輻射誘變突變體鑒定技術

趙麗麗 孫小富 黃莉娟 王雷挺 趙鑫

摘 要：輻射誘變育種經(jīng)過幾十年的研究，在方法技術、誘變手段、突變體篩選等方面取得較大進步，已成為種質資源創(chuàng)新、挖掘新基因和培育新品種的一個重要途徑。本文簡要介紹了植物輻射誘變育種技術的發(fā)展情況，總結了輻射誘變育種中誘變劑量、突變體類型及主要的突變體選擇方法，并對比了各種突變體選擇方法的優(yōu)缺點，以期為提高植物誘變育種的效率提供參考。

關鍵詞：輻射誘變;突變體;鑒定技術

中圖分類號：S335?? 文獻標識碼： A

輻射誘變育種是植物育種的重要手段之一，是采用一定劑量的射線，照射植物的種子、莖段、花粉、愈傷組織或其他器官，誘發(fā)植物產(chǎn)生基因突變和染色體畸變，并從突變群體中鑒定、篩選有利突變，培育新品種的過程[1]。輻射誘變育種不僅可以大大提高植物基因的突變頻率，在短時間內獲得有價值的突變體，而且多數(shù)突變屬于小量突變，在改良品種時保證了原有品種的優(yōu)質性狀，常被用于改良優(yōu)良品種的單一性狀[2]。輻射誘變主要的輻射源有γ、X、β射線和中子等電離輻射源，離子束、激光和紫外線等非電離輻射源。各種輻射源的性質、波長不同，引起的變異效果不同，所以輻射應用范圍也不同[1]。其中60Co-γ射線的穿透性強，波長短，誘變效果穩(wěn)定，誘變當代效果直觀，M2代即可出現(xiàn)大量明顯的突變性狀，突變體易于篩選，所以60Co-γ射線成為高等植物誘變育種中應用最多的輻射源[3]。據(jù)統(tǒng)計，目前輻射誘變育成的突變品種中，70%以上來自γ輻射或用γ輻射誘發(fā)的突變體培育而成[4]。

誘變育種應用廣泛，育種效果顯著。誘變育種過程包括誘變源選擇、最佳輻射劑量確定、突變體篩選和鑒定等，每個過程對誘變育種的成敗起到重要作用。本文對誘變育種關鍵環(huán)節(jié)研究進展進行綜述，擬為各種植物誘變育種提供技術支持。

1 輻射誘變育種技術的發(fā)展情況

1896年，法國科學家BECQUEREL H A發(fā)現(xiàn)了天然放射性元素鈾，揭開了原子能時代的序幕[5]。之后，越來越多的研究者開始關注核輻射的生物學效應，生物學和農(nóng)業(yè)科學領域開始了核技術的應用研究。1927年，昆蟲學家MULLER H J發(fā)現(xiàn)X射線能誘發(fā)果蠅產(chǎn)生多種類型的遺傳性變異[6]。1928年，植物育種學家STADLER L J利用X射線研究了輻射對小麥和玉米等農(nóng)作物產(chǎn)生的誘變效應，開啟了人們對植物誘變育種技術的研究[7]。1934年，印度尼西亞科學家D. Tollenear等利用X射線育成了世界上第一例輻射誘變煙草突變新品種“Chlorina F1”[1]。到50至60年代，隨著遺傳學、細胞生物學等學科的發(fā)展，輻射誘變的規(guī)律逐步被了解，促使誘變育種方法進一步成熟，并獲得了一些突出性成果[8]。特別是1969年《突變育種手冊》的出版，使得輻射誘變育種技術得到迅速的發(fā)展[9]。進入70年代后，離體培養(yǎng)技術有效地解決了輻射誘變育種中嵌合體的形成[10]。到80年代，輻射誘變育種開始與化學誘變、雜交育種、倍性育種及現(xiàn)代生物技術等方法相互交叉、結合，發(fā)展成為綜合性育種技術。到20世紀末，全世界已有50多個國家運用輻射誘變育種技術在150多個植物種類上育成了近1 800個品種[11]。進入21世紀，輻射誘變育種技術不僅為科學家提供了創(chuàng)造和篩選突變體的廣闊平臺，豐富了物種的遺傳變異范疇，也為遺傳學研究和植物育種家提供了嶄新的手段和領域[12]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織/國際原子能機構（food and agriculture organization of the united nations/international atomic energy agency，F(xiàn)AO/IAEA）突變品種數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計：截至2009年9月，世界上60多個國家在170多種植物上利用誘發(fā)突變技術育成和推廣了3 088個突變品種;截至2013年9月底，在214個植物種類上育成3 218個突變品種。其中，中國在45種植物上育成了802個突變品種，超過目前國際誘變育成品種數(shù)據(jù)庫中總數(shù)的1/4，位居世界第一。特別是棉花品種“魯棉一號”、水稻品種“原豐早”、大豆品種“鐵豐18號”等多個誘變品種獲得國家發(fā)明一等獎。這些突變品種累計種植面積己達到數(shù)億公頃，創(chuàng)造了巨大的社會和經(jīng)濟效益[1]。

