中蜂和意蜂對巨桉葉片揮發(fā)物的EAG和行為反應(yīng)

熊朝勇張如義林雄

(1.內(nèi)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川內(nèi)江 641000；2.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川內(nèi)江 641000)

自然界中植物揮發(fā)性次生物質(zhì)所產(chǎn)生的特異性氣味是專一性的特殊標(biāo)記，容易被特定昆蟲識別，昆蟲可通過它來尋找到食物源[1]。植物揮發(fā)性次生物質(zhì)一方面可以吸引傳粉者，另一方面是植物本身釋放防御物質(zhì)，可以起到排斥一些非寄主性昆蟲的作用[2]。昆蟲是通過自身觸角上的化感器來感受植物揮發(fā)性次生物質(zhì)，觸角電位技術(shù)(electroantennogram，簡稱EAG)是鑒別植物揮發(fā)性次生物質(zhì)對昆蟲有無影響的常規(guī)技術(shù)之一，測定的是昆蟲觸角全部化感器對刺激物電生理反應(yīng)的總和[3]。

蜜蜂是自然界中顯花植物的主要授粉昆蟲之一，而采集行為則是蜜蜂生存的重要條件，其靈敏的嗅覺可以有效識別分辨蜜源的信息，而且不同種蜜蜂的采集習(xí)性也存在較大的差異性[4-5]。例如，中華蜜蜂Apis cerana cerana和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(以下分別簡稱為中蜂和意蜂)是我國普遍飼養(yǎng)蜜蜂的主要亞種[6]。中華蜜蜂又被稱為中蜂、土蜂，是我國獨有的本土優(yōu)良蜜蜂，通常生活在以雜木林為主的森林群落和傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)群落中[7]。從1896年開始，我國引進以意蜂為主的西方優(yōu)良蜜蜂[8]，目前，意蜂已廣泛分布于全國(西藏自治區(qū)除外)，其密度在大多數(shù)地區(qū)超過原有中蜂，導(dǎo)致我國中蜂分布區(qū)域急劇減少[9]。意蜂在自然界中一般善于利用較大規(guī)模的蜜源，中蜂更能有效利用一些零星蜜源，但意蜂采集植物的種類范圍小于中蜂[10-11]。

巨桉Eucalyptus grandis作為桃金娘科Myrtaceae桉屬Eucalyptus常綠高大喬木，原產(chǎn)澳大利亞東部沿海地區(qū)，因其適應(yīng)性廣、萌芽力強、喜光耐旱、抗逆性好、繁殖容易、病蟲害少而被巴西、加拿大、中國等國家引種營造商品林、用材林、經(jīng)濟林等[12]。大量研究表明桉屬許多樹種的枝葉、枯落物及其林下表土的水溶性揮發(fā)物質(zhì)能抑制其它動物、植物以及微生物的正常生長[13]，進而影響人工混交林的生態(tài)系統(tǒng)營造[14]。如檸檬桉Eucalyptus citriodora葉中

揮發(fā)性化感物質(zhì)能抑制蘿卜、玉米等農(nóng)作物種子萌發(fā)[15]；巨桉凋落葉分解初期釋放的化感物質(zhì)能損害受體植物小白菜的光反應(yīng)系統(tǒng)進而抑制小白菜的生長[16]。在我國廣東、海南、廣西、福建、四川和江西等南方地區(qū)，巨桉已作為重要的人工用材林樹種和優(yōu)良的蜜源植物大面積推廣種植，但帶來巨大經(jīng)濟效益的同時，也反應(yīng)出系列生態(tài)環(huán)境問題(水分、養(yǎng)分、生物多樣性等)[17]，逐漸成為我國林業(yè)以及環(huán)境保護等科研人員關(guān)注的焦點。筆者通過研究中華蜜蜂和意大利蜜蜂對巨桉鮮葉和凋落葉揮發(fā)性提取物的EAG和嗅覺行為反應(yīng)，探索巨桉揮發(fā)物對傳粉昆蟲的訪花行為是否有趨避作用，以利于深入了解巨桉對蜜蜂的行為影響，為巨桉人工林可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)多樣性保護提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂 試驗用中蜂和意蜂來自四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中蜂和意蜂養(yǎng)殖場(N 29°37′，E 105°1′)，平均海拔320 m。室內(nèi)試驗均在內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物實驗室進行；中蜂和意蜂分別放入20 cm×20 cm×20 cm的紗網(wǎng)中，在室內(nèi)自然條件下饑餓處理24 h，待其狀態(tài)穩(wěn)定后備用。

