水楊酸和茉莉酸/乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵基因在月季-黑斑病菌互作中的表達(dá)模式*

劉瑞峰 賈桂霞

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院 長沙 410004； 2.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國家花卉工程技術(shù)研究中心花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100083)

植物在長期適應(yīng)環(huán)境過程中進(jìn)化出了強(qiáng)大的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和多層次的防御機(jī)制來應(yīng)對(duì)威脅，其中，水楊酸(Salicylic acid，SA)和茉莉酸/乙烯(jasmonic acid/ethylene，JA/ET)信號(hào)途徑在植物抵御病原菌侵染中具有重要作用(Derksenetal., 2013)。通常認(rèn)為，水楊酸抗病信號(hào)途徑主要調(diào)控植物抵御活體營養(yǎng)型病原菌(biotrophs pathogen)的侵染，茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑則主要介導(dǎo)植物抵御死體營養(yǎng)型病原菌(necrotrophs pathogen)的侵染。植物以何種途徑介導(dǎo)半活體營養(yǎng)型病原菌(hemibiotrophic pathogen)的侵染，則取決于寄主植物和病原菌互作體系的具體情況，互作體系不同，其抗病防衛(wèi)反應(yīng)途徑也可能不同(Achuoetal.,2004； Smithetal., 2009； Sanchezetal., 2012； Zuluagaetal., 2016)。

月季黑斑病菌(Diplocarponrosae)屬半活體營養(yǎng)型病原菌(Gachomoetal., 2006)。月季在抵御黑斑病中的激素抗病信號(hào)途徑尚不明確。在筆者前期的研究中發(fā)現(xiàn)： 中抗月季材料‘粉和平’接種后PAL呈下降趨勢(shì)； 以‘粉和平’接種前后24、48和72 h RNAs的等量混合樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序，結(jié)果表明乙烯響應(yīng)因子ERF1和ERF3(ethylene response factor 3)，丙二烯氧化合成酶基因AOS(allene oxide synthase)，赤霉素受體蛋白基因GIDI(GA-insenshive dwarf l)，植物生長素-氨基酸合成酶基因GH3(IAA-amido synthetase)，脫落酸受體基因PYR/PYL(pyrabactin resistance/PYR1-like)、TGA和MYC2轉(zhuǎn)錄因子在‘粉和平’接種后上調(diào)表達(dá)(未發(fā)表，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)見https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/6323271和https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/6323272)。這些結(jié)果說明水楊酸信號(hào)途徑可能受到病原菌的抑制； SA，JA/ET，ABA、GA和IAA信號(hào)途徑可能共同參與月季對(duì)黑斑病菌的響應(yīng)。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑部分關(guān)鍵基因序列，并在外源水楊酸和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)誘導(dǎo)和接種(inoculation，IN)條件下，監(jiān)測(cè)其表達(dá)動(dòng)態(tài)，探索水楊酸、茉莉酸/乙烯抗病信號(hào)途徑在月季響應(yīng)黑斑病菌過程中調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以前期離體接種黑斑病菌(cfcc87205)篩選獲得的中抗月季品種‘粉和平’(Rosa‘MEIbil’)(在測(cè)定的60份月季材料中，抗性相對(duì)較強(qiáng))為材料，發(fā)病潛伏期為13～15天，病情指數(shù)12.3。

黑斑病菌購自中國林業(yè)科學(xué)研究院菌種保藏管理中心(編號(hào): cfcc87205)。 接種孢子采用活化后的一代孢子，即將購買的菌種活化后接種到滅菌的月季葉片上，再將感病的葉片切成5 mm的小塊并轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，23 ℃恒溫增殖培養(yǎng)25天(Debeneretal.,1998)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及接種

