mTOR復(fù)合物在細(xì)胞遷移中的作用*

阿春仙，金曉麗，袁淑琴，趙三軍

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500)

細(xì)胞遷移是細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動方式，在生物的個體發(fā)育、組織再生、傷口愈合及免疫防御等過程中具有重要意義.細(xì)胞遷移大致概括為以下四個物理過程：(1)細(xì)胞膜向前端伸出形成板狀偽足；(2)偽足和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)形成新的細(xì)胞黏著；(3)在肌動蛋白和肌球蛋白影響下，細(xì)胞收縮后整體異位；(4)尾端和周圍基質(zhì)脫離，細(xì)胞向前運(yùn)動[1].大量的研究結(jié)果表明，細(xì)胞骨架的動態(tài)組裝、黏著斑、整合素、黏著斑激酶、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和Rho GTP酶(Rho GTPases)在細(xì)胞遷移中發(fā)揮十分重要的作用.

細(xì)胞遷移調(diào)控異常會導(dǎo)致發(fā)育異常、傷口難愈、血管疾病和腫瘤惡性轉(zhuǎn)移等諸多疾病，因此必須確保遷移過程的時空準(zhǔn)確性.細(xì)胞外信號通過受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)和G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供時空信息，指導(dǎo)細(xì)胞骨架元素的重排，建立細(xì)胞極性，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移[2].此外，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)和磷脂酶C(phospholipase C，PLC)等許多信號通路都參與了細(xì)胞定向遷移的調(diào)控[3].

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)廣泛信號通路中，mTOR復(fù)合物能通過下游的效應(yīng)蛋白將細(xì)胞遷移信號傳遞給細(xì)胞骨架以及細(xì)胞骨架調(diào)控相關(guān)蛋白，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮的作用不可忽視.為了更深入地了解mTOR復(fù)合物在細(xì)胞遷移過程中的作用，對mTOR復(fù)合物的組成和它們在細(xì)胞遷移中的作用的最新研究進(jìn)行系統(tǒng)闡述，為后續(xù)研究提供參考.

1 mTOR復(fù)合物的介紹

1.1 mTORC1和mTORC2的構(gòu)成

mTOR也稱為西羅莫司效應(yīng)蛋白(sirolimus effector protein，SEP)，分子量為289 kDa，由定位于染色體1p36.2的單個基因編碼.mTOR作為雷帕霉素的機(jī)制靶點(diǎn)，是從酵母到哺乳動物細(xì)胞都普遍存在，在結(jié)構(gòu)和功能上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸(serine/threomine，Ser/Thr)激酶，屬于PI3K相關(guān)激酶家族.mTOR蛋白具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)域(圖1)，從氨基端到羧基端依次排列為： 20個串聯(lián)重復(fù)序列(HEAT repeats)、FAT域(focal adhesion targeting domain)、FRB域(FKBP12-rapamycin binging domain)、激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain)、阻遏物域(repressor domain)和FATC域(focal adhesion targeting domain of C-terminal)[4-5].

mTOR在細(xì)胞內(nèi)主要通過與其他蛋白質(zhì)分子相互作用形成多蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，根據(jù)對雷帕霉素是否敏感，mTOR復(fù)合物分為對雷帕霉素敏感的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)和對雷帕霉素不敏感的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2 (mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2).mTORC1和mTORC2在結(jié)構(gòu)上既有相同的組分，又有各自特有的組分(圖1).mTOR、哺乳類LST8同源蛋白(mammalian lethal with Secl 3 protein 8，mLST8，又名GβL)、含DEP結(jié)構(gòu)域的mTOR結(jié)合蛋白(DEP-domain-containing mTOR-interacting protein，Deptor)均存在于mTORC1和mTORC2中.mTORC1特有的組分包括mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(regulatory associated protein of mTOR，Raptor)、富含脯氨酸的AKT底物蛋白(proline-rich substrate of AKT of 40 kDa，PRAS40)；mTORC2特有的組分包括雷帕霉素不敏感性伴隨蛋白(rapamycin-insensitive companion of mTOR，Rictor)、哺乳動物壓力活化蛋白激酶相互作用蛋白1(stress-activated protein kinase-interating protein，mSin1)、熱休克蛋白70(heat shock protein，Hsp70)和Protor(protein observed with Rictor)[6-7].mTORC1中各組分的具體作用為：(1)Raptor最為重要，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)復(fù)合物的組裝和招募底物；(2)mLST8作為mTORC1的信號接收器；(3)PRAS40和Deptor通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式影響mTORC1的活性.mTORC2中各個組分的具體作用為：(1)Rictor最為重要，mTORC2的組裝、穩(wěn)定性、底物識別和亞細(xì)胞定位均需要Rictor的參與，Rictor缺失將導(dǎo)致mTORC2無法發(fā)揮激酶活性；(2)mSin1與Rictor相互作用，維持mTORC2的結(jié)構(gòu)完整性[8]；(3)Deptor是mTORC2的內(nèi)源性抑制劑；(4)mLST8參與維持mTORC2的激酶活性以及復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；(5)Protor是Rictor的結(jié)合組件，現(xiàn)有研究顯示它對mTORC2組裝和催化無影響[9-10].

