廢水中Hg2+快速檢測試紙條研制

鐵文利，王 莉，李春光，彭趙旭

(1.鄭州大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，河南鄭州 450001；2.鄭州航空工業(yè)管理學(xué)院環(huán)境功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450015)

汞作為一種全球性污染物，具有高毒性、高遷移性、不可降解性、生物富集性和食物鏈放大性等特性[1]。目前檢測Hg2+的主要方法有：原子吸收法[2]、原子熒光光譜法[3]、高效液相色譜法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[4 - 6]等。近年來，出現(xiàn)了很多檢測Hg2+的新方法，如以各種熒光物質(zhì)[7]、金納米粒子[8]、有機(jī)分子[9]、DNA酶[10]等為基礎(chǔ)的傳感器方法。這些方法靈敏度較高，但是存在預(yù)處理復(fù)雜、費(fèi)時和易受其他金屬離子影響等缺點(diǎn)。因此，探索一種簡便、靈敏且快速的Hg2+檢測方法迫在眉睫。

DNA適配體具有親和力大、特異性強(qiáng)、制備方便、易于合成和長期保存等優(yōu)勢，可以和小分子物質(zhì)、藥物、蛋白質(zhì)、抗生素等不同的靶標(biāo)進(jìn)行高特異性和高親和力的結(jié)合[11 - 13]。CeO2是一種重要的稀土氧化物，它具有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、磷酸酶、過氧化物酶和氧化酶等模擬酶活性[14 - 16]，具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其在水體污染物降解處理和檢測方面?zhèn)涫荜P(guān)注。但目前還未見到將CeO2應(yīng)用于Hg2+快速檢測的相關(guān)研究。

本研究利用納米CeO2和DNA適配體，構(gòu)建了一種新型的Hg2+檢測技術(shù)。方法檢測原理如圖1所示。CeO2材料具有生物酶性質(zhì)，它能將四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液氧化為藍(lán)色產(chǎn)物。適配子溶液中的Tris可以促進(jìn)核酸的溶解，牛血清白蛋白(BSA)可以保護(hù)偶聯(lián)物以降低非特異性識別，復(fù)溶液則可以促進(jìn)偶聯(lián)物穩(wěn)定結(jié)合和增加標(biāo)記物與膜的親水作用，避免顯色條內(nèi)出現(xiàn)中空，同時其中含有的MgSO4可以促進(jìn)待測物與適配子核酸片段的結(jié)合。在配制好的Hg2+DNA適配體溶液中加入納米CeO2材料，該材料與DNA適配體結(jié)合，使材料發(fā)生鈍化，此時若向溶液中加入TMB，溶液將顯無色；當(dāng)向溶液中加入含Hg2+的溶液，Hg2+DNA適配體與Hg2+結(jié)合，釋放出CeO2，與TMB反應(yīng)重新顯藍(lán)色。構(gòu)建的方法具有操作簡單、反應(yīng)快速、靈敏度高等特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中有較大潛力。

圖1 試紙條檢測原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the detection principle of strip

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

通過Empyrean型X射線衍射儀(XRD，荷蘭PANalytical公司)對樣品的物質(zhì)組成和內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析檢測。通過JSM-IT100型掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子株式會社)觀察樣品的表面形貌。LRH系列生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；TGL-18C高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ 3200B超聲波清洗器(昆山市國華電器有限公司)；DHG -9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；85-2磁力加熱攪拌器(常州普天儀器制造有限公司)。

Tris-HCl、Ce(NO3)3·6H2O、聚乙二醇20000(PEG20000)、牛血清白蛋白(BSA)、吐溫-20(Tween-20)(翊圣生物)；L-天冬酰胺(源葉生物)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB顯色液)(博特森生物)；鏈酶親和素(>95%，北京索萊寶科技有限公司)；硝酸纖維素膜(NC膜)(JY BIOTECH)；Hg2+DNA適配體、Probe1 Hg2+(金唯智生物科技有限公司)；HgCl2(姜堰市環(huán)球試劑廠)。磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)：稱取0.0675 g KH2PO4、0.895 g Na2HPO4·H2O、2.0 g NaCl和0.5 g KCl，用超純水配制成250 mL溶液，濃度為0.01 mol/L。適配子溶解液：在0.6057 g Tris、0.819 g NaCl和9.522 mg MgCl2中加入少量超純水，溶解后加入42 mL 0.9%稀HCl，定容至1 000 mL。偶聯(lián)物復(fù)溶液：將5 g蔗糖、0.5 g PEG20000、1 g BSA和0.5 g Tween-20溶于超純水，定容至1 000 mL。鏈酶親和素溶液:鏈酶親和素干粉中加入1 mL PBS，得到1 mg/mL的鏈酶親和素溶液。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 納米CeO2的制備

