遮陰和氮素梯度處理對芒萁光合生理的影響

金 迪，張明如，王佳佳，侯 平

(1.浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江杭州311300；2.浙江農(nóng)林大學風景園林與建筑學院，浙江杭州311300)

光照和氮素是植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子。光照強度的變化會影響植物的生長速率、生理特性和表觀形態(tài)特征等[1]，氮素的獲取直接影響器官間的營養(yǎng)分配，對葉綠素含量、光合關(guān)鍵酶活性等產(chǎn)生影響[2]。氮素對植物光合生理的影響具有一定的閾值效應[3]，適量添加氮素能提高植物的凈光合速率和光化學效率[4]，促進植株生長和拓殖[5]。

芒萁[Dicranopteris dichotoma(Thunb.)Berhn.]是我國亞熱帶低山丘陵區(qū)退化植被的 “標志種”[6]，能夠適應從肥沃到瘠薄多種土壤條件[7]。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，芒萁可密集生長于土壤相對肥沃的馬尾松(Pinus massoniana Lamb.)、杉木[Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.]等單優(yōu)群落下層及林緣，并形成單優(yōu)草本層片[8-9]，亦可定居于土壤貧瘠的全光地段或水土流失的紅壤侵蝕區(qū)[10]，自然分布于多種類型的生境，表明芒萁能適應多種光照強度和土壤條件。芒萁單優(yōu)草本層片連續(xù)密集生長于多種退化群落下層生境，將同時產(chǎn)生系列生態(tài)問題:森林群落針闊葉樹種種子發(fā)芽和幼苗生長困難，枯草期易引發(fā)地表火進而誘發(fā)林冠火。因此，芒萁單優(yōu)草本層片屬于阻礙疏灌草叢和馬尾松單優(yōu)群落步入進展演替的關(guān)鍵層片。為研究森林植被退化和恢復過程中的光照強度和土壤氮素含量變化對芒萁光合生理的影響，以盆栽芒萁為研究材料，設置遮陰與氮素雙因素控制試驗，模擬暖性針葉單優(yōu)群落下層弱光與土壤較肥沃，到林緣、灌草叢光照較強與土壤較貧瘠等不同生境，測定盆栽芒萁光合生理參數(shù)和葉綠素熒光動力學參數(shù)，比較芒萁對遮陰和氮素梯度處理的光合生理響應特征，分析芒萁的光照強度與氮素雙因素組合處理的適應特點，研究結(jié)果對于調(diào)控芒萁單優(yōu)草本層片過度發(fā)育、促進森林群落的進展演替，具有一定的生態(tài)理論價值和林業(yè)生產(chǎn)實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗地位于浙江農(nóng)林大學東湖校區(qū)，北緯30°15′28″，東經(jīng)119°43′35″，全年降水量1 628.6 mm，年平均氣溫16.4℃，全年無霜期約237 d。2019年5月，在浙江省杭州市臨安區(qū)玲瓏山，北緯30°13′05″，東經(jīng)119°40′23″，海拔200 m處，選取長勢良好且高度基本一致的芒萁幼苗120株[株高(11.7±1.8)cm]，栽植于40 cm×21 cm×17 cm的長方形花盆內(nèi)，每盆定植1株，栽培基質(zhì)為黃壤，土壤全氮含量為1.07 g·kg-1。設置3個不同光照強度的遮陰大棚，分別為輕度遮陰(L1，透光率35.96%)、中度遮陰(L2，透光率13.00%)和高度遮陰(L3，透光率4.75%)。將芒萁幼苗放置于L2條件下緩苗，兩個月后將成活的盆栽芒萁隨機分成12組，每組10盆，移至不同遮陰強度的大棚內(nèi)。根據(jù)前人對草本植物的研究[11-12]，綜合調(diào)整盆栽芒萁氮素處理量，在每個遮陰處理下設置1個對照(不施氮)和3個梯度氮素處理，分別為不施氮(N0)、低氮(N1)、中氮(N2)和高氮(N3)。N1、N2和N3三個處理每盆芒萁每次施氮量分別為0.1、0.2和0.3 g(以純氮含量計)，共施放3次，間隔10 d。將對應氮含量的硫酸銨分析純?nèi)芙庥?00 mL純水，均勻噴入盆內(nèi)土壤表面，不施氮處理組噴入等量純水。處理90 d后，選取長勢一致的功能葉片，測定其光合參數(shù)和葉綠素熒光參數(shù)，并測定光合色素含量。

