電針“委中”穴對(duì)大鼠腰多裂肌損傷后TGF-β1、CTGF、Vimentin表達(dá)的影響?

魯 曼 徐 菁 李欣怡 陳 莉 陳 潔

張佳怡1 許 玥1 白玉琢1 張 莉1△ 劉 通2△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095）

腰痛是臨床治療中最常見的癥狀之一，多見于腰背部區(qū)域疼痛不適，可沿臀部放射至大腿部，嚴(yán)重者出現(xiàn)麻木、沉重、酸軟、乏力等伴隨癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)［1］，慢性腰痛反復(fù)發(fā)生的原因可能有兩點(diǎn)：腹部和腰背部核心肌肉群力量減小以及脊柱穩(wěn)定性功能降低。多裂肌是人體重要的核心肌群之一，它位于脊柱兩旁內(nèi)側(cè)，能夠協(xié)助脊柱完成側(cè)彎、旋轉(zhuǎn)、前后屈伸等動(dòng)作，由于其獨(dú)特結(jié)構(gòu)，在維持脊柱穩(wěn)定性方面有關(guān)鍵作用［2］。針刺治療腰痛在臨床上已經(jīng)得到普遍認(rèn)可，是臨床治療腰痛常用的方法之一［3-6］。本課題組前期研究表明［7］，電針委中穴能夠加速肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的周期性進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)多裂肌的損傷修復(fù)，肌纖維再生和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的協(xié)調(diào)作用對(duì)肌肉修復(fù)具有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察電針委中穴對(duì)多裂肌修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、波形纖維蛋白（Vimentin）的表達(dá)變化，進(jìn)一步研究電針委中穴對(duì)骨骼肌修復(fù)過程中肌纖維再生以及纖維化因子的影響，并且找到針灸治療的最佳療程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，54只，體質(zhì)量（280±20）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006］，所有大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，進(jìn)食和飲水不受限，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，明暗周期各12 h，環(huán)境溫度24℃，濕度40%～50%。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：布比卡因（美國(guó)Sigma公司）；10%水合氯醛（北京歐北生物）；16%多聚甲醛溶液（北京雷根生物）；Masson三色染色試劑盒（北京So?larbio公司）；TGF-β1抗體，CTGF抗體和Vimentin抗體（美國(guó)proteintech公司）；山羊抗兔IgG（北京鼎國(guó)昌盛）；抗體稀釋液（北京鼎國(guó)昌盛）；DAB顯色液（北京鼎國(guó)昌盛）。主要儀器：韓式電針儀（北京思盛達(dá)醫(yī)療器械中心）；半自動(dòng)化石蠟切片機(jī)（北京弘泰嘉業(yè)）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（黃石恒豐）；顯微鏡及成像軟件系統(tǒng)（日本奧林巴斯株式會(huì)社）。

1.3 分組與造模 采用完全隨機(jī)數(shù)字表法將54只大鼠分為空白組、模型組和電針委中組，每組18只，各組再隨機(jī)分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（治療1、3、7 d），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。除空白組不做任何處理外，其余各組以10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，操作過程必須在無(wú)菌的環(huán)境下，然后剔除大鼠腰背部毛發(fā)，找到大鼠L4、L5水平棘突對(duì)應(yīng)兩側(cè)的4個(gè)點(diǎn)進(jìn)針，針頭緊貼棘突旁進(jìn)入肌肉，直到觸及關(guān)節(jié)突和乳突所在的骨面后再回抽無(wú)血時(shí)，以每個(gè)點(diǎn)100 μL注入0.5%布比卡因溶液，且時(shí)間不得短于3 s，這樣更加有利于藥物的吸收。

