破格救心湯對心肌梗死大鼠室性心律失常發(fā)生與心功能的影響?

曹海明 丘暉亮 趙 永 章澤釗 李雪山

（1.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東省中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

心肌梗死后患者易發(fā)生各種惡性室性心律失常，成為心梗后患者死亡的重要原因之一，而心梗后心律失常的具體發(fā)生機制仍不清楚。有文獻研究發(fā)現(xiàn)［1-2］，交感神經(jīng)重構是心梗后致命性室性心律失常發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，主要表現(xiàn)在梗死后心肌組織區(qū)域性交感神經(jīng)去支配與高支配現(xiàn)象，進一步導致心肌組織電生理發(fā)生紊亂，引起心律失常的發(fā)生。目前諸多文獻研究顯示［3-5］，局部組織或循環(huán)中的神經(jīng)生長因子與梗死后交感神經(jīng)重構有關。

目前不少臨床研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在防治心梗后心律失常方面起到了一定的作用，但心梗后應用中醫(yī)藥改善心臟自主神經(jīng)重構方面的基礎研究較少，且多局限在中成藥方面，中藥方劑尚未有充分的基礎研究證據(jù)。破格救心湯為當代古中醫(yī)學派領頭人李可老中醫(yī)于20世紀70年代創(chuàng)制。該方以《傷寒論》中“回陽救逆”四逆湯為底方，合近賢張錫純于《醫(yī)學衷中參西錄》中“救逆固脫”之來復湯去芍藥加磁石而成，并結合臨床實際，適當調(diào)整用藥劑量，臨床應用治療心梗卓有成效。同時在基礎研究方面，破格救心湯也有不少進展，但多局限于心力衰竭的研究，對心梗后心律失常方面的作用暫未見報道。因此，本研究立足于中醫(yī)基本理論來探討中藥方劑破格救心湯對心梗后心律失常的發(fā)生及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠35只，體質(zhì)量200～250 g，由南方醫(yī)科大學動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2011-0029。動物飼養(yǎng)于清潔級動物房，自由進食進水；飼養(yǎng)條件：采用晝夜間斷照明，每日12 h光照，室溫23～25℃。

1.2 實驗藥物 破格救心湯，組方：附子200 g，干姜60 g，炙甘草60 g，山茱萸120 g，生龍骨、生牡蠣各30 g，活磁石粉30 g，高麗參30 g（另煎），麝香0.5 g（沖）。藥材均來自廣東省中醫(yī)院中藥房，加水1 500 mL，文火濃煎至400 mL，生藥質(zhì)量濃度1.40 g/mL。注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，批號：F6032104，規(guī)格：80萬U/支。戊巴比妥，德國默克公司，批號：150828，規(guī)格：5 g。

1.3 試劑與儀器 酶標儀（美國Gene公司，EonC型）；小型動物呼吸機（美國CWE公司，SAR-830-P）；電生理刺激儀（以色列AMPI公司，ISO-Flex型）；神經(jīng)生長因子檢測試劑盒（武漢博士德生物有限公司，批號：EK0471）；高分辨率超聲影像系統(tǒng)（加拿大Visual Son?ics公司，Vevo2100）。

1.4 分組與造模 給予大鼠腹腔內(nèi)注射1%的戊巴比妥（0.45 mL/100 g）進行麻醉并固定，于手術區(qū)備皮、消毒，沿胸骨中線切開皮膚，暴露胸骨及肋軟骨，從左側第四肋間打開胸腔，充分暴露心臟，剪開心包，暴露出冠狀動脈，使用6/0線結扎左前降支。觀察心電記錄儀較結扎前的動態(tài)變化，以Ⅰ、Ⅱ、aVL導聯(lián)ST段抬高，肉眼見結扎區(qū)域變白、收縮力降低，證明結扎成功。術后肌肉注射青霉素40萬單位以預防感染。假手術組大鼠僅暴露冠狀動脈不結扎，其余操作同模型組。大鼠心肌梗死模型初始1周死亡率較高，用25只SD大鼠制作模型，其中5只死亡，所以造模1周后存活20只大鼠。將造模成功的20大鼠隨機分為模型組和破格救心湯組。假手術組由于未結扎冠狀動脈，存活10只，最終30只大鼠納入實驗，每組大鼠10只。所有實驗方法和步驟均符合動物實驗守則和倫理委員會的要求。