圖1 mTORC1和mTORC2復(fù)合物

1.2 mTOR復(fù)合體的上下游調(diào)控分子

除了特異性結(jié)合組分和對雷帕霉素的敏感性不同，mTORC1與mTORC2在響應(yīng)調(diào)控分子方面也存在差異(圖1).mTORC1對雷帕霉素、氧氣、氨基酸、壓力、葡萄糖及生長因子等多種上游調(diào)控分子做出響應(yīng)，主要參與形成PI3K/AKT/mTORC1和LKB1/AMPK/TSC/mTORC1兩條信號通路[4,11].這里以PI3K/AKT/mTORC1信號通路為例進(jìn)行闡述：上游調(diào)控因子如表皮生長因子受體(pidermal growth factor receptor，EGFR)接收外界信號刺激使細(xì)胞內(nèi)的PI3K活化，活化的PI3K使磷脂酰肌醇2-磷酸(phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate，PIP2)轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate，PIP3)，進(jìn)而通過磷脂酰肌醇依賴性激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)和磷脂酰肌醇依賴性激酶2 (phosphoinositide-dependent kinase 2，PDK2)以磷酸化方式激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或稱為AKT)，正向調(diào)控mTORC1的功能[12].活化的mTORC1主要通過調(diào)控下游的兩個經(jīng)典效應(yīng)分子——核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1)和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiaton factor 4E-binding protein 1，4E-BP1)來控制蛋白質(zhì)的翻譯，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖[13].

與mTORC1相比，對mTORC2的研究起步較晚.mTORC2的上游調(diào)控因子主要是生長因子和葡萄糖，mTORC2通過磷酸化激活方式調(diào)節(jié)下游的血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控激酶(serum/glucocorticoid regulated kinase-1，SGK)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、I型胰島素樣生長因子受體(type I insulin-like growth factor receptor，IGF-IR)和AKT，從而調(diào)控細(xì)胞存活、營養(yǎng)代謝、細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞遷移[14-15].AKT在細(xì)胞周期進(jìn)展、葡萄糖代謝、基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和新生血管形成等過程中起關(guān)鍵作用，AKT的完全激活需要兩個位點(diǎn)的磷酸化：一個是Ser308，該位點(diǎn)可通過PDK1磷酸化激活；另一個位點(diǎn)為Ser473，該位點(diǎn)可通過mTORC2激活，mTORC2成分敲除會阻止AKT在Ser473位點(diǎn)磷酸化，并抑制AKT下游部分底物的磷酸化[16-17].

2 mTOR復(fù)合體在細(xì)胞遷移中的作用

細(xì)胞遷移的過程涉及細(xì)胞骨架蛋白的動態(tài)組裝、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間黏著的變化、周圍基質(zhì)的重塑等，越來越多的研究證實(shí)mTOR復(fù)合物在以上過程中發(fā)揮重要作用(見圖2).mTORC1主要通過調(diào)控遷移相關(guān)基因的表達(dá)和翻譯來調(diào)節(jié)遷移，而mTORC2主要通過調(diào)控影響細(xì)胞骨架動態(tài)組裝的相關(guān)蛋白的激活來調(diào)節(jié)遷移.

圖2 mTOR復(fù)合物在細(xì)胞遷移中的作用

2.1 mTORC1對細(xì)胞遷移的影響

2.1.1 mTORC1通過調(diào)控S6K1調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移

