不同金屬離子對(duì)稻田自然生物膜磷酸酶活性的影響①

蔡述杰，鄧開(kāi)英，李九玉*，徐仁扣

不同金屬離子對(duì)稻田自然生物膜磷酸酶活性的影響①

蔡述杰1, 2，鄧開(kāi)英1，李九玉1*，徐仁扣1

(1土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

以稻田自然生物膜為研究對(duì)象，研究不同濃度金屬離子對(duì)生物膜酸性和堿性磷酸單酯酶(ACPase和ALPase)活性與酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。發(fā)現(xiàn)K+和Na+在0 ~ 1.0 mmol/L濃度下均對(duì)ACPase和ALPase無(wú)明顯影響，Ca2+和Mg2+對(duì)ACPase和ALPase活性均有激活效應(yīng)，可使磷酸酶活性最大提高14.1% 和46.7%；Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+和 Ag+對(duì)ACPase和ALPase活性均有抑制作用。Co2+在低濃度時(shí)對(duì)ACPase和ALPase活性有一定的激活作用，高濃度時(shí)變?yōu)橐种谱饔?；Cr6+在0.1 mmol/L時(shí)對(duì)ACPase活性有促進(jìn)作用，而在離子濃度0.25 ~ 1 mmol/L的范圍內(nèi)，均對(duì)ACPase活性產(chǎn)生抑制作用。通過(guò)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Mg2+的加入使ACPase與底物的親和力與催化效率增強(qiáng)，Cu2+對(duì)ACPase和ALPase的抑制作用主要是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，Zn2+雖然提高ACPase與底物的親和力，但是降低了ALPase與底物的親和力與催化效率。金屬離子對(duì)酶活性的影響因金屬離子種類、濃度和磷酸酶類型而異，主要通過(guò)與酶活性位點(diǎn)或底物結(jié)合，改變酶的活性、對(duì)底物的親和力，以及影響酶基因的表達(dá)等實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果將為評(píng)估自然生物膜在稻田磷的生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用，以及稻田受重金屬污染的可能風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

自然生物膜；磷酸酶活性；金屬離子；酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)；稻田

稻田水土界面之間的微生物通常以稻田自然生物膜的形式存在。自然生物膜是在自然環(huán)境條件下形成于淹水基質(zhì)表面的微生物聚集體及其交織的非生物物質(zhì)的集合體。微生物包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、藻類、病毒等；非生物物質(zhì)包括微生物分泌的多糖、蛋白質(zhì)、脂類等有機(jī)質(zhì)以及鐵錳氧化物、碳酸鹽、硅酸鹽等無(wú)機(jī)礦物質(zhì)[1]。稻田自然生物膜覆蓋于土壤表面，是外源污染物如重金屬離子進(jìn)入土壤的必經(jīng)之地，是多種物質(zhì)包括養(yǎng)分、重金屬重要的存儲(chǔ)庫(kù)以及傳輸介質(zhì)[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)自然生物膜是水體中重要的短期磷庫(kù)，也對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體-底泥界面無(wú)機(jī)磷的緩存和緩釋起著重要的調(diào)控作用[3]。而且，自然生物膜，作為一種微生物聚集體，還可以分泌多種水解酶，對(duì)土壤和底泥中有機(jī)磷的降解和生物有效性等起著促進(jìn)作用[4]。

當(dāng)前，由于工業(yè)廢物排放、污水灌溉以及含有重金屬的農(nóng)藥、化肥的不合理使用等，許多污染物包括過(guò)量的重金屬離子不斷進(jìn)入稻田生態(tài)系統(tǒng)。這些重金屬污染可對(duì)稻田水土界面中的微生物產(chǎn)生毒害，阻礙了碳氮循環(huán)、代謝活性、酶活性等各種微生物過(guò)程[5]。自然生物膜在水環(huán)境中對(duì)重金屬的遷移、生物地球化學(xué)特性、生物可利用性和毒性等過(guò)程中，均起著非常重要的作用[6]。關(guān)于自然生物膜和金屬之間的相互作用進(jìn)行了較多的研究，Dong等[7-9]發(fā)現(xiàn)自然生物膜對(duì)Pb、Cd、Cu、Zn等重金屬有很強(qiáng)的吸附作用。Serra等[10]報(bào)道了河流系統(tǒng)中自然生物膜群落對(duì)水體金屬Cu暴露的響應(yīng)，分析表明自然生物膜中重金屬含量如Cd (II)和水體Cd (II)濃度的變化一致，具有較高的相關(guān)性。一些研究也表明水體中存在許多光合物種，如藍(lán)藻具有強(qiáng)烈的吸收金屬元素的能力。這些研究均表明自然生物膜具有較大潛在富集水體中金屬元素的能力[11]。但重金屬離子對(duì)稻田自然生物膜的磷酸酶活性的影響研究還極少涉及。