選取30株健康植株，接種前一年冬季對(duì)其進(jìn)行修剪，保留高度10 cm。第2年春季，在葉片生長6～8周進(jìn)行取樣接種。每株摘取健康、中等成熟的完全伸展葉1～2片，用自來水沖去葉片表面塵土，將其放入2%的次氯酸鈉溶液中浸泡4 min殺菌，再用無菌水沖洗3次，將葉片正面向上放在鋪有濕潤濾紙的托盤上(33 cm×23 cm×10 cm)。試驗(yàn)共5個(gè)處理，無菌水誘導(dǎo)2 h后接種(CK+IN)，水楊酸誘導(dǎo)2 h不接種(SA+NO)，水楊酸誘導(dǎo)2 h后接種(SA+IN)，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)2 h不接種(JA+NO)和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)2 h后接種(JA+IN)，設(shè)置空白對(duì)照CK。首先，將葉片分為3組： 分別霧狀噴施等量蒸餾水(CK和CK+IN處理)、2 mmol·L-1的水楊酸(SA+NO和SA+IN處理)和0.2 mmol·L-1的茉莉酸甲酯水溶液(JA+NO和JA+IN處理)，噴施后用保鮮薄膜密封。2 h后揭開保鮮膜，用吸水紙吸干葉片表面的液滴，然后以每葉2.5 mL的量噴施1×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液(0.01%的Tween-20)接種(CK+IN，SA+IN和JA+IN處理)，非接種處理(SA+NO和JA+NO處理)和空白對(duì)照CK噴施等量的無菌水(0.01%的tween-20)。以濕潤的無菌棉包裹葉柄，以保鮮膜封口，將其置于23 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，光照時(shí)間每天12 h。每個(gè)處理至少5個(gè)生物重復(fù)。

以半活體營養(yǎng)型病原菌攝取營養(yǎng)特征(前期以活體營養(yǎng)型菌方式攝取營養(yǎng)，后期以死體營養(yǎng)型病原菌的方式攝取營養(yǎng))、黑斑病菌侵入進(jìn)程(病菌侵入顯微觀測(cè)表明，接種16 h多數(shù)病原菌萌發(fā)出芽管刺入或者已經(jīng)刺入葉片)和月季奇數(shù)羽狀5小葉為依據(jù)，取樣5次，即接種后16、 24、48、72 和144 h，每次順序取全葉的其中一小葉，以無菌水沖洗掉葉片表面攜帶的病原體，擦干后迅速置于液氮中保存。

1.3 RNA提取純化和cDNA合成

葉片總RNA采用北京艾德萊生物科技有限公司(Aidlab Biotechnologies Co., Ltd) RNA38試劑盒提取。以RNA為模板，Oligo (dT)17為引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase M-MLV，Promega)指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄體系將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈。

1.4 引物設(shè)計(jì)與基因表達(dá)量計(jì)算

根據(jù)Niu等(2014)的方法，將基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得相關(guān)基因unigenes全部挑選出來并翻譯成氨基酸序列，在網(wǎng)站下載同屬和不同屬參考物種的目標(biāo)基因蛋白序列，以MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，與同屬目標(biāo)基因親緣關(guān)系最近且系統(tǒng)發(fā)育順序正確的unigene確定為目標(biāo)基因序列。

在NCBI上查找正確序列的保守結(jié)構(gòu)域，避開保守結(jié)構(gòu)域以Primer5設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物，以擴(kuò)增效率95%

表1 目標(biāo)基因的引物序列及RT-PCR退火溫度Tab.1 The sequences and annealing temperatures of the RT-PCR primers for target genes

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用一般線性模型單因素方差分析(P<0.05)進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析(SPSS18.0)，在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，比較不同處理間的基因表達(dá)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