1.5 給藥方法 于建模成功后第2日開始給藥，破格救心湯組予破格救心湯藥液10 mL/kg灌胃，假手術組和模型組予飲用水10 mL/kg灌胃，每日2次，持續(xù)4周。

1.6 大鼠心臟超聲檢測 術后第4周對各組大鼠進行心臟超聲檢測，在檢測前對大鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥（0.45 mL/100 g）進行麻醉，胸前區(qū)備皮，采用二維超聲和M型超聲檢測心臟結構和功能。檢測指標包括左心室收縮期末內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張期末內(nèi)徑（LVEDD）、左室射血分數(shù)（EF）。以上指標均連續(xù)檢測3個心動周期，記錄并求其均值。

1.7 心律失常誘發(fā)實驗 4周時，對大鼠進行腹腔麻醉后，連接心電監(jiān)護裝置，并行氣管插管連接呼吸機，打開胸腔暴露心臟，將雙極起搏電極插入大鼠心肌梗死的周邊區(qū)心肌1 mm深，其中周邊區(qū)范圍應以結扎線為標志，梗死蒼白區(qū)至邊緣3 mm以內(nèi)，兩電極應相隔2 mm，非模型組起搏電極應放在心臟的相應部位。采用多導心電記錄刺激系統(tǒng)施加短陣高強度刺激，周長60 ms，脈寬10 ms，每次刺激持續(xù)時間30 s，間斷1 min后進行下一次刺激，起搏電壓從4 V開始，每次遞增1 V，以引起室顫的最低強度為室顫閾值。在測定室顫閾值后，行程控刺激，S1 S1=150 ms，S1 S2=120 ms，以-5 ms反掃，脈寬為2 ms，刺激強度為舒張期起搏閾值的2倍，連續(xù)發(fā)放8個S1刺激后再發(fā)放早搏刺激S2，至S2不能引起相應的QRS波的S1 S2最長間期即為該位置的有效不應期。室性心律失常評分標準為0分：不能誘發(fā)心律失常；1分：3個期外刺激誘發(fā)非持續(xù)性快速性心律失常；2分：3個期外刺激誘發(fā)持續(xù)性快速性心律失常；3分：2個期外刺激誘發(fā)非持續(xù)性快速性心律失常；4分：2個期外刺激誘發(fā)持續(xù)性快速性心律失常；5分：1個期外刺激誘發(fā)非持續(xù)性快速性心律失常；6分：1個期外刺激誘發(fā)持續(xù)性快速性心律失常；7分：在基礎周長100 ms起搏20個期間發(fā)生快速心律失常；8分：PES前心臟停止，PES的終點是誘導出至少6個連續(xù)的非起搏驅動的期前室性搏動。

1.8 標本采集與檢測 1）血清中NGF檢測。心律失常誘發(fā)實驗結束后，各組大鼠眼眶取血，并收集全血，標本在自然狀態(tài)下放置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清并分裝于凍存管中-80℃保存待用。采用ELISA法檢測大鼠血清中NGF濃度，選用神經(jīng)生長因子檢測試劑盒，所有操作按試劑盒說明進行，采用基因公司EonC型酶標儀測樣本吸光度值。2）大鼠心肌組織病理學觀察。處死大鼠后，取心臟，常規(guī)制備心肌組織石蠟切片，烘烤后脫蠟脫水，進行HE染色、Masson染色，封片后置于倒置顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.9 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織切片病理變化 見圖1，圖2。結扎大鼠左前降支后，結扎以下的局部心肌組織變紫、蒼白；術后4周處死大鼠時，可見梗死區(qū)顏色蒼白，與非梗死區(qū)分界清楚。經(jīng)HE染色及Masson染色發(fā)現(xiàn)，假手術組大鼠心肌組織結構正常，心肌細胞形態(tài)完整，心肌纖維排列整齊，胞漿紋理清晰。模型組心肌細胞出現(xiàn)變形、破裂、壞死，心肌纖維排列紊亂，部分出現(xiàn)斷裂、分離，同時伴有炎性細胞浸潤。破格救心湯組心肌細胞亦出現(xiàn)變形、斷裂、壞死，但心肌纖維斷裂現(xiàn)象較模型組明顯減輕。

圖1 各組大鼠心肌組織病理切片（HE染色，100倍）

圖2 各組大鼠心肌組織病理切片（Masson染色，100倍）

2.2 各組大鼠心功能指標比較 見表1。經(jīng)統(tǒng)計分析，與假手術組相比較，模型組及破格救心湯組EF明顯降低，LVEDD及LVESD明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）；破格救心湯組EF明顯高于模型組，LVEDD及LVESD明顯低于模型組（均P<0.05）。