自然生物膜包含多種磷酸酶，如磷酸單酯酶、磷酸二酯酶、聚磷酸酶等，其中磷酸單酯酶活性最高、分布最廣泛。已有研究證明覆蓋于淹水基質(zhì)表面的自然生物膜能夠釋放磷酸單酯酶來(lái)水解環(huán)境中的有機(jī)磷，這是提高環(huán)境中磷有效性的重要途徑[12]。磷酸單酯酶是廣泛存在于微生物中的一種金屬酶，其構(gòu)象及活力受到金屬離子的影響[13]，而且金屬離子對(duì)磷酸酶基因的表達(dá)也受其種類和濃度等影響[14]。目前關(guān)于金屬離子對(duì)于稻田自然生物膜磷酸酶活性影響的研究很少，因此本文研究了部分金屬離子對(duì)稻田自然生物膜酸性磷酸單酯酶(ACPase)和堿性磷酸單酯酶(ALPase)活性及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，以期揭示金屬離子與自然生物膜磷酸酶的作用機(jī)制，為稻田磷的生物地球循環(huán)過(guò)程的認(rèn)識(shí)和重金屬污染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 自然生物膜富集與培養(yǎng)

在南京江寧區(qū)水稻田采集土壤溶液于自制玻璃缸(長(zhǎng)×寬×高=30 cm × 20 cm × 50 cm)中，并將纖維載體淹沒(méi)其中。每周添加BG-11營(yíng)養(yǎng)液[15]，以充分維持生物膜的生長(zhǎng)。將水缸置于人工氣候室中，光/暗周期為14 h(26 °C)/10 h(20°C)，光強(qiáng)度為12 000 lux，濕度為80%。一個(gè)月后，微生物聚集體附著在載體上，形成穩(wěn)定的生物膜。從玻璃缸中收集在纖維載體上附著的生物膜，并用于后續(xù)試驗(yàn)。采用光學(xué)顯微鏡(Nilcon-80i，Japan) 和激光共聚焦掃描顯微鏡 (CLSM，Zeiss-LSM710，German) 對(duì)周生生物膜的形態(tài)進(jìn)行表征。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用磷酸單酯酶標(biāo)準(zhǔn)底物對(duì)硝基苯基磷酸二鈉鹽(pNPP)來(lái)測(cè)定酶活性。不同金屬離子的選取如下：K+、Na+、Ca2+選取相對(duì)應(yīng)的可溶性氯化鹽，Mg2+、Co2+、Al3+、Mn2+、Ni2+和Zn2+選取可溶性硫酸鹽，Cu2+和Ag+選取可溶性硝酸鹽, 用K2Cr2O7作為Cr6+的來(lái)源。Tris–HCl緩沖溶液被用于控制體系pH。將100 ml生物膜懸浮液在15 ℃下1 157 g離心10 min后移除上清液，用0.05 mol/L Tris–HCl緩沖液(酸性條件為pH 6.0，堿性條件為pH 9.0)重新懸浮生物膜樣品，離心和洗滌過(guò)程重復(fù)兩次，盡可能減少培養(yǎng)基質(zhì)中本身攜帶離子的含量。將生物膜再懸浮于100 ml的0.05 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.1 不同離子對(duì)磷酸酶活性的影響 依據(jù)稻田土壤中各種離子的有效態(tài)含量以及重金屬污染對(duì)土壤酶活性的影響研究[16]，在50 ml離心管中加入不同濃度的金屬離子溶液5 ml，控制金屬離子最終濃度為0、0.1、0.25、0.5、1.0 mmo/L，以測(cè)試其對(duì)磷酸酶活性的影響。按照相當(dāng)于0.4 g/L干物質(zhì)量的比例加入清洗后的生物膜懸液2 ml，統(tǒng)一用水定容至12 ml后在25 °C，200 r/min 的避光條件下振蕩2 h。然后加入5 ml的0.2 mol/L Tris- HCl緩沖液和2 ml的10 mmol/L pNPP溶液(終濃度為1 mmol/L)，在37 °C、200 r/min 的避光條件下繼續(xù)振蕩1 h, 立即加入1 ml的0.5 mol/L NaOH終止水解反應(yīng)。過(guò)濾后將濾液在405 nm下測(cè)定吸光度。每個(gè)處理設(shè)定3個(gè)重復(fù)。以不加上述金屬離子體系中的生物膜酶活性為100，其余條件下測(cè)定的酶活性與未加金屬離子條件測(cè)得酶活性相比得到相對(duì)酶活性。

