髓樣鋅指1 對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用

牛永莉， 賈曉波， 王 艷

（1.甘肅酒泉市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)輔助生殖專科，酒泉 735000； 2.甘肅酒泉市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，酒泉 735000）

宮頸癌是最常見的五大婦科腫瘤之一，每年全世界宮頸癌的發(fā)病人數(shù)約為50 萬(wàn)[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，人類乳頭瘤病毒（HPV）感染是導(dǎo)致宮頸癌的重要原因，基因變化導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定則是宮頸癌發(fā)生的重要機(jī)制。有研究[3]表明，宮頸癌細(xì)胞染色體變化是非隨機(jī)的，而宮頸癌細(xì)胞染色體頻繁雜合性缺失，抑癌基因可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移主要包括細(xì)胞遷移、侵襲、黏附以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的降解，且與 MMP-2 和 MMP-9 高表達(dá)相關(guān)[4-5]。此外，宮頸癌上皮內(nèi)瘤病變（CIN）程度增加，MMP-2 表達(dá)也逐漸增加，這一現(xiàn)象表明MMP-2 過(guò)度表達(dá)可能引起潛在的腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移[6]。髓樣鋅指1（MZF1）基因是C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子Kruppe 家族的一員[7]，MZF1 參與造血和非造血細(xì)胞的分化、遷移和增殖[8]，抑制MZF1 表達(dá)則能夠抑制人肝細(xì)胞癌增殖、遷移和入侵[9]。然而，在高侵襲性的宮頸癌細(xì)胞中，MZF1 是如何調(diào)節(jié)MMP-2 表達(dá)的分子機(jī)制尚不是十分清楚。我們將考察MZF1 抑制人類宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲的作用機(jī)制，并探究MZF1 如何影響MMP-2 表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系、質(zhì)粒 人子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa購(gòu)于美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，本課題組前期已成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-MZF1），并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。

1.1.2 試劑 MZF1 抗體、MMP-2 抗體、MMP-9抗體以及β-actin 抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司）；Jet-PEI 轉(zhuǎn)染試劑（法國(guó) PolyPlus 公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；RT-PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；實(shí)驗(yàn)所需引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)并合成，實(shí)驗(yàn)所用其他試劑購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 將人子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa 細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）中，在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、溫度為 37 ℃的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將 SiHa 細(xì)胞［（1～5）×105］接種于 100 mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿的70%時(shí)，用Jet-PEI試劑，將pcDNA-MZF1（MZF1）轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0（Neo）作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48 h，過(guò)度表達(dá)Neo 或MZF1 的SiHa 細(xì)胞以1∶10 的分流比傳代，經(jīng) G418（800 μg·mL-1）篩選抗性克隆，通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)量，Western blot 分析檢測(cè)目的基因表達(dá)產(chǎn)物，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

1.2.2 RT-PCR 實(shí)驗(yàn) 利用Trizol 提取法從Neo或MZF1 高表達(dá)的SiHa 細(xì)胞中分離總RNA。根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。MZF1 引物 For：5’-AGGTCCAGGTAGTGTAAGCCCT-3’，Rev：5’- ACTCTCCGATGCTCTTCCAG-3’。內(nèi)參 β-actin 作為對(duì)照，引物序列 For：5’-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC -3’，Rev：5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3’。通過(guò) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物，EB 染色后，用Quantity One 軟件檢測(cè)條帶的灰度值，以目的基因與內(nèi)參的比值作為MZF1 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn) 提取過(guò)度表達(dá)Neo 或MZF1 的SiHa 細(xì)胞蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取含等量蛋白質(zhì)（30 μg）的提取物進(jìn)行SDSPAGE 電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜（Millipore，美國(guó)），5%脫脂奶粉封閉，加入稀釋后的一抗，4°C 孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3 次，HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，經(jīng)ECL 顯色，在暗室內(nèi)曝光，顯影。用Quantity One 軟件分析目的條帶的灰度值，比較蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞活性分析 通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Neo或MZF1 高表達(dá)的SiHa 細(xì)胞活性。將狀態(tài)良好的SiHa 細(xì)胞用胰酶消化后，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，以8000 個(gè)/孔接種于96 孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 或48 h。各孔加入10 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），孵育 4 h，棄去上清，加入 150 μL DMSO，置于搖床上搖動(dòng)混勻20 min，在490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 將高表達(dá)Neo 或MZF1的SiHa 細(xì)胞用不含EDTA 的胰酶消化后，低速離心，去上清收集細(xì)胞，4 °C 預(yù)冷的PBS 洗滌2次，加入70% 冰乙醇，在4 ℃冰箱固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞再經(jīng)PBS 洗滌2 次，加入500 μL 含50 μg·mL-1碘化丙啶（PI），100 μg·mL-1RNase A，0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液重懸細(xì)胞，避光孵育30 min。通過(guò)FACSCalibur 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布情況。

