抗骨增生膠囊調(diào)控去卵巢骨質疏松癥大鼠骨代謝及氧化應激指標研究※

曹舒興 宋永周 李 明 馬 維 周 楠

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

女性絕經(jīng)后由于卵巢功能衰退，雌激素分泌減少，從而使骨吸收大于骨形成，最終導致絕經(jīng)后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1-2]。隨著對PMOP發(fā)病機制研究的不斷深入,氧化應激被認為是PMOP發(fā)生的最重要的始動因素之一[3-4]。中醫(yī)學認為，腎主骨生髓，腎精充足則骨髓充養(yǎng)，腎精虧則骨髓失養(yǎng)，骨骼無力，易致骨質疏松癥。中醫(yī)學對骨質疏松癥特別是PMOP的治療多以補腎為原則，獲得較好療效[5-6]。本研究通過摘除雙側卵巢建立PMOP模型，觀察抗骨增生膠囊對骨組織代謝、氧化應激等相關指標的影響，探討其防治PMOP的可能機制，為PMOP提供新的防治思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠40只，6月齡，體質量(320±20)g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供[動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]，實驗大鼠自由攝食、飲水，房間保持恒定溫度(25 ℃)和濕度(40%)。

1.1.2 藥品 抗骨增生膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z10980006)；雌二醇(美國Sigma公司)；注射用青霉素(華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020657)。

1.1.3 試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海歌凡生物科技有限公司)、骨保護素(OPG)試劑盒、血清Ⅰ型前膠原N端前肽(PⅠNP)試劑盒、核轉錄因子κB受體活化因子配體(RANKL)試劑盒、骨鈣素(BGP)試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗鼠多克隆抗體血紅素加氧酶-1(HO-1)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(美國Bioworld公司)；HO-1免疫組化試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.4 儀器 DEXA雙能X線骨密度測定儀(美國GE公司)、Bond-Max全自動免疫組化染色機(德國Leica公司)、DM750顯微鏡(德國Leica公司)、SIGMA300掃描電鏡(德國蔡司公司)、TDL-50B低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、DNM-9602全自動酶標儀(北京普朗新技術有限公司)、EXAKT 300CP微距切片機(德國Exakt公司)、Image-Pro Plus(MEDIA CYBERNETICS圖像技術公司)。

1.2 分組、造模及給藥

1.2.1 分級及造模 將40只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、雌激素組、抗骨增生膠囊組，每組10只。各組大鼠分別以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，除空白對照組外均施行雙側卵巢摘除法[8]；空白對照組不切除卵巢，僅切除卵巢周圍等量的脂肪組織。術后各組常規(guī)肌肉注射青霉素5萬U/d，持續(xù)抗感染治療3 d。

1.2.2 給藥 術后7 d對大鼠進行灌胃。給藥劑量按人與大鼠體表面積比值計算[7-8]，抗骨增生膠囊組將抗骨增生膠囊藥粉0.48 g/kg溶于0.9%氯化鈉注射液1 mL制成懸濁液灌胃；雌激素組予雌二醇10 μg/kg溶于0.9%氯化鈉注射液1 mL灌胃；空白對照組、模型組均予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠每周稱體質量調(diào)整用藥劑量。灌胃均每日1次，持續(xù)12周。

1.3 觀察指標

1.3.1 骨密度(BMD) 灌胃結束后當日，各組大鼠予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，仰臥位，采用DEXA雙能X線骨密度儀，測量腰椎及雙側股骨BMD，測量3次取平均值。

1.3.2 血清學檢測 灌胃結束后第2 d，各組禁食水8 h，腹主動脈取血8 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清，-20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清骨代謝指標，包括BGP、PⅠNP、OPG、RANKL,比色法檢測氧化應激指標，包括MDA、CAT、SOD。

1.3.3 骨組織形態(tài)學觀察 采血后以頸椎脫臼法處死大鼠，處死后取各組左側股骨中段1 cm，4%多聚甲醛固定、脫蠟、包埋，沿股骨長軸切片，HE染色后，40倍光鏡下觀察骨組織形態(tài)變化。

1.3.4 免疫組化法檢測HO-1蛋白表達 取左側股骨標本，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)抗原修復，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性后，滴加HO-1抗體，濕箱內(nèi)4 ℃過夜。滴加二抗，DAB顯色后復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細胞漿有棕褐色顆粒沉著為陽性，采用圖像分析系統(tǒng)檢測平均光密度值(MOD)。