2 輻射劑量選擇及突變類型

2.1 輻射敏感性和劑量選擇

輻射誘變育種的關鍵是采取適當?shù)膭┝?，既獲得較高的變異率和較寬的變異譜，又不致過分損傷植株。適宜的輻射劑量與材料的輻射敏感性有關，需考慮到植物種類、品種、器官、發(fā)育階段、生理狀況及外界因素，是一個比較復雜的問題[13]。輻射劑量過低，起不到誘變作用;輻射劑量過高，變異頻率雖然增加，但植物的死亡率也會增加，影響選擇機率。因此，確定植物的適宜輻射劑量被稱為誘變育種的第一步工作[14]。目前，國內外一般采用半致死劑量和臨界劑量確定輻射誘變適宜劑量，采用的指標包括種子發(fā)芽率、植株成活率、出苗率、植株不育程度和生長抑制程度等。胡瑞陽、耿興敏和李鳳濤等分別針對杉木（Cunninghamia lanceolata）、桂花（Osmanthus fragrans）和白刺花（Sophora davidii）等研究材料，分析了60Co-γ射線對不同植物種子萌發(fā)的影響，提出了各種植物種子適宜輻射劑量，有效突變劑量的選擇為后期突變性狀的產(chǎn)生和突變體的選擇提供了保障[14-16]。

2.2 輻射誘變后代主要突變類型

輻射誘變已經(jīng)在農(nóng)作物、花卉、果樹、牧草等植物中得到廣泛應用，獲得了大量有益突變體，為植物育種及基因功能的研究奠定了基礎。李臻等經(jīng)多年種植及篩選，從圣稻15誘變突變體庫中獲得93份在葉色、葉形、株高、抽穗期、穗型、粒型等方面出現(xiàn)明顯變異的突變體[17]。孫孟園等從輻射誘變獲得的大豆突變體中發(fā)現(xiàn)了葉片、株型、生育期、粒形、籽粒蛋白質及油脂等性狀的突變體[18]。彭振英等對花生干種子進行60Co-γ輻射誘變處理，獲得了高油突變體和高蛋白突變體[19]。宋華偉等利用60Co-γ輻射誘變結縷草，從誘變材料中選育獲得了3個抗旱性優(yōu)于其親本的新品系[20]。李新鵬等通過60Co-γ輻射誘變京科糯2000，獲得了一個糯玉米突變體庫，在該突變體庫中鑒定出71個不同類型的雄性完全不育的突變體[21]。綜上，輻射誘變產(chǎn)生的突變類型主要包括株高突變、產(chǎn)量突變、品質突變、抗性突變和育性突變等方面[17]。

3 輻射誘變突變體篩選和鑒定

突變體是植物育種、挖掘基因和研究功能基因組學的重要材料。而各類突變體后代，需要經(jīng)過詳細而大量的鑒定，才能明確其突變的位點和特點，工作量大，過程繁雜，耗時耗力。因此，突變體的鑒定與選擇在植物誘變育種中占有舉足輕重的位置，特別是突變體的早期鑒定分離與篩選[22]。如何以有效的手段鑒定和選擇優(yōu)良突變體卻是誘變育種的一個難題，目前常用的方法有形態(tài)學、細胞學、生化和分子標記鑒定等。

