網絡藥理學方法研究茵陳蒿湯對原發(fā)性肝癌的作用機制*

趙藝蔓 徐香梅 徐 旭 侯恩存

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院肝病科 (廣西 南寧，530000)

茵陳蒿湯首見于漢代張仲景所著的《傷寒論》,陽明病篇第236條載“陽明病,發(fā)熱,汗出,此為熱越,不能發(fā)黃也。但頭汗出,身無汗,劑頸而還,小便不利,渴飲水漿者,此為瘀熱在里,身必發(fā)黃,茵陳蒿湯主之”[1]。原發(fā)性肝癌是由肝細胞或肝內單管上皮細胞發(fā)生的惡性腫瘤，是目前我國最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅我國人民的生命和健康[2]，有研究表明西藥聯合茵陳篙湯在治療原發(fā)性肝癌黃疸方面臨床效果顯著[3]。但是由于中藥成分的復雜性和人類基因的多樣性，茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的藥理學機制尚未明確。當前網絡藥理學已經應用于中藥藥性理論研究的各個方面,為從生物分子網絡的結構與功能來認知中藥藥性提供了方法學契機和有力工具[4]。本文利用網絡藥理學方法探討茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的作用機制，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 茵陳蒿湯成分的收集與篩選 茵陳蒿湯由茵陳、大黃、梔子3味中藥組成。利用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)、DrugBank數據庫收集以上3味中藥的成分，將收集到的中藥化學成分以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為限定條件進行篩選[5]，以增加結果可信度。

1.2 茵陳蒿湯潛在靶點的預測 將尋找到的候選化合物通過TCMSP平臺及DrugBank數據庫完成化學成分靶點的預測，從而得到有效成分作用的相關蛋白靶點，進行潛在治療靶點的預測。

1.3 原發(fā)性肝癌相關靶點獲取 以原發(fā)性肝癌作為關鍵詞，檢查GeneCards數據庫、CTD數據庫獲取原發(fā)性肝癌相關靶點蛋白，根據Relevance score篩選相關度前200的靶點，獲取與原發(fā)性肝癌相關的靶點。

1.4 茵陳蒿湯作用于原發(fā)性肝癌的靶點 先使用STRING平臺對藥物成分的主要潛在作用靶點進行靶點-基因名轉換，然后通過DrawVennDiagram2.1.0平臺制作韋恩圖，獲得茵陳蒿湯的作用靶點和原發(fā)性肝癌相關靶點，相互交集的靶點蛋白，即茵陳蒿湯作用于原發(fā)性肝癌的靶點。

1.5 成分-靶點網絡構建與分析 利用Cytoscape3.6.0軟件對茵陳蒿湯的成分-靶點的相互作用繪制網絡圖。在網絡中，分別用節(jié)點(node)和邊(edge)表示成分、靶點以及成分與靶點之間的相互作用。網絡節(jié)點度和介數中心度越高，說明所對應化合物或靶點在網絡中越重要。

1.6 茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關靶點蛋白相互作用網絡構建

為了了解中藥方成分及其相應目標在系統(tǒng)層面上的復雜相互作用，探討茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的作用機制，通過韋恩圖，獲得茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相互交集的靶點蛋白，通過STRING數據庫制作茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關靶點蛋白相互作用PPI網絡圖進行分析，并利用Cytoscape3.6.0軟件將網絡圖可視化，構建出茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關耙點蛋白的相互作用網絡圖。

1.7 茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌預測靶標富集分析 本研究對以上1.4獲取的相關交集靶點蛋白，通過DAVID在線分析工具進行基因富集分析(GO分析)，選擇生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組分(CC)3個模塊繪制條形圖。通過DAVID在線分析工具查找富集出來的生物通路圖，并利用Omicshare云平臺將得到的KEGG生物途徑結果進行可視化制成氣泡圖。

1.8 活性成分-靶蛋白分子對接 上述茵陳蒿湯所含化學成分的靶點預測結果，在蛋白綜合數據庫(PDB)得到相應的蛋白綜合數據庫編號(PDB-ID)。再把PDB-ID導入Systems Dock WebSite軟件對活性成分和靶蛋白進行分子對接。輸入拓撲學參數后篩選茵陳蒿湯化合物的結構，成功后開始對接，整理對接結果中分子對接評分并分析。