1.2 揮發(fā)性提取物 巨桉葉片樣品采自四川省內(nèi)江市東興區(qū)、市中區(qū)標(biāo)準(zhǔn)地的10 a生巨桉林。參照楊樺等[18]的研究方法，用采樣袋分別采集巨桉凋落葉和新鮮葉各 12，24，36，48 g；用大氣采樣器以0.5 L/min的空氣流速，動態(tài)吸附采集1 h，然后用5 mL正己烷洗脫，氮氣吹濃縮至2 mL，即為不同質(zhì)量葉片的揮發(fā)性提取物樣品。

1.3 中蜂和意蜂觸角電位反應(yīng)測定 用觸角電位儀(荷蘭Syntech公司生產(chǎn)，并提供測定所用相關(guān)軟件)測定中蜂和意蜂對巨桉葉片揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)。測試時用鋒利刀片切下中蜂和意蜂觸角，用SpectraR 360導(dǎo)電膠將觸角固定在PR(Gain10×)電極上，氣味管與觸角相距1 cm，劑量反應(yīng)測試時取10 μL提取物樣品，均勻滴在折成“V”字型的濾紙條(2 cm×0.5 cm)上，放入10 cm長的樣品管中，樣品管末端連接氣體刺激控制裝置[19]；先用正己烷測試，測試時巨桉凋落葉和新鮮葉揮發(fā)物樣品的檢測次序是隨機的，同類葉片樣品按揮發(fā)物含量自低向高進行檢測，待基線穩(wěn)定后給予刺激，刺激時間為0.5 s，兩次刺激間隔為60 s，以保證觸角感受能夠完全恢復(fù)，每處理測試中蜂、意蜂觸角各6根，每樣品平均刺激5次，兩次刺激的中間需用凈化空氣吹2 min，以減少氣味分子在觸角附近堆積，防止適應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生[19]；以正己烷作為對照，將每一樣品觀測值的平均值除以前后2次對照測定的平均值即得EAG反應(yīng)相對值[19]。

1.4 嗅覺行為反應(yīng)的測定 中蜂和意蜂對巨桉葉片揮發(fā)物的嗅覺趨向行為測定參照王紅偉等[19]方法?！癥”型嗅覺儀由主臂長 6.0 cm、側(cè)臂長6.0 cm、側(cè)臂夾角45°、內(nèi)徑0.5 cm的透明玻璃制成，在側(cè)臂距基部10 cm處伸出2個樣品室；嗅覺儀主臂與大氣采樣儀(QC-1B型)連接，側(cè)臂分別通過硅膠管與樣品室相連接[19]；在氣流進入樣品室之前，先經(jīng)過一個活性炭過濾器和裝有蒸餾水的特氏多孔濾瓶，主臂空氣流速調(diào)節(jié)為0.5 L/min左右，以凈化空氣和增加空氣濕度[19]。測定時，以4 cm2濾紙作氣味源載體，每次吸取10 μL的揮發(fā)物樣品溶液在濾紙上作為氣味源，以正己烷作對照[19]，從“Y”型嗅覺儀主臂管口引入待測中蜂和意蜂，中蜂和意蜂在“Y”型管分叉處做出選擇，趨向不同的側(cè)臂，每只觀察3 min，爬過側(cè)臂1/3且停留30 s以上記為對該揮發(fā)性氣味物質(zhì)有選擇，反之記為對該氣味無選擇[19]，試驗重復(fù)3次，每次測試中蜂、意蜂各30只，每測5只調(diào)換1次“Y”型管兩臂的位置，每次重復(fù)后更換濾紙條，并用無水乙醇擦洗管的內(nèi)、外壁，烘干后再測，以消除管臂位置和揮發(fā)物質(zhì)殘留對中蜂和意蜂行為可能產(chǎn)生的影響[19]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS 15.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Excel 2003繪圖，利用配對T檢驗比較中蜂、意蜂之間對不同處理巨桉葉片揮發(fā)物的EAG反應(yīng)及行為反應(yīng)差異；采用χ2法檢驗行為生測數(shù)據(jù)的單選試驗差異性，計算引誘率、驅(qū)避率及反應(yīng)率。

引誘率(%)＝處理壁內(nèi)總蜂數(shù)/測試總蜂數(shù)×100；驅(qū)避率(%)＝對照壁內(nèi)總蜂數(shù)/測試總蜂數(shù)×100；反應(yīng)率(%)＝(對照壁內(nèi)總蜂數(shù)＋處理壁內(nèi)總蜂數(shù))/測試總蜂數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 中蜂和意蜂對巨桉葉片揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