本文采用水熱法制備中空球狀納米CeO2材料。將1.17 g Ce(NO3)3·6H2O，4.50 g KBrO3和1.20 g L-天冬酰胺充分溶解。將上述溶液倒入聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，于140 ℃的烘箱中反應(yīng)24 h，將生成物轉(zhuǎn)移至20 mL的離心管中，用超純水和無水乙醇交替反復(fù)洗滌干凈后，置于恒溫培養(yǎng)箱中65 ℃恒溫干燥12 h，即得到納米CeO2材料。

1.3 檢測線和質(zhì)控線溶液的制備

試紙條上用于檢測Hg2+的指示線即為檢測線。Hg2+DNA適配體干粉用高速離心機(jī)離心(5 000 r/min) 5 min后，加入40 μL 適配子溶解液和偶聯(lián)物復(fù)溶液，振蕩10 min使其充分溶解。移取40 μL上述溶液于1.5 mL離心管內(nèi)，并加入40 μL鏈酶親和素溶液，搖勻后將溶液在4 ℃條件下靜置2 h。加入20 μL PBS(0.01 mol/L)，并加入定量的納米CeO2材料，在4 ℃條件下靜置12 h，得到檢測線溶液。質(zhì)控線溶液同檢測線的制備方法一樣，但所用的DNA適配體是不具有專一選擇性的Probe1 Hg2+適配體，即質(zhì)控線對溶液中的Hg2+不能專一檢測，用以對比檢測線的顏色變化。

1.4 實(shí)驗(yàn)操作

(1)NC膜的處理:將NC膜修剪成均勻的長條狀，在恒溫干燥箱中于37 ℃下干燥1 h后，在1%的BSA中培育30 min，用pH=8.8四硼酸鈉緩沖溶液洗滌至少3次，再將試紙條在37 ℃下干燥3 h。

(2)劃線:分別將質(zhì)控線和檢測線溶液吸入移液槍中，均勻劃線于NC膜上，于37 ℃干燥箱內(nèi)烘干30 min。

(3)顯色:將NC膜在1 μg/mL的Hg2+溶液中完全浸潤后，烘干10 min。滴加TMB顯色液于質(zhì)控線和檢測線，避光顯色60 s左右，記錄質(zhì)控線和檢測線的顏色變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 CeO2材料的制備與表征

對制備的納米CeO2進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)檢測，如圖2所示。制備的納米CeO2材料為中空球狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的材料比表面積大，吸附能力強(qiáng)，有利于接觸和吸附待測物質(zhì)。最終制得的淡黃色物質(zhì)，即是所要制備的中空球狀納米CeO2材料。采用水熱法制得的納米CeO2具有純度高、粒徑小且分布均勻等特性，產(chǎn)率可穩(wěn)定在75%左右。

圖2 納米CeO2材料樣品的掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM image of nano -cerium oxide samples

對納米CeO2材料進(jìn)行X射線衍射(XRD)分析，如圖3所示?？梢钥吹?，制備的CeO2在2θ=28.57°、33.63°、47.23°、56.89°有四個明顯的特征峰，與PDF標(biāo)準(zhǔn)卡相對照，這四個峰的鋒形尖銳，峰強(qiáng)度較大，結(jié)晶度較好，可見制備的納米CeO2較好，純度較高。

圖3 納米CeO2材料的X射線衍射(XRD)分析Fig.3 XRD analysis of nano -cerium oxide samples

2.2 納米CeO2材料酶活性分析檢測

稱取三份50 mg納米CeO2材料，分別置于A、B、C三個1.5 mL離心管內(nèi)，移取1.5 mL、1 mL、1 mL超純水分別加入離心管A、B、C內(nèi)。搖勻后，再向B、C內(nèi)各加入0.5 mL的TMB顯色液，然后避光靜置一段時間后，觀察離心管中溶液顏色。這時，再向C管中滴入一滴稀H2SO4，觀察離心管C中的溶液顏色變化。

