高含固率木質(zhì)纖維素厭氧發(fā)酵物總DNA的4種提取方法比較

馬旭光，劉素君，江 滔，常佳麗，唐 瓊

(樂(lè)山師范學(xué)院 化學(xué)學(xué)院，四川 樂(lè)山 614000)

厭氧發(fā)酵技術(shù)因能將農(nóng)作物秸稈和禽畜糞便等農(nóng)業(yè)纖維質(zhì)固體廢棄物轉(zhuǎn)化為清潔能源生物天然氣(經(jīng)提純后使甲烷含量>95%的沼氣)而備受關(guān)注，同時(shí)對(duì)于推動(dòng)我國(guó)循環(huán)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[1-2]。厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的本質(zhì)是由水解、酸化、產(chǎn)乙酸細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌等多種微生物協(xié)同作用將復(fù)雜的大分子有機(jī)物逐步分解轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳的過(guò)程[3]。高含固率(發(fā)酵體系中固含物>10%)厭氧發(fā)酵技術(shù)較傳統(tǒng)的低含固率發(fā)酵技術(shù)具有容積產(chǎn)氣率高、沼液排放量小、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為糞秸高效產(chǎn)甲烷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-5]。

認(rèn)識(shí)厭氧發(fā)酵體系中功能性微生物群的構(gòu)成、生長(zhǎng)代謝規(guī)律及其生態(tài)生理學(xué)以達(dá)到定向調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程是該領(lǐng)域重要的研究方向之一[6-8]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是宏基因組技術(shù)在揭示生物多樣性領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，使得從DNA水平對(duì)不可培養(yǎng)的微生物種類進(jìn)行全面研究成為可能[9]。能否獲得高質(zhì)量的厭氧發(fā)酵物中微生物總DNA直接關(guān)系到分子技術(shù)分析結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性。

目前從土壤、腸道、堆肥、發(fā)酵床墊料、厭氧顆粒污泥、沼液等環(huán)境樣本中提取微生物總DNA的方法主要有十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)法，十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)法，SDS-CTAB結(jié)合法以及生物技術(shù)公司提供的試劑盒法[10-15]。筆者前期采用上述幾種方法提取高含固率(>10%)的牛糞和玉米秸稈混合厭氧發(fā)酵物中微生物總DNA，質(zhì)量均不高，導(dǎo)致在后續(xù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)中無(wú)法獲得理想目的條帶。究其原因，可能與高含固率木質(zhì)纖維素物料在厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的大量腐殖酸、酚類、糖類以及雜蛋白等不利于PCR擴(kuò)增的物質(zhì)有關(guān)[16]。另外，高含固率糞秸厭氧發(fā)酵物較廢水等液體厭氧發(fā)酵物具有質(zhì)地不均一、微生物濃度低、雜質(zhì)多等特點(diǎn)[17]，而且在厭氧發(fā)酵體系中木質(zhì)纖維素底物主要靠吸附在其上的細(xì)菌通過(guò)分泌胞內(nèi)酶來(lái)完成分解[18]，這些因素均會(huì)影響提取微生物總DNA的質(zhì)量。但目前還見(jiàn)專一性提取高含固率纖維質(zhì)厭氧發(fā)酵物中微生物總DNA方法的報(bào)道。

基于此，本研究針對(duì)該類樣本的特點(diǎn)，在前人研究基礎(chǔ)上，對(duì)傳統(tǒng)的SDS-CATB法進(jìn)行了改進(jìn)，提取不同高含固率糞秸厭氧發(fā)酵物的微生物總DNA，并與常規(guī)的SDS法，SDS-CATB法和淤泥試劑盒法進(jìn)行比較，通過(guò)定性分析DNA電泳條帶、特異片段PCR擴(kuò)增效果和定量分析DNA的純度和濃度，評(píng)價(jià)該方法的有效性和穩(wěn)定性，以期針對(duì)高含固率纖維質(zhì)厭氧發(fā)酵物建立一種高效、低成本的微生物總DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 樣本與前處理

樣本來(lái)源：提取總DNA的樣本為4種中溫(37℃±1℃)批次厭氧發(fā)酵6 d的纖維質(zhì)混合物：玉米秸稈和牛糞、油菜秸稈和牛糞、油菜秸稈和豬糞、油菜秸稈和雞糞，均取自實(shí)驗(yàn)室正常產(chǎn)甲烷的批次厭氧反應(yīng)器，含固率在12.3%～14.5%，其理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)樣品的理化性質(zhì)