2.1.1 中蜂和意蜂對不同質(zhì)量葉片提取的揮發(fā)物EAG 反應(yīng) 不同質(zhì)量(12，24，36，48 g)鮮葉、凋落葉提取的揮發(fā)物均能引起中蜂和意蜂觸角的EAG反應(yīng)，且中蜂和意蜂對不同含量提取物的EAG反應(yīng)顯著差異(P＜0.05)(圖1)。隨著凋落葉和鮮葉質(zhì)量的增加，中蜂和意蜂觸角對其揮發(fā)性提取物的EAG反應(yīng)強度呈增加趨勢；鮮葉質(zhì)量為36 g時，中蜂和意蜂對其提取的揮發(fā)物的EAG反應(yīng)值達到最高，當(dāng)鮮葉質(zhì)量提高到48 g時，中蜂和意蜂對其提取的揮發(fā)物的EAG反應(yīng)有下降的趨勢；而凋落葉質(zhì)量48 g時，中蜂和意蜂對其提取的揮發(fā)物的EAG反應(yīng)達到最大值。

圖1 意蜂和中蜂對凋落葉和鮮葉提取揮發(fā)物的EAG反應(yīng)Fig.1 EAG response of A.mellifera ligustica and A.cerana cerana to volatiles from fallen and fresh leaves

2.1.2 中蜂和意蜂對相同質(zhì)量鮮葉、凋落葉的揮發(fā)物EAG反應(yīng) 相同質(zhì)量(36 g)鮮葉、凋落葉提取的揮發(fā)物均能引起中蜂和意蜂產(chǎn)生不同程度的EAG反應(yīng)。通過利用配對T檢驗表明，中蜂和意蜂之間對鮮葉的揮發(fā)性提取物反應(yīng)差異達到顯著(P＝0.030＜0.05)，而中蜂和意蜂之間對相同質(zhì)量(36 g)凋落葉的揮發(fā)性提取物反應(yīng)差異均不顯著(P＝0.921＞0.05)。意蜂對36 g鮮葉提取的揮發(fā)物觸角電位反應(yīng)值較同質(zhì)量凋落葉的高12.11%，中蜂對36 g鮮葉提取的揮發(fā)物物觸角電位反應(yīng)值較同質(zhì)量凋落葉的高18.32%；說明中蜂和意蜂對鮮葉中揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對更強(表1)。

表1 中蜂和意蜂對36 g葉片揮發(fā)物的EAG反應(yīng)Tab.1 EAG responses of A.cerana cerana and A.mellifera ligustica to volatiles from 36 g leaves of E.grandis

2.2 中蜂和意蜂對巨桉葉片揮發(fā)物的行為反應(yīng)

2.2.1 中蜂和意蜂對相同質(zhì)量葉片提取的揮發(fā)物行為反應(yīng) 配對T檢驗結(jié)果表明，中蜂和意蜂之間對36 g巨桉鮮葉提取的揮發(fā)物的引誘率均差異不顯著(P＝0.529＞0.05)，中蜂和意蜂之間對36 g巨桉凋落葉提取的揮發(fā)物的引誘率差異也不顯著(P＝0.899＞0.05)。但相比之下，鮮葉提取的揮發(fā)物對中蜂和意蜂的引誘率均高于凋落葉的，如36 g鮮葉提取的揮發(fā)物對中蜂的引誘率較凋落葉的高15.07%，對意蜂的引誘率較凋落葉的高25.14%。綜上，相同質(zhì)量(36 g)巨桉鮮葉提取揮發(fā)物對中蜂的引誘率值最高，而凋落葉提取的揮發(fā)物對中蜂引誘率值最低(表2)。

表2 巨桉36 g葉片提取的揮發(fā)物對中蜂和意蜂引誘率的比較Tab.2 Attaction rate of volatiles from 36 g E.grandis leaves to A.cerana cerana and A.mellifera ligustica