1.2 測定方法

1.2.1 光響應進程的測定 處理90 d后，用Li-6400XT光合儀于晴天上午8:30—11:30，測定芒萁葉片光響應進程。將待測葉片置于飽和光(1 500μmol·m-2·s-1)下照射30 min，使葉片充分適應。設定光照強度依次為2 000、1 500、1 200、1 000、800、500、300、100、50、30、10和0μmol·m-2·s-1，測定凈光合速率(net photosynthesis rate，Pn)、氣孔導度(stomatal conductance，Gs)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr)和胞間CO2濃度(inter-cellular CO2concentration，Ci)。每個處理選擇3盆芒萁，每盆重復打點3次，計算平均值。利用光合助手(Photosynth Assistant)對Pn-光響應曲線進行擬合[13]，計算光補償點(light compensation point，LCP)、光飽和點(light saturation point，LSP)、表觀量子效率(apparent quantum efficiency，AQY)、最大凈光合速率(Pnmax)和暗呼吸速率(dark respiration rate，Rd)。

1.2.2 葉綠素熒光誘導動力學曲線的繪制 利用便攜式動態(tài)熒光儀YZQ-500，測定不同處理下芒萁成熟葉片的葉綠素熒光動力學曲線(O-J-I-P曲線)，測定前將待測芒萁暗處理40 min，每個處理測3盆，每盆重復測定3次。從O-J-I-P曲線上可以直接得到熒光強度(fluorescence intensity，F(xiàn)):初始熒光FO＝F50μs； J點熒光 FJ＝F2ms； I點熒光 FI＝F30ms； P 點熒光 FP＝Fmax。 計算得到以下參數(shù)[14]:J點相對可變熒光(relatively variable fluorescence at point J，VJ)、初始斜率(initial slope，MO)、最大光化學效率(maximum photochemical efficiency，φPo)、電子傳遞效率(electron transfer efficiency，ψO)、電子傳遞量子產(chǎn)額(quantum yield of electron transport，φEo)、熱耗散量子比率(quantum yield of dissipation，φDo)、光合性能指數(shù)(performance index，IP)。

1.2.3 光合色素含量的測定 采用乙醇浸提法測定光合色素含量[15]，稱取0.2 g新鮮成熟芒萁葉片，剪成0.2 cm左右寬的小塊，置于試管中，加入體積分數(shù)95%的乙醇10 mL，室溫下置暗處浸提至葉組織完全變白，將葉綠體色素提取液倒入光徑1 cm的比色杯內(nèi)，用UV-2550型紫外分光光度計在665、649和470 nm的波長下測定吸光度，并計算光合色素含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(least significant difference，LSD)進行顯著性檢驗和多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮陰和氮素梯度處理對芒萁光響應曲線的影響

遮陰和氮素梯度處理下芒萁的光響應曲線變化如圖1～圖4所示。從圖1可以看出，L1處理下，芒萁的Pn大小為N2＞N1＞N3＞N0，當光合有效輻射(photosynthetically active radiation，PAR)大于300μmol·m-2·s-1時，N2的Pn上升幅度較大，當PAR為1 000μmol·m-2·s-1時，N2的Pn較N0上升37.9%；L2處理下，芒萁的Pn大小為N2＞N1＞N0＞N3，PAR大于100μmol·m-2·s-1后，N3的Pn增速開始減緩，在PAR為1 000μmol·m-2·s-1時，N3的Pn較N0下降18.3%；L3處理下，芒萁的Pn大小為N0＞N2＞N3＞N1，3種施氮量均對芒萁的Pn產(chǎn)生負面影響。

圖1 遮陰和氮素梯度處理對芒萁凈光合速率的影響Figure 1 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on the net photosynthesis rate of D.dichotoma

遮陰和氮素梯度處理對芒萁胞間CO2濃度的影響如圖2所示，當PAR小于300μmol·m-2·s-1時，芒萁的Ci下降迅速，而后趨緩，與Pn變化呈負相關(guān)。L1處理下，Ci大小為N1＞N3＞N0＞N2；L2處理下，芒萁Ci的變化受施氮影響較??；L3處理下，Ci的大小為 N3＞N2＞N1＞N0，即芒萁Ci隨施氮量增大而上升。