2.1.1 異分支酸合成酶基因(ICS)表達(dá)分析ICS主要負(fù)責(zé)病原菌誘導(dǎo)下植物體內(nèi)水楊酸的合成。與對(duì)照CK相比，SA+NO處理中，ICS在16和144 h下調(diào)表達(dá)、在24 h與CK中無顯著差異，在48和72 h上調(diào)表達(dá)(P<0.05)； JA+NO處理中，ICS在24、48和72 h上調(diào)表達(dá)、在16和144 h下調(diào)表達(dá)(P<0.05)； CK+IN處理中，ICS在16、24和144 h下調(diào)表達(dá)、在48和72 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)。SA+IN處理中，ICS的表達(dá)量除了在24和72 h與CK+IN處理中無顯著差異外其余時(shí)間點(diǎn)ICS上調(diào)表達(dá)(P<0.05)； JA+IN處理中，ICS在16 h下調(diào)表達(dá)、在72 h與其在CK+IN處理中無顯著差異、其余時(shí)間點(diǎn)ICS上調(diào)表達(dá)(P<0.05)(圖1A)。

圖1 ICS在不同取樣時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression of ICS in different sampling points

從ICS表達(dá)量動(dòng)態(tài)來看，CK+IN處理中，ICS下調(diào)表達(dá)； 相對(duì)于CK+IN處理，SA+NO、SA+IN、JA+NO和JA+IN處理都能在24～144 h提高ICS的表達(dá)，且JA+NO和JA+IN處理對(duì)ICS的提升效果更好，但接種16 h，SA+NO、JA+NO和JA+IN處理都下調(diào)了ICS的表達(dá)而SA+IN處理則上調(diào)了ICS的表達(dá)(圖1B)。

以上結(jié)果表明，接種初期(16 h)，SA+IN處理可增強(qiáng)ICS表達(dá)，而JA+IN處理可降低ICS的表達(dá)； 接種24～144 h，外源水楊酸和茉莉酸都能提高ICS的表達(dá)，且外源茉莉酸對(duì)ICS的提升效果更好。ICS在SA+IN中的波動(dòng)變化表明病原菌對(duì)外源水楊酸更為敏感，所表現(xiàn)的反饋抑制作用較強(qiáng)。

2.1.2NPR1表達(dá)分析NPR1除正向調(diào)控PR1表達(dá)外，還在水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑的交互和轉(zhuǎn)換中起重要作用(Robert-Seilaniantzetal.， 2011)。SA+NO處理中，NPR1在16和24 h上調(diào)表達(dá)、在48和72 h下調(diào)表達(dá)、在144 h與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，NPR1在16和144 h上調(diào)表達(dá)、在24、48和72 h下調(diào)表達(dá)(P<0.05)； CK+IN處理中，NPR1在16 h上調(diào)表達(dá)、在24 h與CK處理中無顯著差異、在48、72和144 h下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。SA+IN處理中，NPR1在16、24、48和144 h上調(diào)表達(dá)、在72 h與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，NPR1在16、24和72 h上調(diào)表達(dá)，在48和144 h與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)(圖2A)。

圖2 NPR1在不同取樣時(shí)間的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The relative expression of NPR1 in different sampling points

從NPR1表達(dá)量動(dòng)態(tài)來看，在接種16～48 h間，CK+IN、SA+NO、SA+IN、JA+NO和JA+IN處理中，NPR1呈下降趨勢(shì)，但JA+NO處理中，NPR1表達(dá)量最小，下降速度最快，其次是CK+IN處理。接種48～144 h間NPR1表達(dá)量在CK+IN、SA+NO、SA+IN和JA+IN處理中趨近且變化平緩，JA+NO處理中NPR1表達(dá)量在72～144 h間呈增強(qiáng)趨勢(shì)(圖2B)。

以上結(jié)果表明，NPR1在接種早期短暫上調(diào)后迅速被病原菌抑制； SA+NO處理在接種早期促進(jìn)NPR1表達(dá)，JA+NO處理在接種早期抑制NPR1表達(dá)，SA+IN和JA+IN處理都能提高NPR1的表達(dá)，降低病原菌對(duì)NPR1的抑制作用。

