香蕉細菌性枯萎病菌熒光LAMP檢測體系的建立

楊雷亮，管 維，孫麗霞，吳穎兒，單振菊，王章根，陳定虎

（1. 中山海關(guān)技術(shù)中心，廣東 中山 528403; 2. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400）

【研究意義】香蕉為芭蕉科芭蕉屬植物，全年可收獲，是熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟作物之一，也是世界鮮果貿(mào)易量最大的水果。香蕉細菌性枯萎病是由青枯菌Ralstonia solanacearum2號小種侵染香蕉所引起的毀滅性土傳真菌病害，是香蕉生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一［1-3］。由于該病防治困難，因此對該病菌的分子生物學(xué)早期檢測在生產(chǎn)上的意義重大，一種快速簡便、準確靈敏的檢驗檢疫方法自然是目前迫切被需要?！厩叭搜芯窟M展】目前檢測鑒定該病菌的方法主要包括形態(tài)鑒定、生理生化型鑒定，分子生物學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定分為PCR法、熒光PCR法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法等；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-meadiated isothermal amplification, LAMP）技術(shù)是指利用2對針對目標基因設(shè)計特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，恒溫條件下高效擴增基因的新技術(shù)［4-9］。目前，LAMP技術(shù)在檢測細菌［10-18］、動植物病毒［19-22］、寄生蟲［23］，真菌［24-26］、轉(zhuǎn)基因食品［27-28］、食物源成分［29-30］、生物工程［31］等領(lǐng)域均有應(yīng)用，發(fā)展前景非常樂觀。針對香蕉真菌性枯萎病菌已有熒光PCR檢測方法［32］和LAMP檢測方法［33］的報道，而對香蕉細菌性枯萎病的定性檢測，我國學(xué)者還是圍繞在如何讓該病病原菌目標基因成功擴增或者對其特異性基因信號進行放大開展研究工作。漆艷香等根據(jù)香蕉細菌性枯萎病菌16SrDNA的保守區(qū)序列，在基因擴增片段區(qū)間應(yīng)用引物和探針設(shè)計軟件設(shè)計實時熒光PCR引物，再在引物對基因的擴增區(qū)間內(nèi)找出具有穩(wěn)定性的點突變區(qū)設(shè)計特異性探針，建立了對香蕉細菌性枯萎病菌的實時熒光PCR檢測方法［34］。王念武等根據(jù)該菌的特異插入序列ISRso19設(shè)計了滾環(huán)擴增的鎖式探針，并對超分支滾環(huán)擴增的反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了靈敏度極高的香蕉細菌性枯萎病菌超分支滾環(huán)擴增技術(shù)。該檢測技術(shù)能從相似的9種病原菌中特異性地檢測出香蕉細菌性枯萎病菌，對DNA的檢測的最低濃度為500 fg/μL，遠高于普通PCR的靈敏度［35］。目前未見關(guān)于LAMP檢測應(yīng)用于香蕉細菌性枯萎病菌的報道?！颈狙芯壳腥朦c】實時熒光LAMP技術(shù)是使用實時熒光擴增裝置實時監(jiān)測LAMP擴增產(chǎn)物并進行分析的方法，該方法比普通LAMP方法更為靈敏可靠，采用了不必在反應(yīng)完開蓋檢測的方法，使反應(yīng)產(chǎn)物不易被污染。早期檢測中需要解決樣品所含低含量及重干擾病菌組織的難題，而實時熒光LAMP能比較好地解決這一問題?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本實驗擬建立該病菌的熒光LAMP檢測體系，設(shè)計香蕉細菌性枯萎病菌的LAMP引物；以DNA為模板，在不同屬內(nèi)及其近似種間進行引物的特異性、靈敏度和重復(fù)性驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原菌 香蕉細菌性枯萎病菌Ralstonia solanacearum（race 2），RS2；煙草青枯病菌R. solanacearum（race 1），RS1；馬鈴薯青枯病菌R. solanacearum（race 3），RS3；丁香假單胞菌Pseudomonus syranguepv.syingae，PSS；苜蓿萎蔫病菌Clavibacter michiganensissubsp.insidiosus，CMI；玉米細菌性枯萎病菌Pantoea stewartiisubsp.stewartii，PS；梨火疫病菌Erwinia amylovora，EA；菜豆枯萎病菌Curtobacterium flaccumfacienspv.flaccumfaciens，CF，由中國檢科院植檢所趙文軍研究員惠贈。

1.1.2 擴增儀器和試劑 擴增儀器采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀，試劑盒采用廣州迪奧生物科技有限公司DNA擴增試劑盒（恒溫擴增法）。

1.1.3 引物合成 選擇香蕉細菌性枯萎病菌的特異插入序列ISRso19序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，使用PrimerExplorerV5在線設(shè)計外引物RS2-F3-2、RS2-B3-2， 內(nèi) 引 物 RS2-FIP-2、RS2-BIP-2，其序列見表1，由廣州生工生物技術(shù)工程股份有限公司合成。