1.2.2 不同離子影響下磷酸酶活性的動(dòng)力學(xué)分析 選取不同濃度的Mg2+、Zn2+和Cu2+(0、0.25、0.5、1.0 mmol/L)溶液，測(cè)定其對(duì)磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，pNPP濃度范圍為0 ~ 1 500 mmol/L。酶的催化速度隨著底物濃度的增加而增加，直到接近最大速度(max)的某一點(diǎn)。酶催化的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)通常用符合米氏方程(Michaelis–Menten方程)，其中米氏常數(shù)(m)是速度達(dá)最大速度一半時(shí)的底物濃度；米氏常數(shù)表明酶對(duì)底物的親和力：m越低，親和力越高。這些參數(shù)由Michaelis–Menten方程描述：

式中：是任意時(shí)刻酶催化反應(yīng)的速度(μmol(g·h))；是相應(yīng)時(shí)間的底物濃度(mmol/L)；max是最大催化反應(yīng)速率(μmol(g·h))；m是米氏常數(shù)(mmol/L)。動(dòng)力學(xué)參數(shù)max和m使用Michaelis–Menten方程的線性變換 Hanes–Woolf 方程計(jì)算：

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究每組試驗(yàn)重復(fù) 3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用 Microsoft Excel 2016 以及數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、制圖；采用 SPSS 中 Duncan 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，< 0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 自然生物膜形態(tài)表征

采用光學(xué)顯微鏡(Nilcon-80i，Japan)和激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM，Zeiss-LSM710，German)對(duì)自然生物膜的形貌進(jìn)行了表征(圖1)。結(jié)合文獻(xiàn)[17]分析，發(fā)現(xiàn)自然生物膜主要由光自養(yǎng)微藻，尤其是絲狀藻類組成。絲狀藻類交織在一起，很多細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和小型多細(xì)胞動(dòng)物等附著在絲狀藻類上面。

(A. 光學(xué)顯微鏡(400×)；B. 激光共聚焦掃描顯微鏡)

2.2 不同金屬離子對(duì)生物膜磷酸酶活性的影響

金屬離子對(duì)自然生物膜中ACPase和ALPase活性影響的結(jié)果表明，影響的方式有4種：抑制型、激活型、相對(duì)無(wú)害型和混合型(表1)。正一價(jià)堿金屬離子(K+和Na+)在0 ~ 1.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)均對(duì)ACPase和ALPase無(wú)明顯影響(>0.05)，屬于相對(duì)無(wú)害型。Ca2+可以提高ACPase和ALPase的活性，在0.1 ~ 1.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)最大可提高磷酸酶的活性達(dá)14%(<0.05)。Mg2+對(duì)ACPase和ALPase活性均有顯著的激活效應(yīng)，隨著離子濃度的增大，ACPase和ALPase活性不斷增強(qiáng)；在Mg2+濃度1.0 mmol/L時(shí)，酶活性最大可提高54%，屬于激活型。Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+對(duì)ACPase和ALPase活性均有顯著抑制作用(<0.05)，屬于抑制性；抑制劑濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)，最大抑制率可達(dá)85%。但是這些離子對(duì)于ACPase和ALPase活性的抑制程度不同，Cu2+、Al3+對(duì)ACPase活性的影響明顯大于ALPase，而Zn2+對(duì)ALPase活性的影響明顯大于ACPase。Ni2+、Ag+在低濃度(0.1 mmol/L)時(shí)對(duì)ACPase活性無(wú)明顯影響，隨著離子濃度的增加，ACPase和ALPase活性降低。Co2+在低濃度時(shí)對(duì)ACPase和ALPase活性有一定的激活作用，隨著濃度的增大，變?yōu)橐种谱饔茫瑢儆诨旌闲?。Cr6+在低濃度(0.1 mmol/L)時(shí)對(duì)ACPase活性有促進(jìn)作用，而在離子濃度0.25 ~ 1.0 mmol/L的范圍內(nèi)，均對(duì)ACPase活性產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)Cr6+離子濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)，生物膜已喪失ACPase活性。而Cr6+對(duì)ALPase活性具有激活作用，隨著離子濃度的增大，ALPase活性不斷增加。