2.1.3PR1表達(dá)量分析PR1是水楊酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因，SA+NO處理中，PR1在16和48 h下調(diào)表達(dá)、在72 h 上調(diào)表達(dá)、在24和144 h與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，PR1在16、24和48 h下調(diào)表達(dá)、在72 h上調(diào)表達(dá)、在144 h與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，PR1除在48 h下調(diào)表達(dá)外其余各點(diǎn)與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)。SA+IN處理中，PR1在24、72和144 h上調(diào)表達(dá)、在16和48 h與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，PR1在24和48 h與其在CK+IN處理中無顯著差異、在16、72和144 h則顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)(圖3A)。

從PR1表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化來看，CK+IN處理中，PR1與對(duì)照曲線趨近。SA+IN處理可增強(qiáng)PR1表達(dá)，JA+IN處理也可提高PR1的表達(dá)量。SA+NO和JA+NO處理中，PR1在接種16 ～48 h呈下調(diào)趨勢(shì)，48 h后呈表達(dá)增強(qiáng)趨勢(shì)且增強(qiáng)幅度較SA+IN和JA+IN處理中較小(圖3B)。

圖3 PR1在不同取樣時(shí)間的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression of PR1 in different sampling points

以上結(jié)果說明，病原菌影響外源激素對(duì)月季的誘導(dǎo)表達(dá)； SA+IN處理和JA+IN處理可提高PR1表達(dá)，且在接種48 h后提升幅度較大，相對(duì)于JA+IN處理，SA+IN處理對(duì)PR1的上調(diào)作用更為顯著。

綜合水楊酸信號(hào)途徑3個(gè)關(guān)鍵基因來看，病原菌對(duì)水楊酸信號(hào)途徑ICS和NPR1有不同程度的抑制作用，PR1沒有激活或被抑制； SA+IN處理能提高各基因的表達(dá)，且在接種48 h后對(duì)ICS和PR1提高幅度較大； JA+IN處理在接種48 h后也可增強(qiáng)ICS和PR1的表達(dá)。病原菌對(duì)外源水楊酸誘導(dǎo)更為敏感，主要表現(xiàn)在，SA+IN處理中，水楊酸信號(hào)途徑關(guān)鍵基因ICS和PR1都呈波動(dòng)變化。

2.2 茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

2.2.1AOS表達(dá)分析AOS參與茉莉酸的合成，SA+NO處理中，AOS在16和48 h顯著上調(diào)表達(dá)、在72 h顯著下調(diào)表達(dá)、在24和144 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，AOS在16、48和144 h上調(diào)表達(dá)、在72 h下調(diào)表達(dá)、在24 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，AOS在16 h上調(diào)表達(dá)、在72 h下調(diào)表達(dá)、在24、48和144 h與CK處理中無顯著差異。與CK+IN處理相比，AOS在SA+IN處理中除在接種48 h與CK+IN處理中無顯著差異外、其余各點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，JA+IN處理中，AOS除在接種144 h與CK+IN處理中無顯著差異外、其余各點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)(P<0.05)(圖4A)。

從AOS表達(dá)動(dòng)態(tài)來看，病原菌在侵入16 h誘導(dǎo)AOS上調(diào)表達(dá)，之后變化趨勢(shì)與對(duì)照趨近； SA+NO、JA+NO、SA+IN和JA+IN處理都能提高AOS的表達(dá)且在48 h前對(duì)AOS表達(dá)量的提升幅度較大； JA+NO處理則在72 h后對(duì)AOS表達(dá)量的提升幅度最大(圖4B)。以上結(jié)果表明，病原菌侵入早期誘導(dǎo)AOS上調(diào)表達(dá)，侵入中后期，對(duì)AOS影響不大或下調(diào)AOS表達(dá)； 外源水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)都能提高AOS的表達(dá)、且在病菌侵入48 h前提升幅度較大。

圖4 AOS在不同取樣時(shí)間的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression of AOS in different sampling points