2 結 果

2.1 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較 見表1。

表1 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較

表1 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較

組 別n腰椎股骨空白對照組100.191 1±0.003 20.215 2±0.005 8模型組100.160 4±0.005 8*0.180 3±0.004 9*雌激素組100.188 9±0.005 6△0.208 0±0.007 0△抗骨增生膠囊組100.180 1±0.004 7△0.201 0±0.003 4*△

與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

由表1可見，與空白對照組比較，模型組腰椎、股骨BMD均降低(P<0.05)，抗骨增生膠囊組股骨BMD降低(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組腰椎、股骨BMD均升高(P<0.05)；抗骨增生膠囊組、雌激素組腰椎、股骨BMD組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 骨形態(tài)學觀察 光鏡下觀察，空白對照組骨小梁豐富密集，排列規(guī)則；模型組骨小梁數(shù)目減少，排列稀疏，寬度變窄，骨髓腔增大，脂肪細胞增多，部分骨小梁斷裂，說明造模成功；與模型組相比，雌激素組和抗骨增生膠囊組骨組織形態(tài)明顯改善，骨小梁數(shù)目增多，寬度增大。見封2，圖1。

2.3 各組大鼠骨代謝指標比較 見表2。

表2 各組大鼠骨代謝指標比較

由表2可見，與空白對照組比較，模型組血清BGP、PⅠNP均升高(P<0.05)，OPG降低(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組BGP、PⅠNP均降低(P<0.05)，OPG升高(P<0.05)；抗骨增生膠囊組、雌激素組BGP、PⅠNP、OPG組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組RANKL組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠氧化應激指標比較 見表3。

表3 各組大鼠氧化應激指標比較

由表3可見，與空白對照組比較，模型組CAT降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組CAT升高(P<0.05)，MDA降低(P<0.05)；抗骨增生膠囊組、雌激素組CAT、MDA組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組SOD組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠HO-1表達及HO-1 MOD比較 見表4，圖2。

表4 各組大鼠HO-1 MOD比較

由表4可見，與空白對照組比較，模型組HO-1 MOD升高(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組HO-1 MOD均降低(P<0.05)；雌激素組、抗骨增生膠囊組HO-1 MOD組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

HO-1蛋白主要表達于骨小梁周邊的成骨細胞、軟骨細胞和骨髓。與空白對照組相比，模型組可見大量HO-1蛋白表達，雌激素組和抗骨增生膠囊組僅可見少量的HO-1蛋白表達(見封2，圖2)。

3 討 論

PMOP是指婦女絕經(jīng)后因雌激素水平下降、卵巢功能逐漸衰退而導致人體內(nèi)骨的吸收大于骨的形成,進而出現(xiàn)以骨顯微結構破壞和全身骨量減少為基本特征的一種代謝性疾病。雌激素缺乏一直被認為是PMOP的核心機制，但最近的研究表明，氧化應激才是最根本機制[9]。氧化應激可抑制成骨細胞分化，誘導成骨細胞凋亡，刺激破骨細胞生長分化和骨吸收，從而導致骨質疏松癥，臨床主要表現(xiàn)為骨痛和骨折率增加。本課題組前期研究結果顯示，抗骨增生膠囊含藥血清可促進大鼠成骨細胞和骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化[10]。本研究旨在通過活體實驗觀察抗骨增生膠囊對去卵巢骨質疏松癥大鼠的治療作用，并探究其中可能涉及的機制。

PMOP屬中醫(yī)學“骨痿”范疇。腎藏精、主骨，絕經(jīng)后女性“天癸竭，地道不通”，腎陰精虧虛，日久遷延則耗損精髓，髓?？仗?，故足不任身，發(fā)為骨痿。年老體弱，體虛氣弱，氣機不利，日久氣虛無力推動血行脈中，必致血瘀；腎之陽氣不足，則血行無力，血脈不溫，脈寒流緩也可成瘀；腎之陰精不足，則精津虧少，血少而稠，血流黏滯而瘀。故PMOP病機多為腎虛血瘀，腎虛為本，血瘀為標。治宜補腎填精，兼活血化瘀。抗骨增生膠囊中熟地黃補血養(yǎng)陰，益精填髓；女貞予補益肝腎，清虛熱；肉蓯蓉補腎陽，益精血；狗脊補肝腎，強腰膝，祛風濕；骨碎補補腎強骨，續(xù)傷止痛；淫羊藿補腎陽，強筋骨，祛風濕；雞血藤、牛膝活血通絡止痛；萊菔子行氣消脹，補而不滯。諸藥合用，共奏補腰腎、強筋骨、活血止痛之功。

