參桂湯對大鼠急性心肌缺血的保護作用?

王鳳儒 徐京育 杜 琳 成春鋒 梁 群△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

心肌缺血是由于冠脈循環(huán)與心肌供需失衡而引起的一類臨床常見疾病，其發(fā)病機制復雜，病死率高，嚴重影響人們的生活質量［1-3］。近年來隨著中醫(yī)藥對心肌缺血保護作用的研究逐漸深入，臨床上治療心肌缺血的中成藥復方制劑日益增多［4-7］。中醫(yī)藥治療冠心病心絞痛臨床效果顯著且耐藥性較少，優(yōu)勢明顯［8-9］。參桂湯由丹參、苦參、玄參、桂枝4味中藥組成，是本科治療冠心病心肌缺血及心律失常的常用方劑。本實驗予垂體后葉素誘導大鼠出現(xiàn)急性心肌缺血狀態(tài)，觀察各組大鼠心肌缺血及心律失常程度，明確參桂湯抗心肌缺血的機制及作用靶點，為新藥的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，體質量220～250 g，雌雄各半，SPF級，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供。

1.2 試藥與儀器 參桂湯，藥物組成：苦參30 g，丹參20 g，玄參20 g，桂枝15 g；由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科按原生藥質量濃度1.530 g/mL規(guī)格煎制。0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號0B72H2），垂體后葉素（寧波第二激素廠，批號150624），鹽酸胺碘酮（賽諾菲杭州制藥有限公司，批號8HG0313），3%戊巴比妥鈉；乳酸脫氫酶測定試劑盒（富士膠片和光純藥株式會社，批號AH991），超氧化物歧化酶（SOD）活性試劑盒（北京誠林生物科技有限公司，批號201811），丙二醛（MDA）試劑盒（北京誠林生物科技有限公司，批號201811），一氧化氮合成酶（iNOS）試劑盒（北京誠林生物科技有限公司，批號201811）。ECG-1150型心電機，AB204-N電子秤。低溫高速離心機（日本日立公司），穩(wěn)壓電源（天能，EPS300），超低溫冰箱（中科美菱，DW-HL328），多功能微孔板檢測儀（Infinite M1000 Pro，Tecan，瑞士），Milli-Q純水儀（Milli-Q Gradient，Millipore，美國），托盤天平（天津醫(yī)療器械廠），常規(guī)手術器械若干（京津醫(yī)療器械廠）。

1.3 分組與給藥 將56只大鼠隨機分為7組：空白組，假手術組（予等體積0.9%氯化鈉溶液）及模型組（予等體積0.9%氯化鈉溶液），胺碘酮（25 mg/kg）組，參桂湯高（3.060 g/200 g）、中（1.530 g/200 g）、低（0.765 g/200 g）劑量組，每組8只，連續(xù)灌胃給藥14 d。

1.4 模型制備 末次給藥1 h后，稱取大鼠體質量，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行腹腔注射麻醉，固定并連接心電圖機，測定心電圖至正常（麻醉后測定心電圖S點不高于基線為合格）。于5～10 s內完成各組大鼠舌下靜脈注射垂體后葉素（0.5 U/kg，1 U/mL），空白組及假手術組除外。

1.5 標本采集與檢測 觀察并記錄注射垂體后葉素后各組大鼠5、15、30、60、300 s的ECG，20 min后處死大鼠，于腹主動脈處采血5 mL，放置于4℃冰箱1 h，3 000 r/min冷凍離心10 min，取血清2 mL放入EP管內，-80℃冰箱保存。測定時快速解凍，ELISA法測定血清iNOS、MDA含量和SOD的活性，按照試劑盒說明書測定，酶標儀測定吸光度A值（波長為450 nm）。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。進行組間方差分析及t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間段心電圖ST段表現(xiàn)比較 見表1。在注射垂體后葉素之前各組之間無明顯差異，注射垂體后葉素后，模型組在5 s時ST段顯著抬高，抬高幅度超過0.1 mV，與空白組比較具有顯著差異（P<0.01），提示造模成功。模型組給藥后15 s內ST段持續(xù)升高，30 s時出現(xiàn)回落，60 s回落明顯，300 s時ST段接近于正常。各給藥組在注射垂體后葉素后均能夠對抗ST段的升高，升高幅度均不超過0.1 mV，與模型組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。各給藥組ST段在15 s時已出現(xiàn)明顯回落，時間較模型組提前，與模型組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。造模后60 s，與模型組比較，各藥物組ST段均顯著性降低，效應強度為：胺碘酮組>參桂湯高劑量組>參桂湯中劑量組>參桂湯低劑量組。