1.4 干預(yù)方法 空白組不進(jìn)行任何處理。電針委中組在造模后24 h進(jìn)行治療，將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)室操作桌上，暴露出雙側(cè)后肢的腘窩部，找到委中穴（膝關(guān)節(jié)背面正中的位置），用一次性針灸針（華佗牌，0.30 mm×13 mm）直刺3 mm，再接上韓式電針儀，采用2～100 Hz的疏密波，電流1 mA，每日治療1次，每次治療20 min。模型組造模后不做治療，只需與電針委中組同步進(jìn)行固定。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 各組大鼠分別在治療1、3、7 d后進(jìn)行取材，用10%水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔注射，大鼠完全處于麻醉狀態(tài)下后，將其固定在鼠板上，充分暴露背部，剔除背毛，剪開皮膚，剝離開筋膜、肌肉，銳性切取L4～5水平的多裂肌，左側(cè)迅速放于液氮中固定，隨后-80℃進(jìn)行保存，右側(cè)置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。1）Masson染色觀察多裂肌形態(tài)學(xué)變化。右側(cè)多裂肌在4%多聚甲醛溶液中固定好后，石蠟包埋，組織切片。將切片放在二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理，然后用梯度乙醇和蒸餾水水洗；Weigert鐵蘇木素染色5 min；酸性乙醇分化10 s；藍(lán)化液返藍(lán)3 min；蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色5 min；弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸洗1 min；再用弱酸工作液洗1 min；苯胺藍(lán)染色2 min；弱酸工作液洗1 min；梯度乙醇脫水?dāng)?shù)次；二甲苯透明；中性樹膠進(jìn)行封片。最后借助顯微鏡在鏡下觀察各組多裂肌組織形態(tài)的變化。2）免疫組化法（IHC）檢測(cè)TGF-β1、CTGF、Vimentin的表達(dá)。將切片放在65℃環(huán)境下烤片處理15 min，然后二甲苯脫蠟兩次，15 min/次；梯度乙醇脫水（100%，90%，75%，50%）；高壓鍋熱抗原修復(fù)處理；PBS沖洗；滴加雙氧水室溫下孵育15 min；滴加正常非免疫血清，37℃下孵育30 min封閉；滴加一抗后4℃孵育過夜（TGF-β1按照1∶200稀釋，CTGF按照1∶200稀釋，Vimentin按照1∶1 000稀釋）；滴加山羊抗兔IgG（1∶25稀釋），37℃下孵育40 min；滴加DAB顯色工作液，然后在顯微鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色后可隨時(shí)終止反應(yīng)；蘇木素（1∶25稀釋）復(fù)染10 min，；脫水透明，中性樹膠進(jìn)行封片。在顯微鏡下觀察采集圖像，然后用Image Professional Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，組間差異用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的腰多裂肌組織形態(tài)學(xué)變化 見圖1?？瞻?、3、7 d組可見到大量紅染的肌纖維整齊排列；模型組可見散狀、星點(diǎn)、不規(guī)則分布的紅色肌纖維，而藍(lán)色的膠原纖維則大量分布；針刺委中組與模型組相比，可以見到被紅染的肌纖維，而藍(lán)色的膠原纖維則相對(duì)減少。

圖1 各組大鼠腰多裂肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（Masson染色，200倍）

2.2 各組大鼠腰多裂肌組織中TGF-β1表達(dá)水平比較 見表1，圖2。治療1、3、7 d時(shí)，同時(shí)間點(diǎn)模型組與電針委中組TGF-β1的表達(dá)均高于空白組（P<0.01），與模型組相比，同時(shí)間點(diǎn)電針委中組的表達(dá)有所減少（P<0.01）。

表1 各組大鼠腰多裂肌中TGF-β1表達(dá)水平比較（MOD值，±s）

表1 各組大鼠腰多裂肌中TGF-β1表達(dá)水平比較（MOD值，±s）

與空白組比較，?P<0.05，??P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同

組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.038±0.016 0.091±0.016**0.067±0.009**△△3 d 0.056±0.008 0.101±0.007**0.076±0.006**△△7 d 0.050±0.007 0.094±0.007**0.075±0.011**△△

圖2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腰多裂肌TGF-β1表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

2.3 各組大鼠腰多裂肌組織中CTGF表達(dá)水平比較見表2，圖3。治療1 d時(shí)，與空白組比較，模型組與電針委中組的CTGF表達(dá)有所上升（P<0.01或P<0.05）；與模型組比較，電針委中組的表達(dá)量減少（P<0.05）。治療3 d時(shí)，模型組表達(dá)量高于空白組（P<0.01），電針委中組表達(dá)量也高于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與模型組比較，電針委中組的表達(dá)量更低（P<0.05）。治療7 d時(shí)，模型組與電針委中組表達(dá)量高于空白組（P<0.01），且電針委中組的表達(dá)量顯著低于模型組（P<0.01）。

表2 各組大鼠腰多裂肌中CTGF表達(dá)水平比較（MOD值，±s）

表2 各組大鼠腰多裂肌中CTGF表達(dá)水平比較（MOD值，±s）

組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.057±0.016 0.105±0.017**0.080±0.012*△3 d 0.054±0.015 0.090±0.019**0.066±0.006△7 d 0.043±0.012 0.132±0.033**0.089±0.017**△△