2 結果

2.1 茵陳蒿湯化學成分的搜集 本研究從茵陳蒿湯的各味中藥成分中篩選了44種OB≥30%、DL≥0.18的潛在成分，另外還有少量藥物相似指數不詳的成分具有廣泛的藥理活性，也被納入其中用于進一步靶點預測。茵陳、梔子、大黃分別篩選到14、15、15種成分，并且篩選出這些藥物之間非重復的41種成分。見表1。

表1 茵陳蒿湯化合物具體信息

2.2 茵陳蒿湯化學成分相應靶點蛋白預測 通過TCMSP平臺、DrugBank剔除重復及非人源靶點后共得出茵陳蒿湯潛在影響的靶點蛋白共計186個，將選取的41個成分以及所對應的靶點蛋白為節(jié)點，建立相互關系，導入Cytoscape3.6.0軟件制作出茵陳蒿湯“化合物-靶點”網絡圖。在網絡圖中有268個節(jié)點和534條相互關系(彩插頁圖1)。

2.3 茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關靶點蛋白互作網絡圖 通過制作韋恩圖獲得186個茵陳蒿湯化學成分相關靶點和200個原發(fā)性肝癌相關靶點蛋白相互交集的44個靶點蛋白，以此為節(jié)點建立茵陳蒿湯成分靶點與原發(fā)性肝癌相關靶點相互作用網絡圖(彩插頁圖2)，網絡圖中有44個節(jié)點和455條相互關系，相互作用的關鍵節(jié)點有腫瘤蛋白(TP53)、負性調節(jié)轉錄因子(JUN)、表皮生長因子受體(EGFR)、轉錄激活因子(MYC)、雌激素受體(ESR1)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK1)等，其中度值最高的是TP53。

2.4 茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌靶點的GO富集分析 為了進一步探討茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的186個候選靶點的可能機制，使用DAVID對茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的候選靶點進行GO富集分析和KEGG生物途徑分析，經過統(tǒng)計學分析后分別將BP、MF和CC中排名靠前的條目繪制成條形圖(彩插頁圖3)。

2.5 茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌靶點的KEGG生物途徑分析 通過KEGG分析茵陳蒿湯顯著發(fā)揮影響的20個生物途徑(彩插頁圖4)，結果顯示，茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的機制主要涉及PI3K-Akt、MAPK信號通路、Hepatitis B信號通路、HTLV-I信號通路、Tuberculosis信號通路等。

2.6 茵陳蒿湯化合物和疾病靶點對接驗證結果 將茵陳蒿湯化合物和疾病靶點進行簡單的對接驗證，發(fā)現Mol358(β-谷甾醇)、MOL98(槲皮黃酮)、MOL354(異鼠李素)、MOL422(山柰酚)、MOL471(蘆薈大黃素)為結合力最強的分子。分子對接結果見表2。茵陳蒿湯多個靶點分子對接評分>8.0，有強烈的結合活性(彩插頁圖5)。

表2 茵陳蒿湯化合物和疾病靶點分子對接結果

3 討論

茵陳蒿湯由茵陳、梔子、大黃等藥材組成，方中茵陳清熱利濕;梔子通利三焦,導熱下行,引濕熱自小便出;大黃瀉熱逐瘀退黃,通利大便。共奏利尿通便、祛濕退熱之功效。有研究表明茵陳的槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素等有效成分使茵陳具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎、調節(jié)免疫的功效，并具有保肝利膽、調節(jié)心血管系統(tǒng)等藥用價值[6]。大黃的蒽醌類主要的有效成分大黃酸和大黃素在許多研究中已發(fā)現此二者重多條信號通路，如MAPK信號通路和(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)PI3 K/Akt信號通路，對腫瘤的生長、增殖、凋亡和轉移均具有一定的藥物作用[6]。梔子具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、保肝、利膽、降血脂、抗血栓、神經保護等作用[7]。本研究基于網絡藥理學手段,對茵陳蒿湯進行成分、靶點與疾病的生物信息學綜合網絡構建，探究了該方治療原發(fā)性肝癌的整體機制，呈現出中醫(yī)中藥治療的多成分、多靶點、整合調節(jié)的特點，并進一步通過網絡分析揭示出核心作用通路。