表 1 不同金屬離子對(duì)生物膜磷酸酶活性的影響

注：同行數(shù)據(jù)小寫字母不同表示不同濃度金屬離子對(duì)ACPase或ALPase相對(duì)活性影響達(dá)<0.05顯著水平。

2.3 不同金屬離子對(duì)生物膜磷酸酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

磷酸酶是一種金屬酶，其酶活性的充分發(fā)揮需要兩種金屬離子：Mg2+和Zn2+，其中Zn2+位于酶活性中心，是酶活性必需基團(tuán)之一，Mg2+對(duì)酶活性的表達(dá)起到重要作用[18]；而Cu2+是土壤污染的幾種主要重金屬之一。所以選取Mg2+、Zn2+和 Cu2+對(duì)磷酸酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(m和max)進(jìn)行探討。圖2中顯示了在Mg2+、Cu2+和Zn2+存在下，酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變形方程的Hanes–Woolf曲線，[] /和[] 擬合方程的截距和斜率與不添加金屬離子的處理不同，說(shuō)明金屬離子對(duì)生物膜磷酸酶活性產(chǎn)生了影響。擬合得出的m和max值表明(表2)，無(wú)金屬離子加入下自然生物膜ACPase的m值為164.58 μmol/L，max值為pNP 138.89 μmol/(g·h)，而ALPase的m值為76.90 μmol/L，max值為pNP 256.41 μmol/(g·h)?？芍匀簧锬LPase與底物的親和力與催化效率都強(qiáng)于ACPase。隨著Mg2+濃度的增加，ACPase的m值降低，max值增大，說(shuō)明Mg2+的加入使ACPase與底物的親和力與催化效率增強(qiáng)；而ALPase的m值變化不大，max值增大，說(shuō)明Mg2+的加入主要使ALPase催化效率增強(qiáng)。Cu2+的加入(1.0 mmol/L條件下ACPase完全失活，無(wú)法擬合)對(duì)ACPase的m值無(wú)明顯變化，而max值不斷下降，所以Cu2+對(duì)ACPase的抑制作用可認(rèn)為是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；在低濃度條件下(0 ~ 0.25 mmol/L)，Cu2+的加入對(duì)ALPase的m值無(wú)明顯變化，而max值下降，也可認(rèn)為是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，而在高濃度范圍下(0.25 ~ 1 mmol/L)，m值增大，max值降低，所以Cu2+在高濃度下同時(shí)降低了ALPase的親和力和催化效率，屬于混合型抑制作用。Zn2+的加入均降低了ACPase的m值和max值，表明Zn2+雖然提高ACPase與底物的親和力，但是降低了ACPase的催化速度。在低濃度范圍(0 ~ 0.25 mmol/L)，Zn2+對(duì)ALPase的作用效果與ACPase類似，同時(shí)降低了m值與max值。在較高濃度范圍(0.25 ~ 1 mmol/L)，隨著Zn2+濃度的升高，m值升高，max值降低，Zn2+同時(shí)降低了ALPase與底物的親和力與催化效率。