2.2.2JAR1表達(dá)分析 SA+NO處理中，JAR1在16 h下調(diào)表達(dá)、在72 h上調(diào)表達(dá)、在24、48和144 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，JAR1在16 h下調(diào)表達(dá)、在24、48和72 h上調(diào)表達(dá)、在144 h則與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，JAR1除在16 h下調(diào)表達(dá)外其余各監(jiān)測(cè)點(diǎn)與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，JAR1除在24 h上調(diào)表達(dá)外其余監(jiān)測(cè)點(diǎn)與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； SA+IN處理中，JAR1表達(dá)量在監(jiān)測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)(圖5A)。

從JAR1在各處理中的表達(dá)動(dòng)態(tài)來看，CK+IN處理只在接種初期抑制JAR1表達(dá)，JA+NO和JA+IN處理能夠在接種24～144間提高JAR1表達(dá)，且JA+IN處理減弱了JA+NO處理對(duì)JAR1的上調(diào)作用； SA+NO和SA+IN處理對(duì)JAR1表達(dá)影響相對(duì)較小(圖5B)。

圖5 JAR1在不同取樣時(shí)間的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relative expression of JAR1 in different sampling points

以上結(jié)果表明，接種16 h病原菌對(duì)JAR1有抑制作用，外源水楊酸和茉莉酸都沒有減輕病原菌對(duì)JAR1的抑制作用； 外源茉莉酸可在接種24～144 h上調(diào)JAR1表達(dá)，但接種48 h后對(duì)JAR1上調(diào)作用減弱； 外源水楊酸對(duì)JAR1的表達(dá)影響相對(duì)較小。

2.2.3COI1表達(dá)分析 SA+NO處理中，COI1在16、72和144 h和CK處理中無顯著差異、在24和48 h顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)； JA+NO處理中，COI1在16、48和72 h與CK處理中無顯著差異、在24和144 h則顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)； CK+IN處理中，COI1在24、48和72 h顯著上調(diào)表達(dá)，在16和144 h則與CK處理中無顯著差異(P<0.05)。SA+IN和JA+IN處理中，COI1表達(dá)量除在16 h與其在CK+IN處理中無顯著差異外、其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)COI1的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)(圖6A)。

從COI1表達(dá)量變化來看，接種24～72 h，病原菌可誘導(dǎo)COI1的上調(diào)表達(dá)； SA+NO、SA+IN、JA+NO和JA+IN處理都能下調(diào)COI1的表達(dá)，相對(duì)于外源茉莉酸，外源水楊酸誘導(dǎo)后，COI1在接種48 h后下調(diào)明顯(圖6B)。這說明病原菌誘導(dǎo)COI1上調(diào)表達(dá)，外源水楊酸和茉莉酸都能下調(diào)COI1的表達(dá)、減弱病原菌對(duì)COI1的誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖6 COI1在不同取樣時(shí)間的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression of COI1 in different sampling points

2.2.4MYC2的表達(dá)量分析 SA+NO處理中，MYC2在16和24 h顯著上調(diào)表達(dá)、在72 h顯著下調(diào)表達(dá)、在48和144 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，MYC2在16和48 h上調(diào)表達(dá)、在72和144 h下調(diào)表達(dá)、在24 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，MYC2除在16 h上調(diào)表達(dá)、在48 h與CK處理無顯著差異外、其余各個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)MYC2顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。相對(duì)于CK+IN處理，SA+IN處理中，MYC2在24、72和144 h顯著上調(diào)表達(dá)、在16和48 h則與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，MYC2除在48 h與CK+IN處理無顯著差異外、其余各個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)MYC2顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)(圖7A)。