3.1 形態(tài)學鑒定

形態(tài)學鑒定是將突變體和原品種進行比對，觀察與記錄植物的外部形態(tài)特征，要求必須有能遺傳的、相對于野生型有顯著差異的外觀性狀，一般也包括逆境篩選和化驗分析篩選。謝向譽等利用60Co-γ輻射木薯后，通過形態(tài)學鑒定獲得了穩(wěn)定的裂葉葉形突變體、葉柄顏色突變體、株高突變體、莖粗突變體等[23]。趙麗麗等發(fā)現(xiàn)白刺花輻射誘變后代在植株高度、冠幅直徑、莖粗、葉片大小、分枝位點高度等方面發(fā)生了顯著的變異[12]。表型鑒定的方法簡單、直觀、易行，不需要特殊的硬件設備，能直接反映突變體的表型性狀變化，可以對變異的性狀做出直接的判斷。但是因為該方法容易受到生長環(huán)境和人為因素的影響，所以多態(tài)性差、準確性不高，在突變體鑒別方面的作用是很有限的。因此，在篩選突變體的工作中，一般都會與其他鑒定方法混合使用。

3.2 細胞學鑒定

細胞學鑒定是利用普通顯微鏡、電鏡或熒光原位雜交技術在細胞水平對誘變后代的細胞變異進行鑒定，不僅可以鑒定輻射誘變后代的細胞及細胞器的形態(tài)變化，還可以鑒定染色體易位、缺失等變異[1]。在小麥矮化突變體及水稻卷葉突變體鑒定中，借助石蠟切片技術，從細胞學水平鑒定出矮化突變體多因莖稈細胞長度減少和細胞變小引起;卷葉突變體多因泡狀細胞、厚壁細胞及薄壁細胞的變化，以及維管束中韌皮部變化和葉肉細胞的變化引起[24-25]。水稻雄性不育突變體是因小孢子畸形、萎縮不能形成正常的花粉粒[26]。染色體是遺傳物質的載體，染色體變異必然會導致遺傳變異的發(fā)生。γ射線輻照處理的黃花苜蓿細胞出現(xiàn)了多倍體突變，多倍體出現(xiàn)的幾率為39.98%～41.71%[27]。γ射線輻照后，籽粒莧細胞中出現(xiàn)了染色體

微核畸變、染色體橋、落后染色體、游離染色體、粘連染色體等[28]。細胞學鑒定雖然克服了形態(tài)學標記易受環(huán)境影響的缺點，但存在耗時費力、非染色體變異性狀難以檢測、基因的精細定位困難等缺點，所以近年來細胞學鑒定未得到廣泛的應用。

3.3 生化鑒定

生化鑒定是基于蛋白質多態(tài)性發(fā)展起來的一種標記方法，包括同工酶和貯藏蛋白（谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白及清蛋白等）電泳鑒定。因為蛋白質是基因表達的產(chǎn)物，借助聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得蛋白質譜帶，能從一定程度上反映植物的遺傳變異。樊光輝利用Co輻射誘變枸杞“寧杞1號”的種子，結合單株選優(yōu)和同工酶譜分析，成功選育出輻射誘變優(yōu)良新品系[29]。生化鑒定方法較為簡單，易于操作，經(jīng)濟方便，受到廣泛應用。但其也存在標記數(shù)量有限，穩(wěn)定性差，不利于貯存和運輸?shù)葐栴}。特別是同工酶檢測中，因為酶不是基因的直接產(chǎn)物，中間存在一個表達、調節(jié)、修飾的問題，所以其檢測的可靠性受到一定程度上的影響。另外，同工酶具有發(fā)育、組織和物種的特異性，易受發(fā)育時期和環(huán)境因素影響。這些缺點一定程度上制約了生化鑒定技術的應用和發(fā)展。

3.4 分子標記鑒定

分子標記鑒定是繼形態(tài)學、細胞學和生化鑒定突變體之后應用廣泛的一種較為理想和新的遺傳標記形式。分子標記的研究開始于20世紀80年代，經(jīng)過多年的發(fā)展，分子標記大致可以分為4類：（1）以分子雜交為基礎，如限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。（2）以限制性酶切和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術為基礎，如酶切擴增多態(tài)性序列（cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS）和擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。（3）基于PCR技術的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子標記，包括隨機引物的PCR標記，如隨機擴增多態(tài)性（random amplified polymorphism DNA，RAPD）;特異引物的PCR標記，如簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、序列特異性擴增區(qū)（sequence-characterized amplified region，SCAR）等。（4）基于DNA芯片技術的分子標記技術，如單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。該技術在突變體鑒定中得到廣泛應用。如RFLP、AFLP、SSR、SNP等分別在水稻、唐菖蒲、狼尾草、煙草等植物的突變體鑒定中得到成功的應用[30-33]。分子標記鑒定技術的優(yōu)點：突變位點直接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物體的各個組織、各發(fā)育時期均可檢測到，不受季節(jié)環(huán)境限制，結果可靠性強;檢測位點多、多態(tài)性高;而且許多分子標記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供的遺傳信息較完整。但也存在一定的局限性，如其檢測到的突變位點可能沒有相應的表型，或者找到多個突變位點后，不能確定到底哪個位點與缺失的功能相關，只能說明誘變材料從DNA水平上發(fā)生了變化以及突變發(fā)生的頻率[34]。