S6K1屬于AGC激酶家族，是一個保守的Ser/Thr激酶.mTORC1調(diào)節(jié)S6K1從而調(diào)控細(xì)胞遷移的方式主要有4種：(1)促進(jìn)肌動蛋白重構(gòu)：mTORC1活化S6K1后可促進(jìn)肌動蛋白絲重構(gòu)，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移.早期對主動脈平滑肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素抑制纖連蛋白誘導(dǎo)的mTORC1和S6K1的活化，并顯著降低平滑肌細(xì)胞對纖連蛋白的趨化性[18].Berven等的研究結(jié)果也顯示，在小鼠Swiss3T3細(xì)胞遷移的過程中，激活的S6K1、AKT、PDK1、p85、PI3K和mTOR等蛋白定位于正在遷移的細(xì)胞的偽足前緣肌動蛋白弧[19].(2)影響?zhàn)ぶ叩男纬桑簃TOR的激酶活性對于F-肌動蛋白重組和黏著斑蛋白的磷酸化至關(guān)重要，mTOR-raptor復(fù)合體被破壞后，胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-Ι，IGF-I)誘導(dǎo)的F-肌動蛋白(F-actin)重組和黏著斑形成相關(guān)蛋白的磷酸化會被抑制[20].(3)影響細(xì)胞外基質(zhì)重組：基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重組，在抗沉默功能的1B組蛋白伴侶基因(ASF1B)過表達(dá)的人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞(786-O)和人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞(Caki-1)中，AKT和S6K1的磷酸化水平顯著上調(diào)，從而使基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotein-2，MMP-2)和MMP-9表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)[21].(4)影響Rho GTPases的表達(dá)和激活：雷帕霉素處理后，人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的遷移能力減弱，在該細(xì)胞中過表達(dá)RhoA蛋白后，受損的細(xì)胞遷移能力得到提高，恢復(fù)到與野生型相當(dāng)?shù)乃?，而該過程中Rho GTPases的表達(dá)受到S6K1調(diào)控[22].

2.1.2 mTORC1通過調(diào)控4E-BP1調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移

4E-BP1是一種翻譯抑制因子，與真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF-4E)之間的結(jié)合受磷酸化調(diào)控.eIF-4E是一種帽結(jié)合蛋白，在真核生物翻譯起始階段，通過與真核起始因子4G(eukaryotic initiation factor 4G，eIF-4G)和真核起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A，eIF-4A)結(jié)合形成三聚體的真核起始因子4F(eukaryotic initiation factor 4F，eIF-4F)，輔助含有5′-非翻譯區(qū)的mRNA與核糖體結(jié)合，啟動MMP-9的mRNA翻譯，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動能力[7,23].活化的mTOR直接在T37/T46位點(diǎn)磷酸化4E-BP1使其失活，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和遷移能力[6,23-24].mTORC1通過調(diào)控4E-BP1的磷酸化從而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的具體機(jī)制在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的研究中有較好的揭示：蝸牛同源物1蛋白(Snail1)抑制E-鈣粘蛋白表達(dá)，從而增強(qiáng)上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，而EMT是實(shí)體腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要過程[25-26].4E-BP1的磷酸化能激活翻譯過程，選擇性地上調(diào)Snail1的表達(dá)來增強(qiáng)EMT功能，增強(qiáng)細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[27].此外，轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(metastasis associated protein-1，Mta-1)可能通過AKT/mTOR/4E-BP1通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展[28].在珠蛋白基因過度表達(dá)的小鼠成纖維細(xì)胞中，mTOR、S6K1和4E-BP1的磷酸化水平下降，細(xì)胞遷移能力受損[17].

2.2 mTORC2對細(xì)胞遷移的影響

2.2.1 mTORC2通過直接調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移

肌動蛋白細(xì)胞骨架的動態(tài)組裝是細(xì)胞遷移的基礎(chǔ)，mTORC2可以直接調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架來調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移.在中性粒細(xì)胞趨化運(yùn)動過程中，mTORC2可直接調(diào)控F-actin極化和肌球蛋白II(myosin II，MyoII)磷酸化[22].在HeLa細(xì)胞中，mTORC2直接在絲氨酸2 152位點(diǎn)磷酸化細(xì)絲蛋白A，影響?zhàn)ぶ叩男纬蒣29].mTORC1/mTORC2的雙抑制劑KU0063794能特異地引起F-actin的異常積累和微管的無序分布，影響內(nèi)皮細(xì)胞的伸長和成管[30].研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(GL15細(xì)胞)中，抑制mTORC1后，肌動蛋白應(yīng)力纖維的數(shù)量減少，細(xì)胞遷移速度減緩，而抑制mTORC2后，肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成完全被破壞，細(xì)胞遷移被抑制[31].

2.2.2 mTORC2通過調(diào)控AKT調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移

AKT是一種Ser/Thr激酶，由三種亞型(AKT1、AKT2和AKT3)組成，細(xì)胞的存活、代謝、增殖和肌動蛋白細(xì)胞骨架組織都依賴于AKT的激活[32-33].mTORC2的關(guān)鍵組分Rictor通過調(diào)控AKT在調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨向運(yùn)動中發(fā)揮關(guān)鍵作用：(1)對高等真菌盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)研究表明，Rictor的同源異構(gòu)體PiaA是細(xì)胞趨電性相關(guān)的重要基因[34].(2)抑制白細(xì)胞中的Rictor基因后，細(xì)胞趨化性明顯減弱[22].在本課題組進(jìn)一步的細(xì)胞趨電性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Rictor表達(dá)降低并不影響細(xì)胞對電場方向的響應(yīng)及在電場下的趨電性遷移速度，這與在盤基網(wǎng)柄菌中的結(jié)果完全不同.