樣本前處理方法：稱取2 g左右(準(zhǔn)確記錄重量)上述糞秸發(fā)酵物于無(wú)菌的10 mL離心管中，5000 rpm冷凍離心10 min，棄上清液后往沉淀加入3～5倍TE buffer(pH值8.0)緩沖液，混勻后-40℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容

先以玉米秸稈和牛糞混合發(fā)酵物(S1)為試驗(yàn)樣本，分別用試劑盒法,SDS法,SDS-CTAB法和改進(jìn)的SDS-CTAB法提取微生物總DNA，比較提取DNA的質(zhì)量和PCR擴(kuò)增效果，每個(gè)處理設(shè)3～4個(gè)重復(fù)；然后為了進(jìn)一步驗(yàn)證改進(jìn)SDS-CTAB法的有效性和穩(wěn)定性，分別取1 g左右油菜秸稈和牛糞(S2)、油菜秸稈和豬糞(S3)、油菜秸稈和雞糞(S3)的混合厭氧發(fā)酵物提取微生物總DNA進(jìn)行復(fù)證研究，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.1 試劑盒法

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的糞便總DNA提取試劑盒(離心柱型)，具體操作方法見(jiàn)說(shuō)明書。

1.2.2 SDS法

參照趙勇[19]等提取土壤微生物總DNA的方法。

1.2.3 SDS-CTAB法

參照劉云浩[13]等提取微生物發(fā)酵床墊料中微生物總DNA的方法。

1.2.4 改進(jìn)的SDS-CATB法

1.2.4.1 樣品表面微生物的洗脫方法

取上述-40℃保存的樣品于室溫融化后，加入2～3倍于提取物體積的林格氏液，渦旋混勻，5000 rpm離心10 min，棄上清液。反復(fù)以上步驟2～3次，離心的沉淀物用于下一步雜質(zhì)的去除。

1.2.4.2 腐殖酸和雜蛋白質(zhì)的去除方法

將1.2.4.1中獲得的沉淀物中加入2～3倍于提取物體積的洗滌液，渦旋混勻，5000 rpm離心10 min，棄上清液。反復(fù)以上步驟，直至上清液清澈透明后，離心的沉淀物用于下一步DNA的提取。

1.2.4.3 微生物細(xì)胞壁的裂解方法

將1.2.4.2中經(jīng)處理過(guò)的沉淀樣品中加入1～2倍體積的SDS裂解液，100 μL的蛋白酶K，100 μL的溶菌酶，150 μL的復(fù)合纖維素酶，200 μL的異硫氰酸胍(GuSCN)洗液，渦旋混勻后，65℃水浴45 min。

1.2.4.4 微生物總DNA的沉淀和純化方法

(1)將1.2.4.2中水浴后的樣品5000 rpm離心10 min，用移液槍轉(zhuǎn)移褐色上清液至10 mL滅菌離心管。

(2)根據(jù)轉(zhuǎn)移上清液的體積，加入0.2倍體積的3M醋酸鈉無(wú)菌溶液和1倍體積的10%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)-8000無(wú)菌溶液，-20℃下靜置30 min后，5000 prm離心10 min，棄上清液，留黃色沉淀。

(3)往留有黃色沉淀的離心管中加入1倍體積的CTAB裂解液，65℃水浴10 min后，迅速加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1)，上下顛倒，輕輕混勻，5000 rpm離心10 min。

(4)將1.2.4.3中的上清液一次性轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的5 mL離心管中，加入等體積的10%PEG-8000溶液，置于4℃冰箱中8 h，沉淀DNA。

(5)將1.2.4.4中的提取物12000 rpm 離心10 min，棄上清液后加入500 μL的70%冰乙醇洗滌沉淀后，12000 rpm 離心10 min后棄上清液。

(6)將上述步驟(5)中的沉淀物于超凈工作臺(tái)吹干后，加入100 μL無(wú)菌超純水溶解DNA，并保存于-40℃待后續(xù)分子生物學(xué)分析。