遮陰和氮素梯度處理對芒萁Gs的影響如圖3所示，L1處理下，芒萁的Gs大小為N2＞N1＞N3＞N0，N2顯著提升了芒萁的Gs(P＜0.05)，當PAR為1 500μmol·m-2·s-1時，N2的Gs較N0上升57.3%，施氮有助于芒萁打開氣孔，從而促進Pn升高。L2處理下，芒萁的Gs均低于L1處理，且各施氮處理間的變化差異較小。L3處理下，芒萁的Gs大小為N2＞N3＞N0＞N1，當PAR為2 000μmol·m-2·s-1時，N2和N3的Gs較接近，約為N0的1.4倍，N1為N0的85.5%。

遮陰和氮素梯度處理對芒萁Tr的影響如圖4所示，L1處理下，芒萁的Tr大小為N2＞N3＞N1＞N0，其中N2和N3明顯高于N0。L2處理下，芒萁的Tr大小為N1＞N2＞N0＞N3。L3處理下，芒萁的Tr大小為N2＞N3＞N0＞N1，其中N2和N3相近，N0和N1相近。Tr的變化主要受Gs影響。

圖2 遮陰和氮素梯度處理對芒萁胞間CO2濃度的影響Figure 2 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on the inter-cellular CO2 concentration of D.dichotoma

圖3 遮陰和氮素梯度處理對芒萁氣孔導度的影響Figure 3 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on the stomatal conductance of D.dichotoma

圖4 遮陰和氮素梯度處理對芒萁蒸騰速率的影響Figure 4 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on the transpiration rate of D.dichotoma

2.2 遮陰和氮素梯度處理對芒萁光合特征參數(shù)的影響

表1為遮陰和氮素梯度處理下芒萁的光合特征參數(shù)。L1處理下，芒萁LSP和Pnmax的大小順序為N2＞N1＞N3＞N0，LCP和Rd則在N2出現(xiàn)最小值；與N0相比，N1和N2的AQY上升，而N3的AQY則下降；N0的Rd顯著高于其他處理(P＜0.05)，為1.43μmol·m-2·s-1，說明較高光照強度下芒萁消耗碳水化合物較多，而施氮可以有效降低芒萁的Rd。L2處理下，芒萁的LSP隨施氮量增加而增大，AQY和Pnmax則在N2出現(xiàn)最大值，LCP和Rd在N2出現(xiàn)最小值；Rd總體較低，施氮對耐蔭性的影響不大。L3處理下，施氮降低了芒萁的LSP，但差異不顯著(P＞0.05)；N1的LCP、Pnmax和Rd均為各處理中的最低值；N3處理則顯著降低了芒萁的AQY(P＜0.05)，同時LCP和Rd顯著增大(P＞0.05)，分別是N0的1.60和1.67倍。在遮陰處理間，芒萁的LSP和Pnmax隨光照強度減弱而降低，L2的AQY最高，Rd最低。

表1 遮陰和氮素梯度處理對芒萁光合特征參數(shù)的影響Table 1 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on the photosynthetic parameters of D.dichotoma

2.3 遮陰和氮素梯度處理對芒萁光合色素含量的影響

表2為遮陰和氮素梯度處理下芒萁的光合色素含量。L1處理下，芒萁葉片的葉綠素a(chlorophyll a，Chl a)、葉綠素b(chlorophyll b，Chl b)和總?cè)~綠素(total chlorophyll，Ct)含量均隨施氮量增加而上升，但差異不顯著(P＞0.05)，同時類胡蘿卜素(carotenoid，Car)含量、葉綠素a與葉綠素b的比值(ratio of chlorophyll a and b，Chl a/Chl b)在各施氮處理間變化較小。L2處理下，芒萁葉片的Chl a、Chl b和Ct含量均在N2出現(xiàn)最大值，Car含量和Chl a/Chl b在各施氮處理間變化較小。L3處理下，N3與N0在Chl a、Chl b、Ct和Car的含量差異均達到顯著水平(P＜0.05)；施氮導致Chl a/Chl b下降。隨遮陰程度提高，各氮素處理下芒萁的Chl a和Ct含量均顯著增加(P＜0.05)；L1和L2各處理的Car含量變化不明顯，L3的Car含量則顯著高于L1和L2(P＜0.05)；Chl a/Chl b呈現(xiàn)下降趨勢，N3處理下降低幅度最大，L3分別比L1和L2低33.7%和28.6%。

