濃縮生長因子在牙髓組織再生中的應(yīng)用研究

文瑞雪 杜毅

【摘要】 隨著牙髓組織工程的發(fā)展，牙髓再生作為牙髓病治療的新趨勢。牙髓再生包括三個(gè)必備因素，即有分化能力的干細(xì)胞、生長分化信號因子、生物活性支架材料，其中支架材料在牙髓再生中具有重要作用。濃縮生長因子是富含自體生長因子的一種自體纖維蛋白物，通過離心自身血液即可獲得，具有簡單快捷、安全性高等特點(diǎn)，可作為牙髓再生良好的支架材料。本文就濃縮生長因子的發(fā)展、制備及在牙髓再生中的體內(nèi)外研究進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】 濃縮生長因子 血小板濃縮物 牙髓再生 細(xì)胞因子 細(xì)胞支架

[Abstract] Dental pulp tissue regeneration is a new trend in the treatment of dental pulp diseases， the selection of its scaffold material is particularly important. Concentrated growth factor contains fibrin network and a large number of growth factors， which can be used as a good scaffold material for dental pulp tissue regeneration. The development， preparation and in vivo and vitro study of concentrated growth factor in dental pulp tissue regeneration were reviewed.

[Key words] Concentrated growth factor Platelet concentrate Dental pulp regeneration Cytokines Cell scaffoldFirst-authors address： Stomatological College of Binzhou Medical University， Yantai 264003， Chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.18.042

全世界約有三分之二人口患有齲病和/或牙髓炎。目前，牙髓壞死和根尖周病的治療為根管治療和根尖外科手術(shù)，但根管治療后牙齒因?yàn)槿狈I養(yǎng)來源而導(dǎo)致牙齒變脆易折。近年來，隨著牙髓組織工程的發(fā)展，牙髓再生成為牙髓病治療領(lǐng)域新的突破口及研究趨勢。再生牙髓治療（RET）的目的是用新生的類牙髓樣組織取代炎癥狀態(tài)或已壞死的牙髓組織，從而盡可能地保持牙齒活力，使未成熟的牙齒繼續(xù)發(fā)育[1]。牙髓組織再生有三個(gè)必備要素，即具有分化潛能的干細(xì)胞、生長分化信號因子、生物活性支架材料[2]。近年來，有學(xué)者提出濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）作為更為理想的支架材料用于牙髓再生，并進(jìn)行大量的研究。

1 濃縮生長因子的發(fā)展

血小板濃縮物來源于自身富含自體生長因子的一種自體纖維蛋白物，具有制備簡單、經(jīng)濟(jì)劃算、生物安全性高、有再生潛能等優(yōu)勢[3]。目前主要包括三類：富血小板血漿（PRP）、富血小板纖維蛋白（PRF）和濃縮生長因子（CGF）。

富血小板血漿作為第一代血小板濃縮物最早于20世紀(jì)80年代初期發(fā)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)它在早期（在前8 h內(nèi)）釋放所含有的大量生長因子，對組織的修復(fù)有促進(jìn)作用[4]。因其制備過程中要加入抗凝劑和凝血酶，所以可能存在伴發(fā)凝血系統(tǒng)紊亂的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

富血小板纖維蛋白作為第二代血小板濃縮物，不需要額外加入抗凝劑，靜脈血經(jīng)離心后即可獲得。與PRP相比，PRF含有大量白細(xì)胞，增加了抗感染能力和免疫調(diào)節(jié)作用。PRF中纖維蛋白呈現(xiàn)三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可保護(hù)血小板不被立即活化，生長因子可隨時(shí)間緩慢釋放，這種釋放方式對于組織再生是非常有利的[6]。

CGF是2006年Sacco等首次發(fā)現(xiàn)，是繼富血小板血漿（platelet rich plasma）和富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin）之后的第三代血小板濃縮物。濃縮生長因子由一種特殊的變速離心機(jī)Medifuge（Silfradent，意大利）對靜脈血進(jìn)行離心，離心過程中血小板發(fā)生碰撞被激活，破裂后釋放密集、豐富的生長因子[7]。與PRF制備相同，濃縮生長因子制備也不需要加入凝血酶和抗凝劑，兩者的離心速度不同，其結(jié)構(gòu)也不相同。有學(xué)者對CGF和PRF結(jié)構(gòu)上的差異進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者形態(tài)相似，均為淡黃色塊狀物;但兩者的膠原纖維排列不同，PRF中膠原纖維排列成條索狀，而CGF中膠原纖維排列成柵欄狀;但濃縮生長因子中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、胰島素樣生長因子和血管內(nèi)皮生長因子的含量均高于血小板纖維蛋白[8]。