4 結語

隨著輻射育種研究的快速發(fā)展，誘變育種逐漸與雜交育種、組織培養(yǎng)、分子鑒定等密切結合，現(xiàn)已發(fā)展成為一門成熟的綜合性育種新技術，并在農(nóng)作物、蔬菜、果樹、觀賞植物和牧草育種中取得了很多可喜的成果。誘變育種中，突變體的早期鑒定和選擇至關重要，常用的形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定、生化鑒定和分子標記鑒定4種方法各有優(yōu)缺點，為取得很好的鑒定效果，一般根據(jù)植物特性、突變類型和試驗條件等選擇多個鑒定方法進行綜合鑒定。

參考文獻：

[1]趙林姝， 劉錄祥. 農(nóng)作物輻射誘變育種研究進展[J]. 激光生物學報， 2017， 26（6）： 481-489.

[2]云錦鳳. 牧草及飼料作物育種學[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2005.

[3]YANG C， ZHU J， JIANG Y， et al. 100 Gy 60 Co γ-ray induced novel mutations in tetraploid wheat[J]. Scientific World Journal， 2014， 20（14）： 725-813.

[4]SHU Q Y， FORSTER B P， NAKAGAWA H. Plant mutation breeding biotechnology[M]. Wallingford， UK： CABI Publishing， 2012.

[5]BECQUEREL H A. On radioactivity， a new property of matter[M]. Amsterdam， Netherlands： Elsevier Publishing Company， 1903： 52-70.

[6]MULLER H J. Artificial transmutation of the gene[J]. Science， 1927， 66： 84-87.

[7]STADLER L J. Mutations in barley induced by X-rays and radium[J]. Science， 1928， 68： 186-187.

[8]李雅志. 國內外果樹誘發(fā)突變的幾個問題及其研究的趨向[J]. 落葉果樹， 1979（2）： 26-36.

[9]高健， 盧惠萍. 花卉輻射誘變育種研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報， 2000， 27（3）： 228-230.

[10]BROERTJES C， ROEST S， BOKELMANN G S. Mutation breeding of Chrysanthemum morifolium RAM. using in vivo and in vitro adventitious bud techniques[J]. Euphytica， 1976， 25： 11-19.

[11]MALUSZYNSKI M， AHLOOWALIA B S， SIGURBJRNSSON B. Application of in vivo and in vitro mutation techniques for crop improvement[J]. Euphytica， 1995， 85： 303-315.

[12]趙麗麗， 王普昶， 張宇君， 等. 白刺花輻射誘變M2代突變群體的形態(tài)特征比較和ISSR分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2018， 26（10）： 1698-1706.

[13]ROBERTS T， MCDONALD G， LEHMAN E， et al. Effects of radiation on wheat germination[J]. Transactions of the Kansas Academy of Science， 2015， 73（1）： 134-136.

[14]胡瑞陽， 吳博， 納靜， 等. 60Co-γ射線輻照處理對杉木種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 中國農(nóng)學通報， 2016， 32（4）： 1-4.

[15]耿興敏， 王良桂， 李娜， 等. 60Co-γ輻射對桂花種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 核農(nóng)學報， 2016， 30（2）： 216-223.

[16]李鳳濤， 趙麗麗， 王普昶， 等. 60Co-γ輻射對白刺花幼苗生理的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2015， 43（5）： 83-87.

[17]李臻， 王慶國， 劉煒， 等. 水稻突變體庫的構建及部分性狀分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學， 2018， 50（11）： 16-22.

[18]孫孟園， 白云， 李振宇， 等. 60Co-γ射線誘變大豆“桂夏7號”突變體篩選[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學學報， 2018， 36（6）： 737-744.