表2 遮陰和氮素梯度處理對芒萁光合色素含量的影響Table 2 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on the photosynthetic pigment content of D.dichotoma

2.4 遮陰和氮素梯度處理對芒萁葉綠素熒光誘導參數(shù)的影響

2.4.1 遮陰和氮素梯度處理對芒萁葉綠素熒光誘導曲線的影響 遮陰和氮素梯度處理下芒萁的葉綠素熒光誘導曲線如圖5所示。不同處理下，芒萁葉片的葉綠素熒光誘導曲線均具有O、J、I、P的典型特征位點，隨遮陰程度提高，F(xiàn)呈上升趨勢。L1處理下，各施氮處理的F大小變化為N1＞N3＞N2＞N0，可知施氮處理后芒萁葉片獲得更大的熒光產(chǎn)量。L2處理下，各施氮處理的F在I點后趨同，F(xiàn)P的差異僅為3.88%。L3處理下，芒萁F大小為N0＞N3＞N2＞N1，N0從O點開始F高于其他處理，施氮影響了芒萁光系統(tǒng)Ⅱ(photosynthetic systemⅡ，PSⅡ)反應中心受體側(cè)原初醌受體(primary quinone，QA)的積累。

圖5 遮陰和氮素梯度處理對芒萁葉綠素熒光誘導曲線的影響Figure 5 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on chlorophyll fluorescence induction curve of D.dichotoma

2.4.2 遮陰和氮素梯度處理對芒萁VJ、MO和電子傳遞量子產(chǎn)額的影響 表3為遮陰和氮素梯度處理對芒萁VJ、MO和電子傳遞量子產(chǎn)額的影響，VJ反映照光2 ms時PSⅡ的活性反應中心關(guān)閉的程度。L1處理下，N0的VJ最高，N2和N3處理顯著降低了VJ(P＜0.05)，施氮有利于芒萁PSⅡ的反應中心保持活性。L2和L3處理下，VJ的最小值分別出現(xiàn)在N2和N1，但氮梯度間差異不顯著(P＞0.05)。MO代表QA被還原的最大速率，L1和L2處理下，N2處理顯著降低了芒萁的MO(P＜0.05)，此時芒萁的光合反應中心較為活躍；L3N0的MO在各處理中最高，說明該處理下PSⅡ向下游電子傳遞鏈傳遞電子的能力降低。φPo、ψO和φEo反映PSⅡ受體側(cè)的變化，L1處理下，N0的φPo最低，N2和N3處理顯著提高了芒萁的φPo(P＜0.05)，施氮增強了芒萁PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換能力。L2處理下，φPo差異不顯著(P＞0.05)。L3處理下，N1和N2的φPo顯著高于N0(P＜0.05)。L1N0的ψO和φEo最小，反應中心吸收的光能用于電子傳遞的份額較低。隨遮陰程度提高，芒萁葉片的ψO先升高后降低。L1N0的φDo在所有處理中最高，芒萁葉片啟動了光防御機制，施氮或提高遮陰度均能使芒萁更高效地利用光能。

表3 遮陰和氮素梯度處理對芒萁J點相對可變熒光、初始斜率和電子傳遞量子產(chǎn)額的影響Table 3 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on V J， M O， and yields of flux ratios in leaves of D.dichotoma

2.4.3 遮陰和氮素梯度處理對芒萁光合性能指數(shù)的影響 圖6為遮陰和氮素梯度處理對芒萁IP的影響。L1處理下，N2和N3處理芒萁IP顯著高于N0(P＜0.05)，分別為N0的2.07和1.98倍。L2處理下，IP的差異減小，且與N0相比，但N3的IP出現(xiàn)下降，N2仍有顯著提高(P＜0.05)，且為所有處理的最高值，達到1.78。L3的IP相較L2有所下降，且施氮對芒萁PSⅡ活性的促進作用未達顯著水平(P＞0.05)。N0、N1和N2三種氮素條件下，隨遮陰程度提高，芒萁PSⅡ活性先增強后減弱；N3條件下，芒萁的IP隨光照強度減弱而下降。

3 討論與結(jié)論

圖6 遮陰和氮素梯度處理對芒萁光合性能指數(shù)的影響Figure 6 Effects of shading and nitrogen concentration gradient on performance index of leaves of D.dichotoma

