42.58#△437.25±24.59*△387.99±10.66*#△318.87±35.53*#325.03±29.68*#sTM 62.69±6.98#△95.80±3.44*△89.49±4.34*##△77.88±4.73*#79.67±5.22*#

2.4 各組大鼠心梗情況比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組梗死范圍大（P<0.01）；與模型組比較，絡(luò)風寧1號組、聯(lián)合用藥組、卡托普利組能降低心肌梗死范圍（P<0.05或P<0.01）；與卡托普利組比較，絡(luò)風寧1號組、聯(lián)合用藥組梗死范圍加大，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠心梗情況比較（±s）

表3 各組大鼠心梗情況比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組絡(luò)風寧1號組聯(lián)合用藥組卡托普利組n 7 8 7 8 8左室質(zhì)量（mg）509.12±9.21 765.00±5.25 698.53±10.87 656.08±5.14 679.30±2.41梗死心肌質(zhì)量（mg）0 132.21±7.78 103.42±8.62 77.79±6.96 83.56±8.06梗死范圍（%）0 19.44±4.78*△13.85±5.78##9.78±3.86#11.58±3.03#

2.5 各組心梗大鼠心肌組織病理觀察 見圖1。HE染色顯示，假手術(shù)組心肌結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列整齊，無腫脹壞死萎縮。模型組發(fā)生大面積局灶性病變，變性壞死明顯，心肌纖維排列紊亂、斷裂，心肌細胞疏松、腫脹，存活心肌組織被分隔成島狀或細帶狀。絡(luò)風寧1號組：心肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)病理改變與模型組相似，但心肌梗死區(qū)病變范圍較模型組減小，較卡托普利組病變范圍增大。聯(lián)合中藥組：心肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)病理改變與模型組相似，但心肌梗死區(qū)病變范圍較模型組顯著減小，較卡托普利組病變范圍減小。卡托普利組：心肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)病理改變與模型組相似，但心肌梗死區(qū)病變范圍較模型組、絡(luò)風寧1號組減小。

圖1 各組心梗大鼠心肌組織病理觀察（HE染色，400倍）

3 討論

血管內(nèi)皮作為循環(huán)血液與血管平滑肌之間的中介組織，可以合成和分泌許多血管活性物質(zhì)作用于血管平滑肌，從而影響血管的收縮與舒張功能。NO為主要的舒張松弛因子，ET為主要的縮血管因子，這兩類活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)血管收縮、舒張功能方面具有相互拮抗作用，以維持血管及血液內(nèi)環(huán)境的平衡。心梗患者和心梗大鼠模型中均存在NO合成減少和ET增多［6-8］。內(nèi)皮細胞釋放的PGI2主要作用是抑制血小板聚集，并且拮抗TXA2使血管擴張，TXA2由血小板產(chǎn)生，具有血小板凝聚及血管收縮作用。大量臨床及實驗證實心?；颊邇?nèi)皮細胞合成和釋放的PGI2減少，而TXA2增加［9-11］，從而使血管結(jié)構(gòu)改變，促進血栓形成，造成血管內(nèi)皮損傷。正常狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細胞通過其抗凝作用維持血液正常流動，其主要與蛋白C系統(tǒng)和凝血酶Ⅲ-硫酸乙酰肝素密切相關(guān)，其中EPCR、TM是蛋白C系統(tǒng)中的兩個關(guān)鍵蛋白［12-14］。當血管內(nèi)皮細胞受到損傷時EPCR、TM被釋放入血循環(huán)，使得血漿中sEPCR、sTM升高，故血漿sEPCR、sTM水平的過度增高可反映血管內(nèi)皮細胞的損傷狀態(tài)，并提示體內(nèi)內(nèi)源性凝血酶生成增多，故sEPCR、sTM可作為高凝狀態(tài)的標志之一［15］。

中醫(yī)學沒有“心肌梗死”的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)“胸痹”“中風”等范疇。中醫(yī)認為心肌梗死病位在血脈，根本在臟腑，病性屬于本虛標實。臨床研究證實，胸痹心痛多為反復(fù)性、陣發(fā)性。從冠心病疼痛部位和性質(zhì)看，許多患者除了典型的心前區(qū)疼痛外，還累及下頜部、咽頸、肩臂等多個部位，患者的疼痛性質(zhì)也分為刺痛、絞痛、悶痛等多種形式，這種發(fā)病特點與中醫(yī)學風邪類似?；颊咝碾妶D表現(xiàn)特點也呈現(xiàn)諸如ST段及T波動態(tài)改變、新發(fā)房室阻滯、突發(fā)室性心動過速、室顫等，其多變的形式類似于中醫(yī)的風證，這就說明中醫(yī)風證與胸痹心痛存在著內(nèi)在聯(lián)系［16-18］。通信作者王顯教授及其團隊在臨床實踐中針對胸痹病首次提出絡(luò)風內(nèi)動學說，強調(diào)治療當以祛風通絡(luò)、活血化瘀為主。課題組根據(jù)《太平圣惠方》提到的治療邪毒癘氣傳入心包所致的心痛，癥見憋悶欲死，可以用鬼督郵、安息香治療。本研究選擇具有祛風通絡(luò)、活血化瘀作用的鬼督郵（徐長卿）、地龍、三七、冰片4味中藥組成絡(luò)風寧1號方。絡(luò)風寧1號方中徐長卿祛風止痛，地龍清熱通絡(luò)共為君藥，共奏祛風通絡(luò)之功，三七散瘀止痛為臣藥，冰片清熱止痛，調(diào)和諸藥。諸藥相合以祛風通絡(luò)為主，整體調(diào)節(jié)臟腑功能，做到標本兼顧［19］。本實驗采用心梗大鼠模型，于藥物干預(yù)4周后觀察血漿NO、PGI2、ET、TXA2、sEPCR、sTM含量變化，結(jié)果顯示絡(luò)風寧1號方可以增加NO、PGI2含量，降低ET、TXA2、sEPCR、sTM含量，說明絡(luò)風寧1號方可能通過增加NO、PGI2含量，降低ET、TXA2、sEPCR、sTM含量減輕心血管內(nèi)皮損傷，降低心肌梗死面積，改善心肌組織病理變化，進而減輕心梗大鼠心肌損傷，這對治療心肌梗死大有裨益。絡(luò)風寧1號方更多的有效機制有待進一步研究。