mTORC2通過調(diào)控AKT進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞遷移的機(jī)制主要包括：(1)調(diào)節(jié)肌動蛋白組裝：mTORC2/AKT可以在肌動蛋白結(jié)合蛋白(Girdin)的1 416位點(diǎn)磷酸化絲氨酸使其激活，而后在正在遷移的細(xì)胞前緣聚集磷酸化的Girdin，從而介導(dǎo)細(xì)胞遷移[35].經(jīng)抑制劑PP242處理后，mTORC2/AKT被抑制，導(dǎo)致多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞前緣的肌動蛋白應(yīng)力纖維解體，F(xiàn)-actin的積累受損，從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力[31].此外，PDK1/AKT通過調(diào)節(jié)輔助蛋白(如肌動蛋白亞基p150)的結(jié)合來控制微管，從而控制小鼠新皮層神經(jīng)元通過皮層板的遷移速度，而mTORC2在此過程中的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步研究[36-37].(2)影響EMT進(jìn)程：mTORC2下調(diào)后造成的AKT1下調(diào)能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的EMT進(jìn)展[38].順鉑和阿司匹林聯(lián)合使用能抑制非小細(xì)胞肺癌球狀體的遷移，對其潛在機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林預(yù)處理可抑制mTOR的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致AKT未被磷酸化，從而激活糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，Gsk3β)，使得Snail和β連環(huán)蛋白不穩(wěn)定，恢復(fù)EMT過程[39].(3)促進(jìn)活化T細(xì)胞的核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)泛素化和降解：mTORC2激活A(yù)KT后，AKT通過蛋白酶體促進(jìn)NFAT的泛素化和降解，從而損傷細(xì)胞的遷移和侵襲能力[40].(4)與mTORC1相似，mTORC2/AKT也能調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的MMP-2和MMP-9的表達(dá)來抑制細(xì)胞遷移和侵襲[41].

2.2.3 mTORC2通過調(diào)控PKC家族成員調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移

PKC是一種絲/蘇氨酸激酶，與蛋白激酶A和蛋白激酶G共同組成AGC家族.在哺乳動物細(xì)胞中，mTORC2通過磷酸化不同的PKC家族成員，調(diào)節(jié)肌動蛋白重組進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生和細(xì)胞運(yùn)動[13,42].Masri等人的研究證實(shí)，Rictor和PKC-α的過表達(dá)會增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[43].在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，使用星孢菌素抑制PKC后，細(xì)胞中P120連環(huán)蛋白和E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低[44].mTOR抑制劑處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后，PKC-α活性降低，隨后導(dǎo)致MMP-2和MMP-9的活性增強(qiáng)，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)[45].

3 小結(jié)和展望

細(xì)胞遷移是一個高度協(xié)調(diào)的多步驟重疊發(fā)生的復(fù)雜過程，很多信號通路參與細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)過程.mTOR是細(xì)胞生長、增殖、分化和存活的中樞調(diào)控因子，其參與形成的多蛋白復(fù)合物mTORC1和mTORC2通過調(diào)控多個下游分子調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動、侵襲和惡性腫瘤轉(zhuǎn)移(圖2).mTORC1磷酸化S6K1和4E-BP1，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、遷移和侵襲.mTORC2調(diào)控下游AGC激酶家族的AKT和PKC從而調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的組裝，進(jìn)而影響細(xì)胞遷移能力.然而仍有問題尚不清楚，例如：(1)盡管諸多研究結(jié)果都證明AKT參與調(diào)控細(xì)胞遷移，但是AKT調(diào)控細(xì)胞遷移的具體效應(yīng)器還不清楚；(2)mTOR下游的另一個效應(yīng)分子SGK是否參與細(xì)胞運(yùn)動和侵襲的調(diào)控，如果參與，又是如何調(diào)控的；(3)在調(diào)控細(xì)胞遷移過程中，mTOR與其他信號通路或蛋白質(zhì)相互作用的具體機(jī)制也不清楚；(4)mTOR復(fù)合物的各個組分在細(xì)胞遷移過程中的貢獻(xiàn)如何.細(xì)胞遷移在個體發(fā)育、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等重要生理或病理過程中具有重要的作用，全面理解mTOR信號通路在細(xì)胞遷移中的具體調(diào)控機(jī)制有助于對諸多生物學(xué)過程的理解，也有助于相關(guān)疾病的診療，如根據(jù)相關(guān)機(jī)理開發(fā)新的靶向藥物，提供新的治療策略.