從MYC2的表達(dá)量變化來看，接種后，MYC2在整個(gè)監(jiān)測(cè)期呈波動(dòng)變化，接種初期表達(dá)增強(qiáng)，此后波動(dòng)下調(diào)； SA+NO和JA+NO處理在48 h前可提高M(jìn)YC2表達(dá)，在72～144 h可降低MYC2表達(dá)； JA+IN處理在16～144 h提高M(jìn)YC2表達(dá)； SA+IN處理在接種16～48 h能減弱病原菌對(duì)MYC2的誘導(dǎo)效應(yīng)，接種48～144 h提高M(jìn)YC2表達(dá)(圖7B)。

圖7 MYC2在不同取樣時(shí)間的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression of MYC2 in different sampling points

以上結(jié)果表明，病原菌改變外源激素對(duì)月季MYC2的誘導(dǎo)表達(dá)； 病原菌只在接種初期誘導(dǎo)MYC2表達(dá)增強(qiáng)； 接種48 h前SA+IN處理可削弱病原菌對(duì)MYC2的誘導(dǎo)效應(yīng)、接種48 h后SA+IN處理可提高M(jìn)YC2表達(dá)； JA+IN處理則提高M(jìn)YC2表達(dá)。

綜合分析4個(gè)茉莉酸信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因，接種16 h，AOS和MYC2上調(diào)、JAR1下調(diào)表達(dá)，接種24～144 h，COI1的表達(dá)增強(qiáng)、AOS和JAR1與CK處理相差不大、MYC2波動(dòng)下調(diào)； JA+IN處理可下調(diào)COI1表達(dá)、增強(qiáng)AOS、JAR1和MYC2的表達(dá)； SA+IN處理可增強(qiáng)AOS表達(dá)、降低COI1表達(dá)、對(duì)JAR1表達(dá)影響不大，在接種16～48 h能削弱病原菌對(duì)MYC2的誘導(dǎo)效應(yīng)，在接種72～144 h增強(qiáng)MYC2表達(dá)。

3 討論

前期生理試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，月季接種黑斑病菌后PAL活性下降； 轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果表明，水楊酸信號(hào)途徑中的關(guān)鍵基因ICS、NPR1和PR1的表達(dá)量在接種和對(duì)照組間無顯著差異； 實(shí)時(shí)熒光定量監(jiān)測(cè)表明，接種后ICS下調(diào)表達(dá)，PR1在接種48 h下調(diào)表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)與CK處理中無顯著差異； 這些結(jié)果說明，月季-黑斑病菌的親和互作體系中，不管是PAL還是ICS負(fù)責(zé)SA的合成，病原菌都對(duì)水楊酸信號(hào)途徑具有抑制作用。與CK+IN處理相比，水楊酸信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因ICS、NPR1、PR1在SA+IN處理中上調(diào)表達(dá)，這說明外源水楊酸誘導(dǎo)能夠減弱病原菌對(duì)水楊酸信號(hào)途徑的抑制作用。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，JA+IN處理在接種16 h降低ICS表達(dá)，在接種48 h后可同時(shí)增強(qiáng)ICS和PR1的表達(dá)，這說明外源茉莉酸在接種初期抑制SA的合成，接種中后期卻能同外源水楊酸一樣降低病原菌對(duì)水楊酸信號(hào)系統(tǒng)的抑制作用。