在化合物靶點網絡中部分關鍵化合物分子具有高度的中心性的兒茶素，體外實驗中兒茶素本身也可以引起多種腫瘤細胞株凋亡，具有保肝利膽、抗腫瘤等作用[3]。兒茶素由3個烴環(huán)組成，從結構上可分為非酯型兒茶素和酯型兒茶素兩大類。有研究表明其中2種酯型兒茶素——表沒食子兒茶素、沒食子酸酯可能是抗肝癌效果較好的兒茶素單體[8]，并有研究證實了沒食子酸酯對肝癌細胞具有抑制增殖、誘導凋亡及周期阻滯的作用效果[9]。

本文利用Cytoscape3.6.0軟件對網絡圖進行分析后，發(fā)現相互作用的關鍵節(jié)點有TP53、JUN、EGFR、MYC、ESR1、MAPK1等，其中度值最高的是TP53。一般認為TP53基因是人類腫瘤中最常發(fā)生變化的基因,它位于染色體17 p13.1，編碼53 kDa的核磷酸蛋白,此蛋白通過p21蛋白參與細胞周期的調控,阻止細胞G1期進入S期,對細胞分裂和增殖起負調節(jié)作用。若TP53基因突變,則最終使細胞生長和分化的調節(jié)失控,導致細胞持續(xù)分裂和癌變[10]。TP53突變與人體原發(fā)性肝癌密切相關。一些實驗證明[11],在不同的生理條件下,TP53在啟動細胞凋亡時起作用。特殊信號轉導通道的生理信號或活動能阻止TP53介導的凋亡。當TP53過度表達或被激活時,細胞將走向凋亡。據國內外相關研究，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,TP53 INP2既可發(fā)揮抑制腫瘤也可發(fā)揮促進腫瘤的功能。TP53 INP2在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的差異性表達及其不同的亞細胞定位,可能與其在對應腫瘤細胞系中發(fā)揮不同的功能有關[12]。

在KEGG生物途徑富集分析中，PI3 K-Akt、MAPK信號通路、HTLV-I信號通路、Hepatitis B信號通路、Tuberculosis信號通路等被顯著性富集。PI3 K-AKT信號通路在肝癌細胞生長、分化、增殖、遷移和存活中扮演重要角色，與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關[13，14]。PI3 K是一種脂類激酶，活化的PI3 K可將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸轉化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)。PI3 K信號通路的持續(xù)激活與細胞的增殖、凋亡等過程密切相關,會導致細胞異常增殖和惡性轉化[15，16]。PIP3可使其主要下游底物AKT準確定位到近膜區(qū)并發(fā)生構象變化，同時活化的AKT轉位到細胞質和細胞核內，作用于下游底物，調控細胞代謝、蛋白合成、細胞增殖與凋亡等重要生理過程，參與細胞生長、增殖及分化調節(jié)。PI3 K-AKT信號通路是一條廣泛存在于細胞中的信號轉導通路，在細胞增殖調控中起重要作用，其表達異常存在于多種癌細胞中，尤其與肝癌發(fā)病關系密切[17]。MAPKs是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它們在細胞的增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[18]。P38 MAPK也稱為RK或CSBP,它是酵母HOG激酶的哺乳動物同源基因,作為MAPKs家族中重要的組成部分,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移等密切相關,它主要通過調控下游多種酶及轉錄因子的基因表達活性發(fā)揮生物細胞學效應[19]。在茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌黃疸方面這兩條信號通路，相互影響，相互促進。

本研究利用網絡藥理學的方法研究茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌，其作用機制可能與PI3 K-Akt、MAPK信號通路等信號通路有關。盡管有一些新的發(fā)現，但這項研究還有一些局限性，比如由于數據庫中信息不完全，茵陳蒿湯中的一些化合物可能會被忽略，一些活性成分在篩選過程中可能會被遺漏；僅選取前200個原發(fā)性肝癌靶點不夠全面，可能遺漏其他與藥物聯系緊密的重要靶點；片面考慮了直接作用而非間接作用等，在今后的研究中，需要進一步研究，并加以實驗驗證。