1.2.5 DNA定性檢測(cè)方法

配置1.2%的瓊脂糖凝膠，Goldview II核酸染料用量為瓊脂糖凝膠溶液體積的0.2‰，DNA的檢測(cè)量為5 μL，電泳緩沖液為1×TAE，電泳時(shí)間為20 min，100 V電壓，超純水脫色，在凝膠成像儀中于302 nm紫外線下檢測(cè)并采集電泳圖。

1.2.6 DNA純度和定量檢測(cè)方法

用紫外線分光光度計(jì)中檢測(cè)提取DNA的A260/A280，A260/A230和濃度值。

1.2.7 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增方法

提取DNA的細(xì)菌16S rRNA基因在PCR擴(kuò)增儀中完成，引物為357F-GC和517R，由北京六合通經(jīng)貿(mào)公司合成。引物357F-GC的序列為GC clamp-5’-CCTA CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，其中GC-clamp序列為5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGG GGCGGGGGCACGGGGGG-3’，引物517R的序列為5’-ATTACCGCGG CTGCTGG-3’[20]。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL(見(jiàn)表2)，DNA marker分子量為2000 bp，模板DNA的濃度為10 ng·μL-1(可根據(jù)提取DNA的濃度進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，25個(gè)熱循環(huán)(93℃變性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s)，最后72℃延伸5 min[21]。

表2 PCR反應(yīng)體系(50 μL)的組成 (μL)

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 試驗(yàn)試劑

(1)林格氏液：NaCl 9 g，KCl 0.12 g，CaCl20.24 g, NaHCO30.2 g，充分溶解后，定容至1L[22]。

(2)TE buffer(pH值8.0)：取5 mL 1 mol·L-1的Tris-HCl Buffer(pH值8.0)和1 mL 0.5 mol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸)(pH值8.0)用超純水定容至500 mL。

(3)洗滌液(pH值10)：取50 mL 1mol·L-1Tris-HCl，40 mL 0.5 mol·L-1EDTA，5.844 g NaCl和10 g PVP-40(聚乙酸吡絡(luò)烷酮)，用超純水溶解、定容至1 L。

(4)SDS裂解液：取50 mL 1mol·L-1Tris-HCl，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA，7.305 g NaCl，20 g SDS，10 g PVP-40，用超純水溶解，調(diào)pH值至8.0，定容至500 mL。

(5)GuSCN洗液(pH值6.4)：取10 mL 1mol·L-1Tris-HCl，59.08 g GuSCN，溶解調(diào)pH值至6.4，定容至100 mL。

(6)3 mol·L-1醋酸鈉(NaOAc)溶液(pH值5.0)：取123.045 g NaOAc溶于450 mL去離子水后，加25 mL 冰醋酸，充分?jǐn)嚢璨⒍ㄈ葜?00 mL。

(7)CTAB裂解液：取50 mL 1 mol·L-1Tris-HCl，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA，40.908 g NaCl，10 g CTAB，10 g PVP-40，充分溶解后定容至500 mL。

(8)10%PEG-8000溶液：取50 g PEG-8000，70.128 g NaCl，用超純水溶解、定容至1 L。

上述配置的試劑均需在121℃滅菌15 min，室溫保存。所用的分子生物學(xué)等級(jí)試劑Tris base，Na2EDTA·H2O，PVP-40，SDS，GuSCN和PEG-8000以及蛋白酶K(產(chǎn)品貨號(hào)：V900887)均購(gòu)自Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，溶菌酶(CAS：9001-63-2)和復(fù)合纖維素酶(CAS：9012-54-8)定制自深圳市思美泉生物科技有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純等級(jí)。

1.3.2 試驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)(JIDI-16R，廣州吉迪儀器有限公司)，超微量紫外分光光度計(jì)(MD2000D，Biofuture, Made in Britain)，電泳儀(DYY-8C，北京六一生物科技有限公司)，凝膠成像儀(新JY04S-3C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，16S rRNA PCR擴(kuò)增儀(ProFlex PCR System, Life technologies, Made in Singapore)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的總DNA純度和濃度

DNA的純度和濃度是評(píng)價(jià)提取樣本中總DNA質(zhì)量的重要指標(biāo)。一般而言，A260/A280表示DNA中蛋白質(zhì)的純度，該值越大，說(shuō)明蛋白質(zhì)的純度越高[12]；A260/A30表示DNA中腐殖酸的含量，該值越大，說(shuō)明腐殖酸污染越嚴(yán)重，對(duì)后續(xù)PCR反應(yīng)越不利[23]；DNA的濃度表示樣品中總DNA的得率，該值越大，說(shuō)明提取的DNA得率越高，在后續(xù)分析中更能客觀反應(yīng)樣品中的微生物多樣性[24-25]。不同方法提取玉米秸稈與牛糞混合厭氧發(fā)酵物中微生物總DNA的純度和濃度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同方法提取試驗(yàn)樣品中微生物總DNA的純度和濃度