表1 LAMP引物序列Table 1 Sequence of primers for LAMP

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取和濃度測量 所得菌種經(jīng)濃度梯度劃線分離、純化后接種到NA平板上，800 mL裂解液中挑取細菌群落總數(shù)10個，進行DNA提取，定容至100 μL，即定容至100 CFU/mL。DNA提取采用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega Corporation, Madison , WI ,USA），提取前用液氮充分研磨，提取后用Nano Drop1000型核酸微量測定儀（Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham，MA，USA）測定核酸濃度。

1.2.2 實時熒光LAMP對RS2及其近似種特異性評價 反應(yīng)擴增體系為：總量25 μL，含有DNA 2 μL，2×RM 反應(yīng)母液 12.5 μL，5 μmol/L F3 引物1 μL，5 μmol/L B3 引物 1 μL，10 μmol/L FIP 引物1 μL，10 μmol/L BIP 引 物 1 μL，8 U/μL BstDNA酶 1 μL，熒光染料 0.5 μL，最后加入 20 μL 密封液。擴增參數(shù)為 63 ℃30 s、63 ℃ 15 s、63 ℃ 45 s，熒光收集階段設(shè)置為60個循環(huán)。將8種待測菌種DNA分別配制反應(yīng)體系溶液，同時設(shè)置陰性對照CK1～CK3與空白對照CK4，采用相同參數(shù)進行上機實驗。每個處理3次重復(fù)。

1.2.3 實時熒光LAMP對不同濃度RS2靈敏度評價 樣品DNA濃度梯度：將濃度為1 CFU/mL的RS2 DNA提取液按照10倍比依次系列稀釋到10-7倍。將不同濃度DNA分別構(gòu)建實時熒光LAMP反應(yīng)體系，每個樣品設(shè)3個平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性對照。反應(yīng)體系組成與參數(shù)不變，利用ABI 7500型熒光定量PCR儀的自帶軟件進行結(jié)果分析，自動生成擴增曲線，根據(jù)所得曲線判斷檢測的陰陽性。若有“S”型擴增曲線，則檢測結(jié)果判斷為陽性（有核酸擴增）；若無“S”型擴增曲線，結(jié)果則判斷為陰性（無核酸擴增）。每個處理3次重復(fù)。

1.2.4 實時熒光LAMP對RS2重復(fù)性評價 重復(fù)性實驗采用的DNA模板濃度為1 CFU/mL，每個反應(yīng)體系的模板DNA加入量均為2 μL，重復(fù)組數(shù)設(shè)置為4個，設(shè)置陰性對照與空白對照。實驗采用同一批模板DNA，每個處理3次重復(fù)。

圖1 實時熒光LAMP對RS2及其近似種特異性檢測結(jié)果Fig. 1 Results of specificity of real-time fluorescence LAMP detection to RS2 and allied species

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光LAMP對RS2及其近似種特異性評價

實時熒光LAMP檢測結(jié)果（圖1）表明，1號樣品（RS2）出現(xiàn)明顯擴增信號且曲線平滑，其余樣品均未出現(xiàn)擴增信號。故特異性實驗證明熒光LAMP體系能夠明顯區(qū)分RS2與RS1、RS3、PSS、CMI、PS、EA、CF等近似種，并證明所選的靶基因與所設(shè)計的引物適配與香蕉細菌性枯萎病菌的定性檢測實驗。

2.2 實時熒光LAMP對不同濃度RS2靈敏度評價

目標菌株（RS2）DNA系列濃度的熒光LAMP結(jié)果（圖2）表明，RS2菌株DNA在1、10-1、10-2CFU/mL 3個稀釋濃度都得到陽性結(jié)果，而10-3到10-7的稀釋濃度得到的是陰性結(jié)果的線條，故實時熒光LAMP檢測RS2的DNA靈敏度可達10-2稀釋度，即濃度為0.01 CFU/mL。經(jīng)核酸微量測定儀的測定，所提RS2菌株DNA原液濃度為 70.2 ng/μL，10-2稀釋濃度為 0.702 ng/μL。

圖2 實時熒光LAMP對不同濃度RS2菌DNA靈敏度檢測結(jié)果Fig. 2 Results of sensitivity of real-time fluorescence LAMP detection to DNA of RS2 with different concentrations

圖3 實時熒光LAMP對RS2重復(fù)性檢測結(jié)果Fig. 3 Results of repeatability of real-time fluorescent LAMP detection to RS2

2.3 實時熒光LAMP對RS2重復(fù)性評價

重復(fù)性實驗結(jié)果（圖3）表明，除陰性對照與空白對照外，樣品組4個重復(fù)實驗體系的檢測結(jié)果都能出現(xiàn)“S”型曲線，說明本實驗所建立的方法對RS2的DNA檢測具有較高的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定性好，實驗方法可靠。