[19]彭振英， 王興軍， 田?，摚?等. 花生60Co-γ輻射誘變和突變體庫的構建[J]. 核農(nóng)學報， 2016， 30（3）： 422-429.

[20]宋華偉， 劉穎， 曹榮祥， 等. ZS-SJZ結縷草與60Co-γ輻射誘變新品系的抗寒性比較[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學， 2015， 42（20）： 39-44.

[21]李新鵬， 李京琳， 陳小朋， 等. 玉米突變體庫創(chuàng)制及雄性不育突變體鑒定[J]. 玉米科學， 2018， 26（3）： 12-16， 21.

[22]HWANG S G， DONG S K， HWANG J E， et al. Identification of altered metabolic pathways of γ-irradiated rice mutant via network-based transcriptome analysis[J]. Genetica， 2015， 143（6）： 635-644.

[23]謝向譽， 尚小紅， 周慧文， 等. 60Co-γ輻射對木薯生長的影響及其突變體的SCoT分析[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（3）： 513-519.

[24]趙秋實， 李倩倩， 王超杰， 等. 普通小麥品種陜農(nóng)33矮稈突變體的矮化效應分析[J]. 麥類作物學報， 2018， 38（9）： 1053-1064.

[25]周亭亭， 饒玉春， 任德勇. 水稻卷葉細胞學與分子機制研究進展[J]. 植物學報， 2018， 53（6）： 848-855.

[26]胡麗芳， 蘇連水， 朱昌蘭， 等. 輻射誘變水稻雄性不育突變體tda的遺傳與細胞學分析[J]. 核農(nóng)學報， 2015， 29（12）： 2253-2258.

[27]石鳳玲， 石鳳翎， 趙敏， 等. 60Co-γ輻射對黃花苜蓿出苗和染色體的誘變效應[J]. 種子， 2016， 35（4）： 40-43.

[28]韓微波， 劉麗， 李禹堯， 等. 不同誘變處理下籽粒莧種子細胞學效應的比較[J]. 北方園藝， 2017（14）： 85-88.

[29]樊光輝. “寧杞1號”枸杞輻射誘變育種初報[J]. 北方園藝， 2014（2）： 149-151.

[30]莊楚雄， 胡維民， 梅曼彤. 高能重離子輻射誘導水稻半矮生突變株系的RFLP分析[J]. 核農(nóng)學報， 1997（2）： 11-15.

[31]劉長命， 張顯. 唐菖蒲復色花突變體AFLP及SCAR標記研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報， 2009， 18（5）： 237-240.

[32]武炳超， 童磊， 杜昭昌， 等. 60Co-γ射線對2種狼尾草屬牧草的誘變效應[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2019， 52（3）： 414-427.

[33]孫明銘， 蔣彩虹， 羅朝鵬， 等. 煙草黃綠葉突變體的遺傳分析與基因定位[J]. 植物遺傳資源學報， 2018， 19（5）： 942-950.

[34]郭建秋， 雷全奎， 楊小蘭， 等. 植物突變體庫的構建及突變體檢測研究進展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學， 2010（6）： 150-155.

（責任編輯：周曉南）

Identification Technology of Mutants Induced by Radiation

ZHAO Lili*， SUN Xiaofu， HUANG Lijuan， WANG Leiting， ZHAO Xin

（College of Animal Science，Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract：

After decades of research， radiation mutation breeding has made great progress in methods and techniques， method of inducing mutation， mutant screening method， and so on. It has become an important way to innovate germplasm resources， excavate new genes and breed new varieties. This paper briefly introduced the development of plant radiation mutation breeding technology， summarized the mutation dose， mutant types and main mutant selection methods in radiation mutation breeding， and compared the advantages and disadvantages of various mutant selection methods， in order to provide reference for improving the efficiency of plant mutation breeding.

Key words：

radiation mutation; mutant; identification technology

收稿日期：2019-09-23

基金項目：貴州省科技計劃資助項目（黔科合支撐[2016]2516號，黔科合重大專項字[2016]3002號）;國家自然科學基金資助項目（31702173）;貴州省高層次創(chuàng)新型人才資助項目（黔財教[2017]45號）

作者簡介：趙麗麗（1981-），女，教授，博士，研究方向：牧草種質資源及育種，Email： zhaolili_0508@163.com.

通訊作者：趙麗麗，Email： zhaolili_0508@163.com.