由表3可知，4種方法獲得同一樣本中的總DNA純度和濃度有明顯差異。改進(jìn)SDS-CATB法提取的質(zhì)量最佳，A260/A280，A260/A230，濃度分別能達(dá)到1.8，1.7和114.5 ng·μL-1，均顯著(P<0.05)高于其他3種方法，說(shuō)明該方法提取的總DNA中蛋白質(zhì)純度最高，腐殖酸雜質(zhì)最少，DNA得率也最高。一般認(rèn)為，A260/280>1.7時(shí)，蛋白質(zhì)較純；A260/230>1.5時(shí)，腐殖酸雜質(zhì)含量不會(huì)影響后續(xù)PCR反應(yīng)[24]。糞便試劑盒法提取的A260/A280和A260/A230分別僅為1.16和0.74，說(shuō)明該方法不適合提取高含固纖維質(zhì)厭氧發(fā)酵物微生物總DNA。

改進(jìn)SDS-CTAB法能獲得高質(zhì)量DNA的原因可能與采用PVP-40洗液除雜有關(guān)。有研究表明，在緩沖液中加入適量的高分子螯合物PVP能絡(luò)合提取樣本中的多酚和萜類物質(zhì)，具有抗氧化作用，進(jìn)而有效防止多酚氧化為醌類物質(zhì)，以免提取液變成褐色而影響DNA的純度[26-27]。在本實(shí)驗(yàn)提取過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)未使用洗滌液的糞便試劑盒法、SDS法和SDS-CTAB法獲得的DNA有不同程度發(fā)黃，說(shuō)明在破壁前采用PVP-40洗液對(duì)去除樣本中多酚、萜類和腐殖酸等雜質(zhì)起到了關(guān)鍵作用。另外，改進(jìn)SDS-CTAB法有較高DNA得率的原因可能與采用林格氏液洗脫和多種酶破壁充分釋放細(xì)胞中DNA有關(guān)。

2.2 不同提取方法的總DNA和PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳效果

4種方法提取的總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)圖1。由圖1可知，4種方法提取樣品總DNA電泳檢測(cè)結(jié)果有明顯不同。改進(jìn)SDS-CTAB法(12～15泳道)獲得總DNA的電泳條帶單一明亮、干凈齊整，無(wú)明顯DNA降解現(xiàn)象，而其他3種方法的條帶均存在不同程度的拖尾和彌散現(xiàn)象，其中試劑盒法(1～4泳道)和SDS法(5～8泳道)尤為嚴(yán)重，說(shuō)明在提取該樣品總DNA時(shí)有大量DNA斷裂碎片產(chǎn)生，難以獲得完整的DNA。另外，糞便試劑盒法的條帶亮度明顯低于其他3中方法，這是由于試劑盒法由于受離心管容量的限制樣本承載量為0.5 g左右，僅為其他3種手提法的1/4，且使用了純化柱純化DNA，可能導(dǎo)致總DNA的損失[24]。DNA瓊脂糖電泳定性分析結(jié)果與表2中超微量紫外分光光度計(jì)定量分析結(jié)果相吻合。

注：泳道1～4為糞便試劑盒法；5～8為SDS法；9～11為SDS-CTAB法；12～15為改進(jìn)SDS-CTAB法。

4種方法提取總DNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)圖2。由圖2可知，改進(jìn)SDS-CTAB法獲得的目的條帶(1～3泳道)清晰、明亮，SDS-CTAB法雖然也檢測(cè)到了擴(kuò)增目的條帶(4～6泳道)，但僅隱約可見(jiàn)，清晰度低；而SDS法(7～9泳道)和試劑盒法(10～12泳道)均未檢測(cè)到目的條帶。由于4種方法提取的總DNA濃度均能滿足PCR模板DNA適宜的濃度范圍(5～10 ng·μL-1)。由此推測(cè)，能否獲得PCR擴(kuò)增目的條帶與DNA的質(zhì)量密切相關(guān)。由表3可知，糞便試劑盒法和SDS法的A260/A280和A260/A230均較低，說(shuō)明DNA中較低的蛋白質(zhì)純度和較高的腐殖酸含量等雜質(zhì)抑制了PCR反應(yīng)。