3 討論

由圖1 可以看出，自然生物膜主要是絲狀藻等光合藻類為主導(dǎo)的物種相互纏繞而構(gòu)成自然生物膜的基質(zhì)，而其他生物棲息于此基質(zhì)上。許多微生物共存于自然生物膜中，意味著自然生物膜是一個(gè)有別于單一微生物種群的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)。在自然生物膜這種非均相體系中，金屬離子、膠體、微生物和酶之間的復(fù)雜反應(yīng)都有可能干擾任何金屬離子對(duì)于磷酸酶的影響。已有研究證明自然生物膜通過(guò)本身這種復(fù)雜特殊的組成結(jié)構(gòu)可能使其在抵抗外源污染物時(shí)，具有有別于簡(jiǎn)單微生物種群的性質(zhì)，由于自然生物膜能夠承受一定的金屬離子脅迫而不會(huì)嚴(yán)重喪失其生物化學(xué)活性[19]。一些關(guān)于稻田自然生物膜的研究表明，自然生物膜能夠適應(yīng)一定濃度的重金屬污染，而胞外聚合物的吸附、群落中藻類豐度提高和組成變化導(dǎo)致碳代謝活性功能的響應(yīng)，是自然生物膜能夠適應(yīng)重金屬脅迫的主要原因[20]。本文中生物膜磷酸酶活性對(duì)重金屬的敏感性遠(yuǎn)低于麥芽中磷酸酶的，如0.5 mmol/L的Cu2+和Zn2+抑制生物膜酸性的活性約40%，而同樣濃度的Cu2+和Zn2+使麥芽中磷酸酶的活性降低80% 以上[21]?；钚晕勰嘀形⑸锖徒橘|(zhì)環(huán)境更加復(fù)雜，因此0.5 mmol/L的Cu2+和Zn2+僅使活性污泥的磷酸酶活性降低約15%[22]。

(V：任意時(shí)刻酶催化反應(yīng)的速度(μmol(g·h)；[S]：相應(yīng)時(shí)間的底物濃度)

表 2 不同濃度Mg2+、Zn2+和Cu2+作用下ACPase和ALPase動(dòng)力學(xué)常數(shù)max(μmol/(g·h))和m(μmol/L)的變化

Table 2 Changes of kinetic constants (Vmax and Km) of ACPase and ALPase under different concentrations of Mg2+, Zn2+ and Cu2+

注：nd表示未測(cè)定。

金屬離子對(duì)酶活性的影響可表現(xiàn)為對(duì)酶蛋白的作用，一般分為 3 種類型[16]：①一些金屬離子的加入可以促進(jìn)酶活性中心與底物間的配位結(jié)合，改變酶蛋白的表面電荷以及催化反應(yīng)的平衡性質(zhì)，從而增強(qiáng)酶活性，即有激活作用。②一些金屬離子占據(jù)了酶的活性中心或與酶分子的巰基、胺基和羧基結(jié)合，導(dǎo)致酶活性降低，即有抑制作用。③重金屬與酶沒(méi)有專一性對(duì)應(yīng)關(guān)系，對(duì)酶活性影響小。而且，金屬離子還會(huì)影響磷酸酶基因的表達(dá)[14]。如細(xì)菌堿性磷酸酶的種類多樣，根據(jù)堿性磷酸酶蛋白序列的相似度和底物的不同，可主要分為 3 種類型：和。由于 Zn2+與 Mg2+是堿性磷酸酶的輔基，一定濃度的 Zn2+與 Mg2+的存在會(huì)促進(jìn)細(xì)菌基因的表達(dá)；而一定濃度的 Ca2+和 Co2+能重新促進(jìn)基因的表達(dá)[14]。因此，一定濃度的某些金屬離子通過(guò)促進(jìn)磷酸酶基因的表達(dá)，促進(jìn)磷酸酶活性，但這種作用與金屬離子的種類、濃度和磷酸酶基因的類型有關(guān)。但濃度過(guò)高時(shí)，則會(huì)因毒害作用而抑制酶活性表達(dá)。