在對(duì)茉莉酸信號(hào)途徑相關(guān)基因的監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，CK+IN處理中，AOS在接種16和72 h上調(diào)表達(dá)，JAR1在16 h下調(diào)表達(dá)、其余時(shí)間JAR1表達(dá)量與其在CK處理中無顯著差異，COI1卻在接種24～72 h上調(diào)表達(dá)，外源水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)能不同程度地降低COI1的表達(dá)。這些結(jié)果說明，月季接種后COI1的上調(diào)表達(dá)并不依賴于JA-Ile的合成，黑斑病菌侵入月季后可能并沒有激活月季的茉莉酸防御系統(tǒng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，某些病原菌能夠通過對(duì)COI1的調(diào)節(jié)來增強(qiáng)其毒性，并進(jìn)一步抑制植物的防御系統(tǒng)(Kloeketal., 2001； Ralhanetal., 2012； Gengetal., 2016)，據(jù)本研究可以推測(cè)，黑斑病菌可能通過調(diào)控COI1的上調(diào)表達(dá)來增強(qiáng)其毒性，外源水楊酸和茉莉酸處理能減弱病原菌的毒性。MYC2是水楊酸和茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子(Dombrechtetal., 2007； Kazanetal., 2013)，本研究發(fā)現(xiàn)JA+IN處理不僅減弱JA+NO處理對(duì)JAR1的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，且在增強(qiáng)AOS和JAR1表達(dá)的同時(shí)，也能增強(qiáng)MYC2的表達(dá)，這說明病原菌對(duì)JAR1有抑制作用，即使外源茉莉酸或病原菌誘導(dǎo)促進(jìn)活性茉莉酸的合成，黑斑病菌也會(huì)通過增強(qiáng)MYC2的表達(dá)來抑制茉莉酸/乙烯信號(hào)防御途徑。相對(duì)于CK+IN處理，SA+IN處理中，MYC2在接種16～48 h能削弱病原菌對(duì)MYC2誘導(dǎo)效應(yīng)； 在接種72～144 h卻提高M(jìn)YC2的表達(dá)； 進(jìn)一步聯(lián)合分析SA+IN中MYC2與PR1的表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)，接種48 h前MYC2的表達(dá)量變化趨勢(shì)與PR1正好相反，接種48 h后在PR1表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí)MYC2的表達(dá)也增強(qiáng)，這些結(jié)果表明，病原菌可能通過調(diào)控MYC2的變化影響PR1的表達(dá)，黑斑病菌侵入月季的過程是黑斑病菌與月季免疫防御系統(tǒng)不斷博弈的過程，黑斑病菌侵入初期，外源水楊酸所誘導(dǎo)的PR1的增強(qiáng)表達(dá)與病原菌所引起MYC2的增強(qiáng)表達(dá)處于“膠著對(duì)壘”階段，PR1表達(dá)與MYC2呈相反變化趨勢(shì)； 而隨黑斑病菌侵入時(shí)間的延長和侵入程度的加深，這種膠著狀態(tài)已經(jīng)被打破，黑斑病菌已處于優(yōu)勢(shì)地位，盡管PR1的表達(dá)量在持續(xù)增加，病原菌適應(yīng)PR1增強(qiáng)而表現(xiàn)出的對(duì)MYC2的上調(diào)作用也在增大。黑斑病菌作為一種半活體營養(yǎng)型病原菌，一旦從月季的死亡細(xì)胞中吸收營養(yǎng)物質(zhì)，它就可能觸發(fā)月季的茉莉酸/乙烯信號(hào)防御系統(tǒng)(Smithetal.， 2009)，本試驗(yàn)中，ICS、NPR1、PR1、AOS、JAR1和MYC2的表達(dá)量在SA+IN和JA+IN處理中都在接種48 h出現(xiàn)了轉(zhuǎn)折性的改變，這表明病原菌可能在48 h發(fā)生營養(yǎng)吸收方式的根本性改變，進(jìn)而導(dǎo)致其所誘發(fā)的抗病途徑也由水楊酸信號(hào)途徑轉(zhuǎn)向茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑。這也就解釋了SA+IN 處理中PR1的表達(dá)量在接種48 h后出現(xiàn)較大增幅的原因，即并不是由于病原菌激活了水楊酸信號(hào)途徑，而是病原菌對(duì)水楊酸信號(hào)途徑的抑制作用減弱。同樣，JA+IN處理中，AOS、JAR1和MYC2在接種48 h前表達(dá)量較高、相對(duì)CK+IN處理增幅較大，而在接種48 h后表達(dá)量較低、相對(duì)CK+IN處理增幅較小，也是由于病原菌在接種48 h前對(duì)茉莉酸信號(hào)途徑的抑制作用較弱，在接種48 h后對(duì)茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑的抑制作用增強(qiáng)的緣故，且MYC2的增強(qiáng)表達(dá)與茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑被抑制直接相關(guān)。這就意味著病原菌可能通過調(diào)控MYC2的上調(diào)表達(dá)實(shí)現(xiàn)其對(duì)月季水楊酸和茉莉酸/乙烯免疫防御系統(tǒng)的雙重抑制。這一機(jī)制與半活體營養(yǎng)型致病菌丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的致病機(jī)制極為類似，研究發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌 Pst DC3000可利用FALF23(Rapid alkalinization factor)對(duì)受體激酶FER (FERONIA)的負(fù)調(diào)控作用，促進(jìn)MYC2穩(wěn)定和高表達(dá)，并以此破壞植物的免疫防御系統(tǒng)(Xinetal.， 2013；Stegmannetal.， 2017；Guoetal.， 2018)。最新研究表明薔薇屬植物中也發(fā)現(xiàn)了與激素調(diào)控和病菌侵染有關(guān)的FALF-like基因(Zhangetal.， 2020)。這些研究結(jié)果有力地支撐了本試驗(yàn)結(jié)論，并為今后月季的抗黑斑病機(jī)制研究提供了新的思路。