1.2.6 MMPs 活性檢測(cè)的明膠酶譜法 從Neo或MZF1 高表達(dá)的SiHa 細(xì)胞中提取的蛋白用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（含有0.1%明膠）分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于含2.5% Triton X-100 的洗脫液中震蕩洗滌2 次，每次45 min，接著用漂洗液（除不含Triton X-100，其余同洗脫液）漂洗2 次，每次20 min，然后在緩沖溶液［（pH 8.8 50 mM Tris-HCl、5 mM CaCl2和 0.02%（w/v）NaN3］中于37°C 孵育42 h。孵育結(jié)束后，用染色溶液（0.1%考馬斯亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸）將凝膠染色1 h，脫色液（30%甲醇、10%乙酸）脫色，在暗色背景下可觀察到MMP-2 和MMP-9 清晰的染色條帶。通過(guò)凝膠經(jīng)成像系統(tǒng)記錄后，使用Quantity One 軟件進(jìn)行灰度值分析，比較MMPs 的表達(dá)差異。

1.2.7 細(xì)胞的遷移和侵襲檢測(cè) 將8 μm 孔徑的聚碳酸酯膜置于Boyden 小室的上下室之間。下室充滿含20% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa 細(xì)胞，消化離心，以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入Boyden 小室的上部，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽將上室內(nèi)未穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞輕輕擦掉，甲醇固定10 min，并用 0.05% Giemsa 染色 30 min，PBS 緩沖液清冼至無(wú)殘留物，并吹干，在200 倍鏡下，觀察遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，隨機(jī)取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值，記錄數(shù)據(jù)，分析細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞侵襲檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前先將Matrigel 基質(zhì)膠4 ℃過(guò)夜融解，在冰上用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋成1 mg·mL-1的混懸液，在加入細(xì)胞懸液前，聚碳酸酯微孔膜表面鋪上100 μL 的Matrigel 基質(zhì)膠混合液，其余實(shí)驗(yàn)過(guò)程與遷移檢測(cè)方法一致，通過(guò)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞的侵襲能力，即顯微鏡下對(duì)遷移和侵襲的細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，技術(shù)一定面積下結(jié)晶紫染色的細(xì)胞，將單個(gè)視野下技術(shù)細(xì)胞的平均值除以單個(gè)視野的面積，再乘以transwell 小室的總生長(zhǎng)面積，即得到遷移或侵襲的總細(xì)胞數(shù)。用遷移或侵襲的總細(xì)胞數(shù)除以接種的初始細(xì)胞數(shù)，即得到遷移率和侵襲率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 高表達(dá)的Neo 或MZF1 與SiHa 細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)

培養(yǎng)轉(zhuǎn)染Neo（pcDNA）或 MZF1 表達(dá)載體（pcDNA-MZF1）的SiHa 宮頸癌細(xì)胞，選擇一個(gè)在蛋白水平（圖1A）和mRNA 水平（圖1 B）穩(wěn)定高表達(dá)MZF1 的單克隆細(xì)胞系。以MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)MZF1 對(duì) SiHa 細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，MZF1 的過(guò)度表達(dá)并不影響SiHa 細(xì)胞的生存能力（圖2A）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的周期分布，確定MZF1 高表達(dá)是否影響SiHa 細(xì)胞增殖，結(jié)果證明，高表達(dá)的Neo 或MZF1 并不影響SiHa 細(xì)胞增殖（圖2B）。

2.2 MZF1 過(guò)表達(dá)抑制SiHa 細(xì)胞的侵襲

通過(guò)細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究MZF1 在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pcDNA-MZF1（MZF1）細(xì)胞株比 pcDNA（Neo）細(xì)胞運(yùn)動(dòng)減少了70%（P<0.05）。由此可見，MZF1 過(guò)度表達(dá)減弱了 SiHa 細(xì)胞的遷移能力（圖3A）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，過(guò)度表達(dá)MZF1 的SiHa 細(xì)胞穿過(guò)Matrigel 基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少了80%（圖3B）。說(shuō)明過(guò)度表達(dá)MZF1 減少人子宮頸鱗癌SiHa 細(xì)胞的侵襲性。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 Neo 或 MZF1 的 SiHa 細(xì)胞 MMP-2 蛋白和 mRNA 水平及 MMP-2 和 MMP-9 活性