我們的研究表明，正一價(jià)堿金屬離子(Na+和 K+)對(duì)磷酸酶活性無(wú)明顯影響，這一發(fā)現(xiàn)與 Chen 等[23]的發(fā)現(xiàn)一致，說(shuō)明 Na+和 K+對(duì)稻田自然生物膜磷酸酶沒(méi)有對(duì)應(yīng)關(guān)系。Mg2+促進(jìn)了ACPase 和 ALPase 酶活性，因?yàn)槠涫橇姿崦钢行慕Y(jié)合位點(diǎn)的調(diào)節(jié)離子，加入能夠促進(jìn)酶活性中心與底物間的配位結(jié)合，來(lái)改變酶催化反應(yīng)的平衡性和酶蛋白的表面電荷，從而可增強(qiáng)酶活性[18]。Mg2+也是磷酸酶的輔基，并促進(jìn)磷酸酶功能基因的表達(dá)[14]，因此在 0 ~ 1.0 mmol/L 范圍內(nèi)顯著提高了酸性和堿性磷酸酶活性。Ca2+、Co2+在一定條件下也能夠提升酶活性，Wu 等[24]研究發(fā)現(xiàn)加入一定濃度 Ca2+、Co2+后能促進(jìn)磷酸酶基因的表達(dá)。但Ca2+、Co2+其對(duì)磷酸酶活性的激活作用明顯低于 Mg2+。Cr6+在酸性條件下抑制磷酸酶活性，在堿性條件下激發(fā)磷酸酶活性，這可能與 Cr6+在不同 pH 條件下 Cr6+的離子形態(tài)及其對(duì)藻類的毒性效應(yīng)不同有關(guān)[25]。Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+、Ag+對(duì)磷酸酶表現(xiàn)出了抑制作用，尤其是 Zn2+、Cu2+、Mn2+，可能是這些重金屬離子占據(jù)了酶的活性中心或與酶分子的巰基、胺基和羧基等基團(tuán)結(jié)合導(dǎo)致酶活性降低甚至失活即有抑制作用[16]，甚至直接毒害生物膜中的微生物，使其喪失生命力[5]。通常來(lái)說(shuō)，酸堿度是影響藻類或細(xì)菌磷酸酶活性的重要因子，我們的研究發(fā)現(xiàn)自然生物膜的 ALPase 具有比 ACPase 更高的酶活性，這可能是由于自然生物膜屬于光營(yíng)養(yǎng)性微生物聚集體，其光合作用導(dǎo)致微域環(huán)境呈堿性條件[26]，并適應(yīng)該堿性環(huán)境，酸性條件一定程度上抑制了微生物的生命活力。

通常來(lái)說(shuō)，抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的作用可分為[27]：①競(jìng)爭(zhēng)性抑制：競(jìng)爭(zhēng)性抑制是指當(dāng)抑制物與底物的結(jié)構(gòu)類似時(shí)，它們將競(jìng)爭(zhēng)酶的同一可結(jié)合部位，阻礙了底物與酶相結(jié)合，導(dǎo)致酶催化反應(yīng)速率降低。這種抑制使得m增大，而max不變。②非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑與酶的非活性部位相結(jié)合，形成抑制物-酶的絡(luò)合物后會(huì)進(jìn)一步再與底物結(jié)合；或是酶與底物結(jié)合成底物酶絡(luò)合物后，其中有部分再與抑制物結(jié)合。雖然底物、抑制物和酶的結(jié)合無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性，但兩者與酶結(jié)合所形成的中間絡(luò)合物不能直接生成產(chǎn)物，導(dǎo)致了酶催化反應(yīng)速率的降低，這種抑制使得max變小，但m不變。③反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑不直接與游離酶相結(jié)合，而僅與酶-底物復(fù)合物結(jié)合形成底物-酶-抑制劑復(fù)合物，從而影響酶促反應(yīng)的現(xiàn)象。這種抑制作用使得max、m都變小，但max/m比值不變。Mg2+同時(shí)降低了ACPase和ALPase的m值，說(shuō)明其有助于提高生物膜磷酸酶與底物結(jié)合的能力。Cu2+對(duì)ACPase的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用說(shuō)明Cu2+可能與ACPase的非活性部分結(jié)合，或與酶促反應(yīng)中的中間產(chǎn)物絡(luò)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低。而Zn2+對(duì)于磷酸酶以及Cu2+對(duì)于ALPase的抑制作用并不符合競(jìng)爭(zhēng)抑制性、非競(jìng)爭(zhēng)抑制性或反競(jìng)爭(zhēng)性抑制性作用，可能是直接對(duì)生物膜產(chǎn)生了毒害作用。通常來(lái)說(shuō)，在土壤、植物、活性污泥或動(dòng)物糞便中的酸性或堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)m值是相似的，在0.2 ~ 0.8 mmol/L 之間，而我們的研究發(fā)現(xiàn)自然生物膜的磷酸酶的m值在0.1左右，即使在金屬離子的影響下，m值仍小于0.2，說(shuō)明自然生物膜的磷酸酶對(duì)底物有更強(qiáng)的親和力，而且這種親和力受金屬離子的影響相對(duì)較小。而酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)max值通常隨著所研究的材料的生物量濃度或不同物質(zhì)的富集程度而顯著變化，例如，各種磷酸酶的max值在植物材料中比在土壤、動(dòng)物糞便和污水污泥中大得多。對(duì)max值產(chǎn)生顯著影響的抑制劑濃度也會(huì)有很大差異。例如，Cu2+對(duì)活性污泥中堿性磷酸酶的抑制模型與土壤中游離和固定化酸性磷酸酶的抑制模型相似，但Cu2+對(duì)活性污泥中堿性磷酸酶的抑制濃度(0.1 ~ 2.5 mmol/L)明顯高于土壤的(0.1 ~ 0.4 mmol/L) 。這可能是由于活性污泥中生物量或磷酸酶的濃度較高[22]。而我們研究的稻田自然生物膜的生物組成可能與活性污泥中微生物群落的復(fù)雜性更加相似。