2 濃縮生長因子的制備及成分

采集患者靜脈血到未添加抗凝劑的9 mL無菌Vacuette試管中（試管內(nèi)不含有抗凝劑等任何添加劑），勿晃動（避免產(chǎn)生溶血反應(yīng)），立即放入Medifuge離心機(jī)，變速離心12 min。靜脈血經(jīng)離心后，Vacuette管內(nèi)成分分成3層：最上層是一種透明液體，即血清，是由沒有纖維蛋白原和凝血因子的血漿組成。中間層呈黃色不透明凝膠狀，為CGF，這一層由大而致密的聚合纖維蛋白塊、聚集的血小板和大量生長因子組成。底層主要由紅細(xì)胞構(gòu)成，呈暗紅色致密凝膠狀。CGF是通過切斷紅色的致密凝膠，然后將其壓縮成一層薄膜來機(jī)械分離的中間為纖維蛋白凝膠（CGF的主要載體），下層為紅細(xì)胞層[9]。上層血清可進(jìn)行存儲并用于預(yù)防創(chuàng)口感染及促進(jìn)傷口的愈合，紅細(xì)胞層的上面和纖維蛋白層的下面存在大量的生長因子和干細(xì)胞，所以分離CGF層時(shí)應(yīng)一并分離出來，并存儲在抗菌溶液中（Lincocin 600 mg），剩余的紅細(xì)胞層可用于制備植骨術(shù)中的填料[10]。

3 CGF在牙髓再生中的應(yīng)用

3.1 生長因子的釋放 CGF因特殊的離心速度，使血小板破裂后釋放大量生長因子和細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor TGF）、類胰島素樣生長因子（IGF）、血小板衍生生長因子（（plateletderived growth factor，PDGF）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等（bone morphogenetic protein，BMP）等[9，11]。這些細(xì)胞因子與細(xì)胞的分化、增殖和血管生成的調(diào)控過程緊密相關(guān)，且調(diào)控過程對組織再生至關(guān)重要[11]。

多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞因子在牙髓再生中促進(jìn)具有分化潛能的干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化。有學(xué)者證實(shí)BMP-7[12-13]、TGF-β與一定濃度IGF-1相聯(lián)合[14-15]可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞成牙向分化。同樣，Zhang等[16]證明PDGF-BB可增強(qiáng)人牙髓干細(xì)胞的增殖、遷移和成牙向分化能力，且促進(jìn)牙髓干細(xì)胞VEGF的分泌，增加牙髓血管再生潛能。He等[17]證實(shí)FGF可明顯促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖，可協(xié)同TGF-β1誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化。血管生成是形成新血管的細(xì)胞過程，這一復(fù)雜的分子機(jī)制需要多種生長因子進(jìn)行協(xié)同作用[18]。濃縮生長因子含有大量血管再生相關(guān)因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維生長因子（FGF）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor）等，這些血管相關(guān)細(xì)胞因子在牙髓再生和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。多向研究指出VEGE和FGF能夠促進(jìn)牙髓新生血管的再生[19-20]。但牙髓再生中干細(xì)胞的增殖和多向分化不是單一因素所導(dǎo)致，需要多種細(xì)胞因子相互作用[21]。

CGF膠原基質(zhì)中粗細(xì)膠原纖維形成三維網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以保護(hù)生長因子避免被蛋白水解酶水解，保持纖維網(wǎng)絡(luò)中生長因子的濃度和持續(xù)緩慢的釋放[22]，并促進(jìn)牙髓組織的形成。同時(shí)，CGF的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可作為支架支撐新形成的組織，促進(jìn)細(xì)胞的附著，為牙髓再生提供有利環(huán)境[23]。