表1 各組大鼠不同時間段心電圖ST段表現(xiàn)比較（mV，±s）

表1 各組大鼠不同時間段心電圖ST段表現(xiàn)比較（mV，±s）

與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同

注射垂體后葉素后組 別n 注射垂體后葉素前5 s 15 s 30 s 60 s 300 s空白組假手術組模型組胺碘酮組參桂湯低劑量組參桂湯中劑量組參桂湯高劑量組8 8 8 8 8 8 8 0.03±0.02 0.02±0.02 0.02±0.03 0.02±0.02 0.02±0.02 0.02±0.01 0.03±0.01 0.05±0.02△△0.03±0.01△△0.22±0.15 0.06±0.05△△0.09±0.03△0.07±0.06△0.05±0.07△△0.04±0.01△△0.02±0.02△△0.25±0.11 0.03±0.03△△0.04±0.02△△0.04±0.03△△0.02±0.03△△0.04±0.03△0.02±0.02△0.21±0.12 0.02±0.01△△0.04±0.02△0.03±0.01△△0.02±0.01△△0.04±0.02△△0.03±0.02△△0.14±0.09 0.02±0.03△△0.03±0.01△△0.01±0.02△△0.02±0.00△△0.04±0.01△△0.03±0.03△△0.06±0.03 0.01±0.00△△0.02±0.00△△0.01±0.00△△0.01±0.00△△

2.2 各組血清iNOS、MDA、SOD水平比較 見表2?？瞻捉M與假手術組之間無統(tǒng)計學差異，模型組大鼠血清中iNOS、MDA的活性水平明顯高于空白組，SOD活性水平顯著低于空白組（P<0.05），提示造模成功。各給藥組與模型組比較血清SOD活性水平不同程度提高，血清MDA、iNOS活性水平不同程度降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。在降低iNOS和MDA方面，參桂湯高、中劑量組與胺碘酮組無統(tǒng)計學差異（P>0.05），參桂湯低劑量組降低大鼠血清中MDA的水平不如胺碘酮組有效（P<0.01）。

表2 各組血清iNOS、MDA、SOD水平比較（±s）

表2 各組血清iNOS、MDA、SOD水平比較（±s）

組別空白組假手術組模型組胺碘酮組參桂湯低劑量組參桂湯中劑量組參桂湯高劑量組n 8 8 8 8 8 8 8 iNOS（μmol/L）0.59±0.015 0.62±0.017 1.71±0.105**1.19±0.128△△1.39±0.038△△1.15±0.069△△0.95±0.080△△MDA（nmol/L）0.79±0.418 0.91±0.180 1.68±0.131*1.22±0.059△1.40±0.019△1.23±0.108△△1.09±0.076△△SOD（ng/L）45.67±5.894 44.85±8.678 14.28±4.740**32.40±1.264△△18.95±0.263△28.88±0.620△△31.30±0.876△△

3 討 論

1938年Milville用垂體后葉素成功建立急性心肌缺血動物模型，此后學者對該模型分別從心電圖、冠脈流量、血流動力學等方面進行缺血效應的觀察，均取得了良好的效果，因此常被用于模擬臨床變異性心絞痛的發(fā)病過程。該模型操作簡單易行，成功率高，可以用不同劑量的垂體后葉素造成不同程度的心肌缺血損傷，后來也成為眾多學者研發(fā)抗心肌缺血藥物的經典模型。垂體后葉素中含有血管升壓素，大劑量的垂體后葉素能夠使全身血管平滑肌收縮，該作用更多的突出表現(xiàn)在收縮毛細血管和小動脈，造成外周阻力增加，血壓升高，加重心臟負荷，同時也可引起冠脈血管痙攣，造成心肌急性缺血缺氧［10］。我們采用此模型來觀察參桂湯對垂體后葉素所致大鼠急性心肌缺血的保護作用。