表1 各組大鼠心功能水平指標比較（±s）

表1 各組大鼠心功能水平指標比較（±s）

與假手術組比較，?P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。下同

組 別n EF（%）LVEDD（mm）LVESD（mm）假手術組模型組破格救心湯組10 10 10 64.37±2.52 36.16±4.41*39.53±3.02*△7.65±0.57 9.39±0.96*8.63±0.79*△5.21±0.58 8.11±0.91*7.24±0.65*△

2.3 各組大鼠心律失常評分比較 見表2。各組大鼠在梗死周邊區(qū)及相應部位采用短陣高強度電刺激均成功誘發(fā)出室顫。與假手術組相比較，模型組與破格救心湯組室性心律失常評分明顯升高（均P<0.05），而破格救心湯組室性心律失常評分較模型組降低（P<0.05）。

表2 各組大鼠室性心律失常評分、NGF水平比較（±s）

表2 各組大鼠室性心律失常評分、NGF水平比較（±s）

組 別n 室性心律失常評分（分）NGF（pg/mL）假手術組模型組破格救心湯組10 10 10 1.10±0.74 4.50±1.08*3.40±1.35*△81.25±22.13 353.60±19.89*315.24±25.67*△

2.4 各組大鼠血清中神經(jīng)生長因子NGF水平比較見表2。模型組與破格救心湯組NGF水平明顯升高（均P<0.05），而加破格救心湯組血清中NGF含量較模型組減少（P<0.05）。

3 討 論

目前心血管疾病的發(fā)生率不斷升高，心肌梗死的發(fā)生率也逐年上升［6］。大鼠因其心肌結構和特征與人類相似，所以成為研究人類心肌梗死的理想動物模型。本研究通過采用結扎大鼠心臟左前降支成功構建大鼠心肌梗死模型，以探討破格救心湯對大鼠心律失常及心功能影響的可能機制。

既往基礎研究報道破格救心湯能夠通過調(diào)控RAAS系統(tǒng)改善心功能，同時也對心肌細胞有保護作用［7］。本研究中，經(jīng)超聲檢查各組心臟功能相關指標發(fā)現(xiàn)，模型組、破格救心湯組LVEDD、LVESD及EF指標均較假手術組明顯惡化，說明大鼠心功能受損；但破格救心湯治療組LVEDD、LVESD及EF均較模型組有明顯改善，提示破格救心湯能明顯改善心肌梗死大鼠的心功能，對心肌梗死有一定程度的保護作用，此研究結論與文獻研究一致［8-9］。經(jīng)對心肌組織進行染色發(fā)現(xiàn)，破格救心湯能明顯逆轉大鼠的心肌重構，與心功能指標相一致。文獻研究表明［10-12］，心肌梗死后交感神經(jīng)纖維密度顯著增加，導致心律失常誘發(fā)率也相應增高，其機制可能受交感神經(jīng)重構影響，導致在梗死周邊區(qū)交感神經(jīng)過度再生致使心臟局部神經(jīng)遞質(zhì)濃度不同，從而增加心臟電不穩(wěn)。本文首次通過程序性電刺激證實破格救心湯能減少心梗后大鼠室性心律失常的發(fā)生率，提示破格救心湯具有心律失常保護作用。Zhou等［13］研究揭示心梗模型犬中NGF的表達與心臟交感神經(jīng)再生和不均衡支配在時間及空間上有明顯的相關性。一些用于治療心梗的藥物，其治療機制也與調(diào)節(jié)NGF含量、改善心臟神經(jīng)重構有關［14-16］。本研究通過檢測大鼠體內(nèi)血清NGF發(fā)現(xiàn)，破格救心湯能明顯降低心肌梗死大鼠機體NGF水平，提示破格救心湯減少室性心律失常發(fā)生，可能與減少心梗后神經(jīng)生長因子分泌相關。

本研究以中醫(yī)病因病機與方劑功效為立足點，結合心臟自主神經(jīng)重構，探討破格救心湯對心梗后大鼠的影響及作用機制。本研究首次探討中醫(yī)方劑對心梗后室性心律失常的影響，為進一步尋找干預心梗后神經(jīng)重構的措施提供新的思路，同時也為深入研究中醫(yī)名方破格救心湯治療心臟危重癥的潛在病理生理學機制帶來新的切入點。