3.2 CGF在牙髓再生中的體外研究 有學(xué)者模擬炎癥微環(huán)境對牙髓再生進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在有無LPS處理的情況下，CGF均能顯著促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的遷移;LPS感染牙髓干細(xì)胞后再經(jīng)CGF處理發(fā)現(xiàn)ALP活性增加，成牙相關(guān)基因和成骨相關(guān)基因，如DSPP、DMP-1、Runx2、OPN和OCN表達(dá)增高，這些結(jié)果表明，CGF能明顯促進(jìn)lps刺激的牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)/成骨分化[24]。Hong等[25]將CGF制成CGF條件培養(yǎng)基（CCM）對人根尖乳頭干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，證實(shí)CGF組礦化結(jié)節(jié)更大更多，成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因如ALP、DMP-1和DSPP在14天時(shí)表達(dá)量上調(diào)顯著，表明CGF可顯著促進(jìn)人根尖乳頭干細(xì)胞（SCAPs）成牙本質(zhì)向分化。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)CGF顯著促進(jìn)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，且可能通過調(diào)節(jié)DSPP、DMP1、BMP2和RUNx2的表達(dá)促進(jìn)GMSCs細(xì)胞的成骨/成牙本質(zhì)分化。Qin等[27]發(fā)現(xiàn)CGF能促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖及遷移，且能促進(jìn)施萬細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，且體外可促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。CGF顯著促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖和分化，表明有利于牙周組織的再生[28]。

宦俊等[29]證明了體外條件下CGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和表達(dá)成血管相關(guān)因子，證明了CGF可明顯促進(jìn)血管新生，為今后CGF在牙髓血運(yùn)重建中奠定了基礎(chǔ)，提示CGF在牙髓血運(yùn)重建中具有潛在應(yīng)用前景。Zhang[30]經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CGF纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中散在分布CD-34陽性細(xì)胞，這與Rodella等[7]發(fā)現(xiàn)一致;同時(shí)經(jīng)CGF處理后兔骨膜來源細(xì)胞的VEGF和bFGF表達(dá)升高，表明CGF具有促進(jìn)血管新生潛能。

3.3 CGF在牙髓再生中體內(nèi)研究 Zhang等[16]將PDGF-BB修飾的人牙髓干細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)有新生牙本質(zhì)和類牙本質(zhì)樣細(xì)胞的產(chǎn)生。有學(xué)者將比格犬未發(fā)育完全的年輕恒牙牙髓拔除，并進(jìn)行清理消毒，然后將比格犬自體濃縮生長因子制成2 mm3大小充填到根管內(nèi)，結(jié)果表明，比格犬年輕恒牙牙本質(zhì)壁增厚、根管內(nèi)出現(xiàn)類牙髓組織和柵欄狀排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞和散在的血管[24]。有學(xué)者將PRF復(fù)合牙髓干細(xì)胞置于根管內(nèi)放入裸鼠皮下，觀察到根管內(nèi)有明顯致密的新生血管形成，類似于正常牙髓組織，并有新生的類牙本質(zhì)及類成牙本質(zhì)細(xì)胞分布于根管內(nèi)壁，且DSPP陽性表達(dá)，這表明血小板濃縮物具有促牙髓牙本質(zhì)再生能力[31]。

4 展望

CGF作為最新一代血小板濃縮物，制備簡單，不需要任何額外的合成材料或生物材料（如牛凝血酶或氯化鈣），不存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)[32]。濃縮生長因子使用自體血制備，臨床應(yīng)用安全性高，創(chuàng)傷小，且膠原纖維中含有大量血小板生長因子，釋放緩慢，作為牙髓再生的支架材料應(yīng)用前景廣闊。多項(xiàng)體外臨床前期研究證實(shí)濃縮生長因子在組織再生方面的能力，目前已廣泛應(yīng)用于口腔、頜面、整形、骨外科以及牙齦組織工程研究[32-33]。CGF在骨再生中使用方式多樣，可壓制成膜也可制成顆粒與自體骨或異體骨粉聯(lián)合使用，在促進(jìn)傷口愈合、種植體骨結(jié)合[34]和上頜竇提升方面效果顯著[32]，但CGF用于牙髓再生的臨床應(yīng)用較少，還有待于進(jìn)一步研究。

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