向B、C離心管內(nèi)加入TMB顯色液后可觀察到，離心管B、C中溶液均變藍(lán)。向C管中滴入一滴稀H2SO4，觀察到離心管C中的溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色，如圖4所示?？芍緦?shí)驗(yàn)制得的納米CeO2材料具有生物模擬酶活性，從而使CeO2與TMB顯色液顯藍(lán)色；又由于H2SO4終止液的加入，一方面破壞了納米CeO2酶的活性，使酶的催化功能喪失；另一方面溶液pH降低，藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使反應(yīng)終止顯黃色。

圖4 納米CeO2材料酶活性分析檢測結(jié)果Fig.4 Results of enzyme activity analysis of nano -cerium oxide samples

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 CeO2濃度的選擇配制5組CeO2濃度為4 mg/mL、7 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL的質(zhì)控線和檢測線溶液，按照顯色條件進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)CeO2濃度為10 mg/mL時，檢測線和質(zhì)控線顏色就比較明顯，如圖5所示。即選用CeO2溶液濃度為10 mg/L為最優(yōu)濃度。

圖5 納米CeO2濃度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of nano -cerium oxide concentration

2.3.2 DNA適配體濃度的選擇配制Probe1 Hg2+濃度為100 μmol/L的質(zhì)控線溶液，和Hg2+DNA適配體濃度為25、50、75、100 μmol/L的四組檢測線溶液，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。從圖6可見，當(dāng)Hg2+DNA適配體濃度為25 μmol/L時顯色效果最好，因此選用Hg2+DNA適配體濃度為25 μmol/L。

圖6 DNA適配體濃度的優(yōu)化Fig.6 Optimization of DNA aptamers concentration

2.4 試紙條的專一性實(shí)驗(yàn)

配制最適濃度的檢測線溶液和質(zhì)控線溶液，與Cd2+、Ni2+、Cr3+干擾離子溶液進(jìn)行專一性實(shí)驗(yàn)。同時配制20倍量的干擾離子溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并測其吸光度。試紙條專一性實(shí)驗(yàn)顯色結(jié)果如圖7所示，檢測Cd2+、Ni2+、Cr3+的試紙條中的檢測線不顯色，而質(zhì)控線因不具有專一性而顯色。說明這幾種離子不能與Hg2+DNA適配體特異性結(jié)合，從而不能釋放納米CeO2與TMB發(fā)生反應(yīng)，且干擾允許量不低于20倍量。證明納米CeO2材料制作的試紙條檢測Hg2+具有專一性。

圖7 試紙條專一性試驗(yàn)Fig.7 Specificity of the strip

將測得的吸光度繪出條形圖。由圖8可分析，檢測到Hg2+的一組吸光度數(shù)值遠(yuǎn)大于其它金屬離子，驗(yàn)證該檢測技術(shù)對Hg2+的專一性較好。

圖8 專一性檢測驗(yàn)證Fig.8 Specificity verification of the strip

3 結(jié)論

(1)采用水熱法制備出中空球狀的納米CeO2材料，并用TMB顯色液對納米CeO2材料的生物酶活性進(jìn)行了檢測分析，檢測出所制得的納米CeO2材料具有生物酶活性；(2)納米CeO2材料和Hg2+DNA適配體制作的試紙條可用來檢測廢水中的Hg2+，且在納米CeO2材料的濃度為10 mg/mL，Hg2+DNA適配體的濃度為25 μmol/L時檢測效果最佳；(3)通過試紙條對水中Cd2+、Ni2+、Cr3+的檢測和吸光度分析，得出利用納米CeO2材料和Hg2+DNA適配體制作出的試紙條對水中Hg2+的檢測具有專一性；(4)試紙條在檢測過程中顏色梯度不夠明顯，反應(yīng)顏色保持時間短。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，繼續(xù)研究更多鈰基材料的合成與性能，找出Hg2+試紙條最佳的研制方法，以實(shí)現(xiàn)在實(shí)際中的應(yīng)用。