3 討論

關(guān)于香蕉細菌性枯萎病菌的LAMP檢測并未見報道，而LAMP方法作為一種新的快速檢測手段在檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，近幾年來出現(xiàn)了井噴式的態(tài)勢，并且陸續(xù)有一大批關(guān)于LAMP方法的行業(yè)標準發(fā)布。同樣是在香蕉病原菌檢測上，由真菌古巴尖胞鐮刀菌引起的真菌性枯萎病，已經(jīng)有LAMP檢測的報道［33,36］。而實時熒光LAMP是在LAMP檢測的基礎(chǔ)上使用熒光信號檢測儀器進行實時采集，免除了電泳過程，所使用的信號采集有濁度儀和實時熒光PCR儀等［37］，其所使用的檢測引物和普通LAMP檢測使用的引物相同。本研究所設(shè)計的LAMP引物同樣適用于普通LAMP檢測，可以不使用大型的檢測設(shè)備，而僅使用水浴鍋和顏色終點判斷進行野外快速初篩。但由于考慮到實驗室內(nèi)LAMP檢測如果開蓋電泳容易產(chǎn)生氣溶膠污染，因氣溶膠污染而導(dǎo)致的假陽性問題一直能夠持續(xù)幾周乃至幾個月，屬于實驗室污染的重要事故，故而采用不必開蓋的實時熒光LAMP方法，且同樣該檢測體系也可用濁度儀等設(shè)備進行檢測信號采集。

本試驗在開展特異性LAMP引物篩選時，嘗試選用RS2的16SrDNA保守區(qū)序列作為目標序列進行引物的篩選設(shè)計，但經(jīng)過多次嘗試，所設(shè)引物并不能對RS2進行特異性區(qū)分，而且能擴增出所有的青枯菌。由此可以分析確證該菌命名時是先歸類到青枯菌類，后劃分至茄科勞爾氏菌，這一認知過程是基于該菌生理生化特征，并體現(xiàn)于其基因組序列。在細菌的分子生物學(xué)檢測方法中，常用細菌16SrDNA保守區(qū)的堿基序列來設(shè)計引物，從而進行細菌種類的相關(guān)檢測與鑒定。16SrDNA保守區(qū)使用于種間差別比較大的細菌間的區(qū)分，但對于香蕉性枯萎病菌來說，其相似的race型有5種，相似種及其相似race型的16SrDNA堿基序列幾乎完全相同，故不能用作引物設(shè)計。

本試驗在評價檢測方法靈敏度時，采用目標病菌DNA為標準樣品，并設(shè)置梯度稀釋度進行分析。相比于王念武等［35］采用病菌的質(zhì)粒DNA進行HRCA實驗，采用破裂菌體所提的DNA在檢測中受到其他物質(zhì)的干擾會比較多，DNA的純度一定程度上影響檢測實驗的靈敏度。從試驗結(jié)果來看，本試驗的靈敏度測試可達0.01 CFU/mL，經(jīng)核酸含量測定儀測試為 702 pg/μL，而漆艷香等［34］采用實時熒光PCR法檢測靈敏度為24.6 fg/μL，超分支滾環(huán)擴增更是能達500 fg/μL。故熒光LAMP法并不是最靈敏的檢測方法，但其高效、穩(wěn)定與不易污染的特點非常適用于青枯菌生理小種的定性檢測，相比于傳統(tǒng)LAMP與普通PCR還是具備一定優(yōu)勢。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，采用一系列稀釋度的DNA檢測靈敏度時，就其結(jié)果判斷時，肉眼判斷往往存在模棱兩可的情況，尤其是在條帶模糊不清的情況之下，而儀器判斷就在此時顯示了良好的分辨率和區(qū)分效果，熒光LAMP檢測的靈敏度優(yōu)于普通LAMP方法，與其他研究者的觀點一致［12,38］。另外，本試驗建立的方法可能并不是最靈敏的檢測方法，但卻更為穩(wěn)定，不易污染；相比于傳統(tǒng)LAMP方法和接種鑒定生理小種方法更為靈敏和高效。另外，在進行靈敏度測試時，發(fā)現(xiàn)不同濃度的模板檢測結(jié)果顯示“S”型曲線到達平臺期的高度不同，說明最終的LAMP擴增產(chǎn)物積累量不同，擴增的效率有所不同，可能是擴增體系中初始量的極其細微差別造成的。初始極其細微的差別在經(jīng)過LAMP擴增后所導(dǎo)致產(chǎn)物積累量的差別應(yīng)當(dāng)是逐步拉大的，且與出現(xiàn)平臺期的早晚有直接關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究使用了LAMP檢測方法，該方法在香蕉細菌性枯萎病菌檢測上尚未見報道。同時又結(jié)合實時熒光設(shè)備及技術(shù)，具有對目標序列的高特異性、重復(fù)性比較好的優(yōu)點，較普通LAMP具有更高的靈敏度和更短的檢測時間。采用實時熒光LAMP進行植物病原真菌的定性檢測，具有比普通定性方法更靈敏且有效避免氣溶膠污染的特點。這種LAMP進行定性檢測方法在檢測實踐中應(yīng)用廣泛，在香蕉細菌性枯萎病菌初篩檢測中的應(yīng)用也發(fā)揮了該方法的優(yōu)點，比普通PCR相比節(jié)約了檢測成本，提高了檢測效率。

本研究不足之處在于驗證特異性的生理小種、?；筒粔蜇S富，尤其對毆文氏菌屬和黃單胞菌屬等雖然經(jīng)過網(wǎng)上序列比對，但若能夠充分驗證將會更好。