4 結(jié)論

1)不同金屬離子對(duì)稻田自然生物膜酸性或堿性磷酸酶具有不同的作用，有可能抑制、激活或無(wú)明顯作用，這種作用因金屬離子的種類、濃度和磷酸酶類型而異。

2)金屬離子影響自然生物膜中磷酸酶活性，主要通過(guò)改變酸性或堿性磷酸酶與底物的親和力和催化效率，以及影響磷酸酶基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

3)自然生物膜中磷酸酶對(duì)底物有很強(qiáng)的親和力，金屬離子對(duì)這種親和力的影響較小。而且由于自然生物膜本身是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，因此抵御金屬離子毒性的作用也明顯強(qiáng)于單一微生物種群。

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Effects of Metal Ions on Phosphatase Activity of Periphytic Biofilm in Paddy Fields

CAI Shujie1,2, DENG Kaiying1, LI Jiuyu1*, XU Renkou1

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The effects of metal ions on acidic and alkaline phosphatase (ACPase and ALPase) activities and kinetic parameters of periphytic biofilm in paddy fields were studied. The results suggested that both K+and Na+had no significant effect on ACPase and ALPase activities in the concentration range of 0-1.0 mmol/L while both Ca2+and Mg2+had activating effects on ACPase and ALPase activities, which increased phosphatase activity by 14.1% and 46.7%, respectively. The metal ions of Zn2+, Cu2+, Mn2+, Al3+and Ag+all had inhibitory effect on ACPase and ALPase activities. While Co2+could promote ACPase and ALPase activities at low concentration, but inhibit them at high concentration. And Cr6+promoted ACPase activity at 0.1 mmol/L, while inhibited ACPase activity in the concentration range of 0.25-1.0 mmol/L. The addition of Mg2+enhanced the affinity and catalytic efficiency of ACPase with substrates. The inhibitory effect of Cu2+on ACPase and ALPase activities was mainly considered as non-competitive inhibition. Although Zn2+increased the affinity of ACPase with substrate, it reduced the affinity and catalytic efficiency of ALPase with substrate. The effect of metal ions on enzyme activity varied with the type and concentration of metal ions, and the type of phosphatase. It is mainly achieved by binding with the site or substrate of enzyme activity, changing the affinity between enzyme activity and substrate, and influencing the expression of enzyme genes. The results can provide a theoretical basis for assessing the role of periphytic biofilm in the biogeochemical cycle of phosphorus in paddy fields, and the possible risk of heavy metal contamination in paddy fields.

Periphytic biofilm; Phosphatase activity; Metal ions; Enzyme kinetic constant;Paddy fields

S511

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.03.015

蔡述杰, 鄧開(kāi)英, 李九玉, 等. 不同金屬離子對(duì)稻田自然生物膜磷酸酶活性的影響. 土壤, 2020, 52(3): 525–531.

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)青年科學(xué)家專題(2015CB158220)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41877102)和中國(guó)科學(xué)院創(chuàng)新交叉團(tuán)隊(duì)和創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)項(xiàng)目(2014272)資助。

(jyli@issas.ac.cn)

蔡述杰(1992—)，男，福建寧德人，碩士研究生，主要從事稻田土壤界面化學(xué)研究。E-mail: sjcai@issas.ac.cn