圖3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腰多裂肌CTGF表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

2.4 各組大鼠腰多裂肌組織中Vimentin表達(dá)水平比較 見表3，圖4。治療1 d時(shí)，模型組與電針委中組的Vimentin的表達(dá)量較空白組增加（P<0.01），與模型組比較，電針委中組的表達(dá)量較模型組增加（P<0.01）。治療3 d時(shí)，與空白組比較，模型組與電針委中組表達(dá)量明顯上升（P<0.01）；電針委中組的表達(dá)量比模型組更高（P<0.01）。治療7 d時(shí)，模型組與電針委中組表達(dá)量顯著高于空白組（P<0.01），與模型組比較，電針委中組的表達(dá)量有所上升（P<0.05）。

表3 各組大鼠腰多裂肌中Vimentin表達(dá)水平比較（MOD值，±s）

表3 各組大鼠腰多裂肌中Vimentin表達(dá)水平比較（MOD值，±s）

組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.052±0.016 0.082±0.007**0.119±0.016**△△3 d 0.037±0.012 0.077±0.007**0.118±0.007**△△7 d 0.044±0.012 0.084±0.008**0.104±0.017**△

圖4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腰多裂肌Vimentin表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

3 討 論

在全世界范圍內(nèi)，約有80%的人群患有慢性腰痛。腰痛癥狀輕重不一，嚴(yán)重者會(huì)影響工作、學(xué)習(xí)以及生活各個(gè)方面，其中大約25%的患者會(huì)選擇就醫(yī)［8］，以減輕不適感。有研究表明，腰痛患者中大部分存在多裂肌萎縮［9］以及脂肪浸潤(rùn)［10］，而且浸潤(rùn)程度與年齡增長(zhǎng)呈正相關(guān)，這與多裂肌的分布位置和本身具有的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，以及維持腰椎穩(wěn)定性功能有關(guān)。有研究報(bào)道，布比卡因作為局麻藥起效迅速，而且與給藥部位有關(guān)，3種藥物相比，布比卡因最容易引起肌肉的毒性，而且它導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞數(shù)量最多［11］；在運(yùn)動(dòng)阻滯效應(yīng)方面，它所起的效果明顯高于另外兩種藥物［12］。本實(shí)驗(yàn)大鼠模型制備選擇肌肉注射0.5%布比卡因溶液，是因?yàn)樗男?yīng)具有選擇性，只會(huì)影響肌纖維而并不改變基底膜以及細(xì)胞的再生能力，而且0.5%布比卡因起到阻滯作用的同時(shí)，不具有任何血流動(dòng)力學(xué)副作用［13］，不影響與骨骼肌修復(fù)再生能力相關(guān)的其他因素。實(shí)驗(yàn)證明損傷后24 h介入電針治療是多裂肌修復(fù)的最佳時(shí)機(jī)［14］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇干預(yù)時(shí)機(jī)為造模后24 h，觀察多裂肌修復(fù)過程中，不同治療療程組大鼠多裂肌肌纖維的表達(dá)變化。

TGF-β1可以通過激活衛(wèi)星細(xì)胞，調(diào)節(jié)結(jié)締組織再生，改變免疫反應(yīng)強(qiáng)度這幾個(gè)方面來(lái)參與骨骼肌的損傷修復(fù)［15］，而骨骼肌萎縮是TGF-β1調(diào)節(jié)的病理狀態(tài)之一［16］，會(huì)出現(xiàn)肌肉力量減弱和肌肉質(zhì)量下降的表現(xiàn)。有研究證明［17］，TGF-β1能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞進(jìn)行增殖，進(jìn)而誘發(fā)肌肉纖維化發(fā)展。謝慧等［18］研究發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)可以抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，緩解腓腸肌萎縮的進(jìn)程，加速肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨骼肌纖維再生修復(fù)。仝樂［19］研究表明電針穴位之后，TGF-β1的表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)的沉淀會(huì)減少，肌纖維的再生與修復(fù)能力能夠得到促進(jìn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療1 d和3 d時(shí)，電針委中組TGF-β1的表達(dá)比模型組減少（P<0.01），說(shuō)明了TGF-β1在損傷修復(fù)過程中被抑制，細(xì)胞外基質(zhì)沉淀減少，進(jìn)而促進(jìn)肌肉修復(fù)。電針委中組治療7 d時(shí)，和3 d時(shí)的表達(dá)維持在同一水平線上，幾乎沒有差異，這說(shuō)明電針委中穴治療能夠在多裂肌損傷修復(fù)的早期發(fā)揮抑制肌肉纖維化因子的作用，進(jìn)而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化，減少損傷肌肉修復(fù)過程中的負(fù)效應(yīng)。