雙側性腺(卵巢)摘除來建立PMOP大鼠模型是世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國食品與藥物管理局(FDA)推薦的最佳模型。本研究選取6月齡大鼠建立模型，觀察各組大鼠腰椎、股骨BMD和骨組織形態(tài)，BMD表示骨強度，可用于診斷骨質疏松、評價藥物療效[11]，而觀察骨組織微形態(tài)可以直觀評價骨質的疏松狀況[12]。與空白對照組比較，模型組腰椎、股骨BMD明顯降低(P<0.05)，骨組織稀疏，骨小梁數(shù)量減少，提示本研究造模成功。與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組BMD明顯增高(P<0.05)，骨組織形態(tài)明顯改善，骨小梁數(shù)目增多，寬度增大，說明抗骨增生膠囊可增加骨量和骨密度，改善大鼠骨質疏松；雌激素組、抗骨增生膠囊組BMD組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明抗骨增生膠囊效果與雌激素相似。

骨代謝指標可反映骨的轉換狀況。BGP特異反映成骨細胞活動度[13]，研究發(fā)現(xiàn)PMOP患者體內(nèi)BGP明顯升高[14]。PⅠNP是反映骨形成的指標之一，其升高表示Ⅰ型膠原合成速率增快，代表骨轉換活躍，研究發(fā)現(xiàn)PMOP女性PⅠNP水平明顯升高[15]。RANKL是由破骨細胞產(chǎn)生，與核轉錄因子κB受體活化因子(RANK)結合而增加骨質吸收，OPG是RANKL的抑制劑，由雌激素刺激生成，故OPG/RANK/RANKL通路是雌激素參與調(diào)節(jié)骨生成和骨吸收的途徑之一，也是絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質疏松癥的機制之一[16]。絕經(jīng)后女性OPG水平下降，提示骨吸收增加而骨形成減少。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組血清BGP、PⅠNP升高(P<0.05)，OPG降低(P<0.05)，提示骨代謝呈現(xiàn)高轉換水平；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組BGP、PⅠNP均降低(P<0.05)，OPG升高(P<0.05)，說明抗骨增生膠囊可顯著提高OPG水平，促進骨形成，減少骨吸收，拮抗骨質疏松。雌激素組、抗骨增生膠囊組BGP、PⅠNP、OPG組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可見抗骨增生膠囊與雌激素療效相當。

MDA是氧化應激后脂質過氧化損傷的標志物，而SOD、CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，是評估氧化應激狀態(tài)的可靠指標。PMOP女性體內(nèi)性激素水平變化會改變大部分代謝活動，抗氧化應激水平顯著下降，氧自由基水平升高[17]。本研究結果顯示，與空白對照組相比，模型組CAT降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)，說明氧化應激可能在PMOP的發(fā)病中起著重要作用。而抗骨增生膠囊組和雌激素組血清CAT較模型組升高(P<0.05)，MDA降低(P<0.05)，且2組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明抗骨增生膠囊改善了去卵巢大鼠氧化應激損傷。

HO-1是一種細胞誘導型Ⅱ型酶，也是血紅素分解代謝過程中的限速酶，能夠促進一氧化碳、鐵和膽紅素的釋放，其反應產(chǎn)物涉及各種氧化誘導劑的防御，包括脂多糖、過氧化氫、缺氧等,其表達在鐵穩(wěn)態(tài)、抗氧化、骨吸收反應中起著重要的作用，是目前發(fā)現(xiàn)的最易被誘導的抗氧化應激的酶[18]。HO-1在正常狀態(tài)下呈低水平表達，而當某些刺激出現(xiàn)如細胞氧化還原狀態(tài)失衡，會誘使其表達上升，發(fā)揮其抗氧化應激能力，所以HO-1可反映氧化應激水平強弱。本研究結果表明，與空白對照組比較，模型組可見大量HO-1蛋白表達，HO-1 MOD升高(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊HO-1 MOD均降低(P<0.05)，僅可見少量的HO-1蛋白表達，且2組HO-1 MOD值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這說明抗骨增生膠囊和雌激素效果相同，可以改善去卵巢大鼠氧化應激損傷狀態(tài)。

綜上，本研究通過觀察抗骨增生膠囊對去卵巢骨質疏松大鼠一系列指標的改善，證實其能顯著增加去卵巢骨質疏松大鼠的骨密度，修復骨結構，降低骨組織的高轉換水平代謝，增加骨形成，減少骨吸收，從而改善骨質疏松。其可能有與雌激素相似的機制，包括降低破骨細胞活性，拮抗氧化應激，改善氧化應激損傷，抑制破骨細胞分化并促進成骨細胞分化。但究其更細化的機制，如究竟涉及何種具體信號通路而改善抗氧化因子的表達尚不清楚，本課題組將針對抗骨增生膠囊對深層具體通路的影響機制進一步探討。