不同遮陰條件下，施氮對芒萁的光響應進程產(chǎn)生不同程度的影響。L1處理下，施氮增加了芒萁的Pn、Gs和Tr，以N2處理的促進作用最明顯。L2處理下，N3的情況與L1不同，隨PAR增大，Ci下降幅度最小，且Pn、Gs和Tr均小于 N0。L3處理下，N1和N3處理的芒萁Pn下降，弱光環(huán)境施氮會對芒萁光利用能力產(chǎn)生負面作用。植物的LSP和LCP是衡量植物光利用能力的重要指標，AQY代表植物的耐蔭性[16]。芒萁的LSP在852.8～1 121.6μmol·m-2·s-1的范圍內(nèi)變化，LCP在6.0～30.0μmol·m-2·s-1的范圍內(nèi)變化，與前期研究結(jié)果相近[12，17]。L1處理下，N2條件對芒萁LSP、AQY和Pnmax的提升最明顯，同時使LCP和Rd降低幅度最大，拓寬了芒萁的光照強度生態(tài)幅。L2處理下，N2條件同樣屬于芒萁適宜的土壤肥力條件，與L1N2相比，LSP和Pnmax降低，即強光利用能力稍弱；LCP和Rd顯著降低，有利于芒萁在光照強度減弱后維持生長[18]，保持較好的碳平衡[19]以積累光合產(chǎn)物。L3處理下，N1增強了芒萁的耐蔭性，LCP和Rd為各處理中最低，但同時降低了芒萁的光合潛能，Pnmax為各處理中最低；N3處理的LCP和Rd大幅上升，AQY明顯下降，說明芒萁耐蔭性下降，可能需要更充足的光照維持光合作用。

3種施氮強度處理下，芒萁的Chl a、Chl b和Ct含量均隨遮陰程度的提高而增大，弱光生境中芒萁羽葉需要更多葉綠素以捕獲更多的光能。Chl a/Chl b隨遮陰程度的提高而降低，高度遮陰顯著提高了Car含量，芒萁葉片增強了對藍紫光的吸收能力，以此適應弱光環(huán)境[20]；施氮對葉綠素含量的提高有一定促進作用，輕度和中度遮陰下葉綠素含量的提高都有助于芒萁Pn的增大。

葉綠素熒光動力學分析能夠反映植物光系統(tǒng)內(nèi)部的調(diào)節(jié)過程[21]。L1N0的芒萁熒光強度最低，較強光照下芒萁會出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象[22]。施氮處理有效緩解L1處理下芒萁的光抑制，但會降低L3處理下芒萁的熒光強度。未施氮條件下，L1的VJ和φDo最大，φPo、ψO和φEo最小，芒萁光保護能力較弱[23]，反應中心吸收的光能較多用來還原QA，PSⅡ向下游傳遞電子的能力降低[24]；芒萁葉片以熱能形式耗散過剩激發(fā)，從而避免強光傷害。各遮陰條件下，施氮均可降低芒萁的VJ、MO和φDo，利于反應中心數(shù)目和活性的增加，同時提高芒萁的φPo、ψO和φEo，即促進PSⅡ電子傳遞能力和最大光化學效率，優(yōu)化能量分配和利用效率[25]，其中，輕度和中度遮陰下中氮作用最明顯，高度遮陰下低氮最佳。IP綜合反映光系統(tǒng)活性，相較φPo對環(huán)境因子變化的響應更敏感[26]，L2N2的IP在各處理中最高，即PSⅡ活性最高；施氮后只有L2N3的IP下降，說明中度遮陰下高氮使芒萁PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能受到傷害[27]。

綜上所述，輕度遮陰條件下，芒萁受到一定的光抑制，此時施氮能有效緩解芒萁的光抑制以及提高芒萁的PSⅡ活性，輕度遮陰與中氮處理組合下芒萁的光照強度生態(tài)幅最寬，光合潛力最高。中度遮陰條件下，芒萁的暗呼吸速率較低，施氮優(yōu)化了芒萁PSⅡ的能量利用效率，中度遮陰與中氮組合處理是最適宜芒萁積累光合產(chǎn)物、PSⅡ活性最高。高度遮陰條件下，施氮引起芒萁凈光合速率和葉綠素熒光強度下降，芒萁需要更多光能維持生長。