CTGF是結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，器官組織的纖維化發(fā)展與其有密切的關(guān)系?，F(xiàn)有研究表明［20］，作為促組織纖維化蛋白，當(dāng)機(jī)體組織處于損傷情況下時(shí)，CTGF會(huì)大量分泌，而且與皮膚瘢痕形成、血管粥樣硬化、損傷修復(fù)障礙、器官組織纖維化發(fā)展具有一定的聯(lián)系［21］。孫桂蓮等［22］研究表明，CTGF的表達(dá)增強(qiáng)與進(jìn)行性肌肉營(yíng)養(yǎng)不良患兒的肌肉萎縮纖維化關(guān)系密切，在纖維化過程中發(fā)揮了重要作用。吳珍元等［23］研究表明不同強(qiáng)度電針刺激可以抑制靶器官的結(jié)締組織再生，減輕失神經(jīng)骨骼肌萎縮程度，從而防止纖維化。治療1 d和3 d時(shí)，同時(shí)間點(diǎn)電針委中組與模型組相比CTGF的表達(dá)減少（P<0.05），治療7 d時(shí)，電針委中組的表達(dá)低于模型組（P<0.01），同時(shí)電針委中7 d組比電針委中3 d組表達(dá)增加，這說(shuō)明電針在抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的過程中，3 d組的抑制能力最強(qiáng)，隨后減弱。

Vimentin作為一種細(xì)胞骨架蛋白，是肌肉損傷修復(fù)病理學(xué)研究領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)［24］。有研究表明［25］，在肌肉再生的早期過程中，Vimentin能夠促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活，在肌肉損傷修復(fù)方面發(fā)揮著重要的作用。治療1 d和3 d時(shí)，與模型組相比，電針委中組Vimentin的表達(dá)增加（P<0.01），治療7 d時(shí)，電針委中組與模型組之間也有明顯差異（P<0.05），但7 d時(shí)電針委中組表達(dá)低于治療3 d時(shí)。這說(shuō)明在電針委中的干預(yù)過程中，治療3 d時(shí)，損傷肌肉恢復(fù)的效果達(dá)到最佳。

“腰背委中求”，是歷代醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，從古至今，一直是針灸醫(yī)生臨床選穴治病的理論支持。足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的經(jīng)絡(luò)循行路線經(jīng)過脊柱兩側(cè)，并且到達(dá)腰部，其中一分支從臀部穿過到達(dá)腘窩處，即委中穴所在的位置；足太陽(yáng)膀胱經(jīng)與足少陰腎經(jīng)相表里，二者分布于下肢外側(cè)后緣和內(nèi)側(cè)后緣，且腰為腎之府；足太陽(yáng)經(jīng)筋起于足小趾，沿跟腱向上止于腘窩部，因此委中穴既是膀胱經(jīng)的合穴、下合穴，也是足太陽(yáng)經(jīng)筋其中一分支的結(jié)所在；委中穴位于腘橫紋的中點(diǎn)處，解剖位置在股二頭肌肌腱與半腱肌肌腱之間，從脊髓節(jié)段角度而言，腰背部神經(jīng)節(jié)段與委中穴的傳入神經(jīng)分布有相互重疊的部分，會(huì)互相影響。以上幾點(diǎn)從中醫(yī)角度說(shuō)明“經(jīng)脈所過，主治所及”的原則、特效穴和特殊穴的運(yùn)用，以及從西醫(yī)角度解釋委中穴的解剖位置以及委中穴與腰痛神經(jīng)節(jié)段的相關(guān)性，為臨床治療腰痛提供了可靠的依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明，電針委中穴可以通過下調(diào)TGF-β1和CTGF的表達(dá)，同時(shí)增加Vimentin的表達(dá)，來(lái)促進(jìn)損傷骨骼肌的修復(fù)，從肌纖維再生的角度說(shuō)明，電針委中穴治療骨骼肌損傷病變，最佳治療時(shí)長(zhǎng)可能是持續(xù)3 d，與肌肉纖維化相關(guān)的因子在此刻能得到最大效力的針刺抑制作用，此時(shí)骨骼肌修復(fù)的效果達(dá)到最優(yōu)。