注：M為DL 2000分子量的marker；泳道1～3為改進(jìn)SDS-CTAB法；4～6為SDS-CTAB法；7～9為SDS法；10～12糞便試劑盒法。

2.3 改進(jìn)SDS-CTAB法提取不同樣品的總DNA純度和濃度

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)SDS-CTAB法提取高含固率木質(zhì)纖維素厭氧發(fā)酵物料總DNA質(zhì)量最高，能獲得理想的PCR擴(kuò)增目的條帶，但與商業(yè)試劑盒法相比，樣本承載量較高(2 g左右)，在前期洗脫和除雜階段所耗時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致日提取樣本數(shù)量有限。為此，將該方法樣本承載量降低至1 g左右，洗脫液和洗滌液添加量均提高至提取物體積的5倍，提取3種木質(zhì)纖維素厭氧發(fā)酵物樣本(油菜秸稈+牛糞、油菜秸稈+豬糞、油菜秸稈+雞糞)總DNA，其純度和濃度結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 改進(jìn)SDS-CTAB法提取不同厭氧發(fā)酵物中微生物總DNA的純度和濃度

由表4可知，改進(jìn)SDS-CTAB法提取不同樣品獲得的總DNA質(zhì)量均較高，A260/A280和A260/A230均分別大于1.70和1.60，說(shuō)明蛋白質(zhì)純度較高，腐殖酸含量較少；總DNA的濃度均大于50 ng·μL-1，DNA得率也均較高。另外，在提取DNA過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)減少樣本承載量，可有效縮短前期洗脫和洗滌時(shí)間，進(jìn)而提高了該方法的日提取樣本數(shù)量。

2.4 改進(jìn)SDS-CTAB法提取不同樣本的總DNA和PCR產(chǎn)物電泳效果

改進(jìn)SDS-CTAB法提取3種不同樣本總DNA的瓊脂凝膠電泳和PCR產(chǎn)物電泳定性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，不同樣本總DNA的電泳條帶均單一整齊、干凈明亮，DNA均較完整，未見(jiàn)明顯的斷裂和降解；獲得的PCR產(chǎn)物目的條帶清晰齊整，能滿足微生物多樣性的后續(xù)分析要求。由此表明，針對(duì)不同高含固率木質(zhì)纖維素厭氧發(fā)酵物，采用本研究提出的改進(jìn)SDS-CTAB法提取的總DNA均純度高、雜質(zhì)少，性能穩(wěn)定可靠，適合進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

注：圖3中的1～3為油菜秸稈+牛糞，4～6為油菜秸稈+豬糞，7～9為油菜秸稈+雞糞。

注：圖4中M為DL 2000分子量的marker；泳道編號(hào)代表的樣本與圖3相同。

3 討論

影響環(huán)境樣本微生物總DNA提取質(zhì)量的因素較多，尤其是如何有效去除樣本中的殘?jiān)?、多糖、酚類、色素和腐殖酸等雜質(zhì)對(duì)獲得高質(zhì)量的DNA至關(guān)重要[11,23,26]。目前通常采用先富集微生物(細(xì)胞)再破壁和先破壁再離心以及化學(xué)試劑沉淀分離DNA兩種方法。Tang[23]等使用CTAB法提取糞便中微生物DNA時(shí)采用先除雜、富集微生物然后用破壁的方法，除雜效果較高且提高了DNA得率；陳競(jìng)[15]等也采用類似的方法獲得了得率和質(zhì)量均較高的羊糞沼液中的微生物總DNA。先破壁再純化的提取策略雖能提高DNA得率但因除雜能力有限會(huì)影響提取的質(zhì)量[27]，因此該方法更適用于微生物濃度較高、雜質(zhì)較少的樣本。鑒于高含固率木質(zhì)纖維素物料具有微生物濃度低、雜質(zhì)多以及木質(zhì)纖維素表面吸附有大量細(xì)菌群的特點(diǎn)，本研究采用先富集微生物(細(xì)胞)再破壁的提取方案，先用中性的林格氏液洗脫吸附在物料表面的微生物，以達(dá)到富集的目的，然后采用PVP-40洗滌除雜，以達(dá)到除雜的目的。研究表明，高分子螯合劑PVP能絡(luò)合樣本中的多酚、萜類物質(zhì)，以及能有效防止多酚物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)而使提取變成黃色[13]；高鹽溶液能降低腐殖酸和多糖對(duì)DNA的干擾[12]，PEG8000也能有效減少腐殖酸和雜蛋白對(duì)DNA的污染[13]。由此可知，本研究在后續(xù)提取步驟中使用的10% PEG8000,醋酸鈉溶液和CTAB裂解液也起到了一定除雜作用。