心電圖ST段的變化反映了心肌缺血性損傷的范圍及程度，本實驗結果表明參桂湯高、中、低劑量均能夠明顯抑制垂體后葉素引起的大鼠心電圖ST段的變化，降低大鼠心肌缺血的程度和陽性率，說明參桂湯具有抗心肌缺血作用。

當心肌急性缺血缺氧時，無氧糖酵解就會成為ATP的主要來源［11］，氧自由基的生成就會增加，造成廣泛的氧化損傷，并可激發(fā)炎癥反應［12］。同時氧自由基的增加也會加重脂質過氧化，SOD是氧自由基的主要代謝酶，主要作用是清除氧自由基，減輕氧自由基對心肌細胞的損傷［13］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血時會產生大量的氧自由基，SOD的活性水平會明顯下降，SOD可以用于評估脂質過氧化反應的程度［14］。MDA是氧自由基脂質過氧化的最終產物，其活性水平能夠反映脂質過氧化的程度以及細胞損傷程度［15］。iNOS在正常生理情況下含量極低，當發(fā)生心肌缺血缺氧時，多種炎性因子表達增多，促使巨噬細胞分泌大量的iNOS，同時iN?OS的活化也會增加炎性因子的分泌，二者惡性循環(huán)，加重心肌細胞的損傷［16］。因此MDA、SOD和iNOS能夠間接反映心肌損傷程度。

本實驗結果表明參桂湯高、中、低劑量均能改善因垂體后葉素引起的大鼠急性心肌缺血，參桂湯高、中劑量組能夠顯著降低急性心肌缺血大鼠血清中MDA水平，降低iNOS的含量，提高內源性抗氧化性酶SOD的含量，從而表明參桂湯可能通過抗氧自由基損傷，減輕脂質過氧化反應等達到改善心肌缺血缺氧的作用。

心肌缺血在中醫(yī)可歸于“胸痹”“心悸”范疇。病理基礎為心之氣血兩虛日久，血瘀、濕濁等邪毒痹阻于心而致心脈不通，瘀久化熱。治療上以補虛為本，兼以清熱、活血、化濕。補虛者，補心之陰陽，心陽足則溫煦心之血脈，使血脈流通，是心陰充沛的前提條件，心陰充則心血滋養(yǎng)臟腑，使五臟得養(yǎng)，是心陽充足的物質基礎。參桂湯中苦參為君藥，具有苦寒入心，清熱燥濕的作用，正如《本草經百種錄》所言“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦參專治心經之火”。丹參、玄參共為臣藥。丹參苦，微寒，歸心、心包、肝經，中醫(yī)古語云：一味丹參飲，功同四物湯；《本草綱目》記載其有活血，通心包絡的功效；《醫(yī)林改錯》中強調治療心悸時若百方無效，則可換用活血化瘀之法，可見奇功。丹參一味既補血又活血，實乃心經要藥。玄參苦、微寒，入腎經，滋養(yǎng)腎陰。心腎兩臟以少陰經相連，腎陰充則可消心火又不傷心陽。以桂枝為佐藥，桂枝一味其味辛、甘、溫，其溫陽之效甚佳，又不似附子之燥熱，又入心、肺、膀胱經，《別錄》云“桂通血脈”，《素問》曰“心主身之血脈”，故而桂枝乃溫心陽、通血脈之佳品，丹參養(yǎng)心陰，桂枝補心陽，兩者合用，效果甚佳。參桂湯藥味少，療效高，具有補虛、清熱、活血、燥濕的作用。綜上所述，參桂湯通過提高SOD活性水平，降低氧自由基含量，減輕脂質過氧化，從而起到保護缺血心肌的作用。