Western blot 結(jié)果表明：在過(guò)度表達(dá)MZF1 的SiHa 細(xì)胞中，MMP-2 的蛋白表達(dá)明顯減少（圖4A）。RT-PCR 分析結(jié)果表明：高表達(dá)的MZF1 同樣抑制了MMP-2 的mRNA 水平（圖4B）。此外，通過(guò)明膠酶譜法檢測(cè)了MMP-2 和MMP-9 的活性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高度表達(dá)的MZF1 只抑制MMP-2 的活性，并沒有對(duì)MMP-9 的活性產(chǎn)生影響（圖4C）。綜上所述，過(guò)度表達(dá)的MZF1 抑制了MMP-2 的表達(dá)，但卻不影響MMP-9 的活性。

3 討論

盡管MZF1 與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲密切相關(guān)，但在人類宮頸癌發(fā)展過(guò)程的作用機(jī)制尚未闡明。因此研究MZF1 在宮頸癌中的生物特征、生物學(xué)功能和分子作用機(jī)制具有重要意義。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)建立MZF1 穩(wěn)定過(guò)度表達(dá)的SiHa細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MZF1 抑制了MMP-2 的表達(dá)和活性，說(shuō)明MZF1 對(duì)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用。

已有研究[10]表明，在乳腺癌細(xì)胞中，ErbB2 誘導(dǎo)組織蛋白酶B 表達(dá)，增加癌細(xì)胞的侵襲能力，這一現(xiàn)象關(guān)鍵在于ErbB2 激活MZF1，MZF1 結(jié)合到ErbB2 的增強(qiáng)子原件——組織蛋白酶B 的第一內(nèi)含子，從而使組織蛋白酶B 激活，并通過(guò)ErbB2 下游的 PAK4、Cdc42bpβ、PKCα、ERK 等激酶發(fā)揮作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程。研究[11]發(fā)現(xiàn)，高度表達(dá)的MZF1 抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的形成，并反式激活A(yù)xl 啟動(dòng)子，引起基因表達(dá)，誘發(fā)實(shí)體瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的潛力。應(yīng)用MZF1 基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)其在體外可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，在體內(nèi)可抑制肝細(xì)胞腫瘤形成。因此，MZF1 被認(rèn)為是潛在的致癌基因，影響癌癥發(fā)生和發(fā)展。在裸鼠移植瘤模型中，缺乏MZF1 的裸鼠發(fā)生腫瘤的概率增加，說(shuō)明MZF1可能抑制腫瘤發(fā)生[7]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，MZF1 在宮頸癌和結(jié)腸癌中具有雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，過(guò)表達(dá)MZF1 可通過(guò)結(jié)合Axl 基因啟動(dòng)子抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及侵襲、內(nèi)滲、擴(kuò)散、附屬組織增長(zhǎng)等階段。腫瘤侵入細(xì)胞外基質(zhì)是關(guān)鍵的一步，侵襲使腫瘤細(xì)胞具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。蛋白水解酶MMP-2、MMP-9直接參與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。在眾多腫瘤中，如宮頸癌，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MMP-2 與預(yù)后因素相關(guān)[13]。通過(guò)Western blot 以及RT-PCR實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)過(guò)度表達(dá)MZF1 細(xì)胞的MMP-2 水平進(jìn)行了檢測(cè)：MZF1 高表達(dá)明顯下調(diào)了SiHa 細(xì)胞內(nèi)源性MMP-2 的蛋白表達(dá)和mRNA 水平。明膠酶譜法結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)MZF1 過(guò)度表達(dá)抑制了MMP-2 活性。雖然MMP-9 對(duì)宮頸癌細(xì)胞的侵襲也起著重要作用，但令人驚訝的是，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Neo 或 MZF1 細(xì)胞中，MMP-9 表達(dá)水平及活性保持不變。由此可見，MZF1 可能通過(guò)抑制MMP-2 表達(dá)活性，減弱SiHa 細(xì)胞遷移和侵襲的能力。

總之，本研究證明了過(guò)度表達(dá)的MZF1 抑制了MMP-2 的活性及基因表達(dá)，導(dǎo)致人類宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲受到抑制，下一步工作我們將深入研究在宮頸癌細(xì)胞中MZF1 通過(guò)何種信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)MMP-2 基因表達(dá)。