本試驗(yàn)中MYC2在CK+IN中的波動(dòng)下調(diào)表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序MYC2上調(diào)表達(dá)結(jié)果不一致，這是由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)是接種前后24～72 h間3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的混合樣測(cè)定分析結(jié)果，而本次試驗(yàn)是接種前后16～144 h間共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)動(dòng)態(tài)，另外，本次試驗(yàn)取樣批次與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序取樣批次不同也是造成二者不一致的原因，但在本試驗(yàn)中CK+IN處理中MYC2的動(dòng)態(tài)下調(diào)表達(dá)與ICS下調(diào)表達(dá)是一致的，因此，本試驗(yàn)結(jié)論符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。

本試驗(yàn)的不足之處是： 沒有獲得適宜的引物來監(jiān)測(cè)茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑ERF1和PDF1.2(plant defension 1.2)的表達(dá)變化； 雖然通過病菌侵入顯微觀測(cè)結(jié)果確定接種16 h為最初取樣點(diǎn)，但從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，接種16 h很可能已是月季抗病信號(hào)初始反應(yīng)的末期。然而，從接種16 hICS和JAR1在CK+IN處理中下調(diào)表達(dá)而AOS和MYC2上調(diào)表達(dá)可再次確定，病原菌誘導(dǎo)的MYC2的上調(diào)表達(dá)與月季水楊酸和活性茉莉酸的合成被抑制密切相關(guān)。

綜合各基因在接種及外源水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)下的表達(dá)量差異和動(dòng)態(tài)曲線可知，黑斑病菌可能通過調(diào)控月季體內(nèi)MYC2上調(diào)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)月季水楊酸和茉莉酸/乙烯信號(hào)防御系統(tǒng)的雙重抑制。鑒于黑斑病菌這一入侵策略，月季的茉莉酸/乙烯信號(hào)防御途徑可能被病原菌一直抑制或者根本無法激活，月季抗病性的強(qiáng)弱將更多地決定于病原菌誘導(dǎo)后水楊酸防御系統(tǒng)啟動(dòng)的早晚和持續(xù)的時(shí)間，外源水楊酸及其類似物誘導(dǎo)雖然能在一定程度上提高月季的抗病性，但其效果將十分有限。

4 結(jié)論

在月季-黑斑病親和互作體系中，黑斑病菌通過抑制水楊酸和活性茉莉酸的合成而對(duì)月季水楊酸和茉莉酸/乙烯抗病防御系統(tǒng)有抑制作用，黑斑病菌在接種48 h前主要抑制水楊酸信號(hào)途徑、在接種48 h后主要抑制茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑。病原菌可能通過操縱月季MYC2的上調(diào)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)月季水楊酸和茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑的雙重抑制。