另外，大量研究表明微生物細(xì)胞破壁方法也對(duì)DNA的得率和質(zhì)量有明顯影響[13-15]。目前通常采用物理法(凍融和機(jī)械震蕩等)、化學(xué)法(SDS裂解液)和生物法(溶菌酶、蛋白酶等)裂解細(xì)胞壁，一般在實(shí)際操作中為了提高DNA得率綜合使用上述幾種破壁方法。溫洪宇[28]等的優(yōu)化結(jié)果表明，凍融和SDS法聯(lián)合破壁最適合提取乳品廢水活性污泥，張琳[29]等等在提取厭氧發(fā)酵活性污泥時(shí)認(rèn)為溶菌酶等生物法的破壁獲得的DNA片段長(zhǎng)，能提高DNA得率和PCR擴(kuò)增效率。鑒于本研究采用的樣品木質(zhì)纖維素厭氧發(fā)酵物存在大量細(xì)胞壁較厚且致密緊實(shí)的革蘭氏陽(yáng)性(G+)微生物，故采用了以生物法(裂解液、蛋白酶K、溶菌酶和復(fù)合纖維素酶)為主和化學(xué)法SDS為輔聯(lián)合裂解破壁的措施并取得理想的DNA提取效果。

綜上所述，在選用微生物DNA提取方法時(shí)不能一概而論，而應(yīng)在分析提取樣本的特性基礎(chǔ)上，有針對(duì)性地選擇或改進(jìn)現(xiàn)有的方法，以達(dá)到理想的提取效果。高含固率木質(zhì)纖維素厭氧發(fā)酵物與廢水厭氧活性污泥、好氧發(fā)酵物以及土壤和腸道微生物等環(huán)境樣本相比有其自身特殊性，難以用上述樣本成熟的提取DNA方法。本研究針對(duì)影響DNA提取質(zhì)量的關(guān)鍵步驟提出了改進(jìn)SDS-CTAB法，通過(guò)林格氏液洗脫和PVP-40洗滌液除雜以及裂解液和多種生物酶聯(lián)合破壁等系列方法，獲得了質(zhì)量較高的高含固率木質(zhì)纖維素素厭氧發(fā)酵物總DNA。盡管手提法與商業(yè)試劑盒法相比，各提取步驟所使用的試劑成分明確且成本較低，但手提法日提取樣本量較少，不便于批量化和標(biāo)準(zhǔn)化操作。因此，今后針對(duì)本研究針對(duì)上述關(guān)鍵步驟，還需從樣本承載量、主要試劑的用量及其對(duì)微生物多樣性的影響等方面進(jìn)一步優(yōu)化以達(dá)到該方法標(biāo)準(zhǔn)化、商業(yè)化應(yīng)用的目的。

4 結(jié)論

(1)針對(duì)不同的高含固率木質(zhì)纖維素厭氧發(fā)酵物，改進(jìn)SDS-CTAB法提取的微生物總DNA的A260/A280和A260/A230值能分別達(dá)到1.70和1.60以上，每克樣本的DNA濃度能達(dá)到50 ng·μL-1以上，蛋白質(zhì)純度高、雜質(zhì)少，穩(wěn)定性好。

(2)改進(jìn)SDS-CATB法的微生物總DNA電泳條帶單一齊整、清晰明亮，獲得的PCR擴(kuò)增目的條帶清晰度高，適宜后續(xù)利用分子生物技術(shù)進(jìn)一步分析微生物多樣性及其代謝功能。

(3)林格氏液洗脫，PVP-40洗滌液除雜以及裂解液和多種酶聯(lián)合破壁是改進(jìn)SDS-CTAB法獲得高質(zhì)量微生物總DNA的關(guān)鍵步驟。