2.2.2 中蜂和意蜂對不同質(zhì)量葉片提取的揮發(fā)物行為反應(yīng) 通過測定中蜂、意蜂對揮發(fā)物的行為反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)中蜂和意蜂對不同質(zhì)量(12，24，36，48 g)鮮葉和凋落葉提取的揮發(fā)物均有反應(yīng)，且各處理提取物均表現(xiàn)出不同程度的引誘作用，生物測定結(jié)果與EAG反應(yīng)結(jié)果基本一致(表3)。當(dāng)味源為36 g鮮葉提取的揮發(fā)物時，揮發(fā)物對中蜂引誘率最高，當(dāng)鮮葉高于或低于36 g時，其提取揮發(fā)物定向作用不明顯；當(dāng)味源為凋落葉提取的揮發(fā)物時，隨揮發(fā)物含量升高，對中蜂的引誘率增大。通過卡方檢驗表明，在鮮葉為36 g時，其提取的揮發(fā)物對中蜂的引誘率差異達到顯著(P＜0.05)，反應(yīng)率為86.0%；在凋落葉48 g時，其提取的揮發(fā)物對中蜂的引誘率差異顯著(P＜0.05)，反應(yīng)率達86.5%。在味源為36 g鮮葉提取的揮發(fā)物時，其對意蜂引誘率達62.6%，差異顯著(P＜0.05)，反應(yīng)率較高，達85.3%；而48 g凋落葉提取的揮發(fā)物，對意蜂的引誘率為62.2%，差異顯著(P＜0.05)，反應(yīng)率為88.8%。

表3 中蜂和意蜂對不同質(zhì)量巨桉葉片提取的揮發(fā)物行為反應(yīng)Tab.3 Behavioral responses of A.cerana cerana and A.mellifera ligustica to volatiles from different mass of leaves of E.grandis

3 結(jié)論與討論

植物揮發(fā)物作為植物產(chǎn)生的次生化學(xué)物質(zhì)，是由植物表面和葉片組織中釋放的揮發(fā)性化合物質(zhì)。很多昆蟲對寄主植物的識別是依據(jù)植物釋放的特異性揮發(fā)物的化學(xué)指紋圖，它們利用特異性揮發(fā)物作為寄主定位的線索[20]。畢擁國等[21]研究發(fā)現(xiàn)一些植物的揮發(fā)性氣體能夠引起天牛明顯的行為反應(yīng)；同時，植物揮發(fā)性氣體還可以調(diào)控昆蟲取食、產(chǎn)卵及交配等行為[22-23]。本研究中，發(fā)現(xiàn)巨桉鮮葉、凋落葉提取的揮發(fā)物均可引起中蜂和意蜂觸角不同程度的EAG反應(yīng)，且差異顯著，表明巨桉鮮葉和凋落葉中所含揮發(fā)物的比例和含量存在差異。當(dāng)鮮葉提取的揮發(fā)物升高到一定含量時，EAG反應(yīng)值增加不顯著甚至有所降低，說明鮮葉揮發(fā)物測試含量達到中蜂和意蜂的飽和閾限。36 g巨桉鮮葉提取的揮發(fā)物引起中蜂和意蜂的EAG反應(yīng)相對強烈，而48 g巨桉凋落葉提取的揮發(fā)物引起中蜂和意蜂的EAG反應(yīng)值最大。綜上比較可知，巨桉鮮葉揮發(fā)物對中蜂和意蜂的EAG反應(yīng)相對高于凋落葉，這說明葉片內(nèi)化感物質(zhì)的含量隨葉片老朽曬干的過程而逐漸降低[24]。

所測定的巨桉鮮葉、凋落葉揮發(fā)物均能引起中蜂和意蜂嗅覺行為反應(yīng)，并具不同程度的引誘作用。36 g巨桉鮮葉提取的揮發(fā)物對中蜂和意蜂的引誘率均達到最高，巨桉鮮葉高于或低于36 g時，其提取的揮發(fā)物定向作用不明顯；表明各種昆蟲對揮發(fā)物的反應(yīng)都有一個最佳的含量范圍，一般低于此范圍時，反應(yīng)率隨含量的增加逐漸升高，高于時，反應(yīng)率隨含量增加而下降[25]；隨著巨桉凋落葉揮發(fā)物含量的升高，對中蜂和意蜂的引誘率也增大，48 g巨桉凋落葉提取的揮發(fā)物對中蜂和意蜂有明顯的引誘作用。生物測定結(jié)果與EAG反應(yīng)結(jié)果基本一致。

綜上所述，中蜂和意蜂對巨桉鮮葉提取的揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對凋落葉更強，且在嗅覺行為反應(yīng)中表現(xiàn)出更好的引誘效果。以此可看出，巨桉鮮葉和凋落葉揮發(fā)性提取物中均含有某種吸引中蜂、意蜂的物質(zhì)，而鮮葉中含量更高，這也是巨桉影響中蜂、意蜂訪花行為的原因之一。本試驗中，僅研究了中蜂和意蜂對巨桉葉片揮發(fā)物的電生理反應(yīng)和嗅覺行為反應(yīng)，而巨桉葉片揮發(fā)物是否對巨桉林中其他植物的授粉存在影響還有待更多的研究探索。