載PaMZ/nHA 抗結核人工骨的最優(yōu)配方篩選

唐學峰， 劉昌昊， 于樹印， 曾慶豐， 施建黨

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.西安點云公司，西安 710000； 3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院脊柱骨科，銀川 750004）

脊柱結核病灶局部藥物濃度過低及病灶清除術后骨缺損修復材料不足是脊柱結核病灶難以治愈及容易再燃的主要原因，如何增加病灶局部藥物濃度及有效修復重建病灶骨缺損，促進病灶愈合是臨床思考的難題[1]。局部應用載抗結核藥緩釋植骨材料有望同時解決上述難題[2]。本研究選擇了最新三聯(lián)抗癆藥物組合PaMZ［Pa-824（Pretomanid，Pa）、莫西沙星（Moxifloxacin，M）、吡嗪酰胺（Pyrazinamide，Z）］及納米羥基磷灰石（nanohydroxyapatite，nHA），設計并 3D 打印了載藥 PaMZ/nHA 抗結核人工骨用于脊柱結核的病灶治療。Pa是通過抑制細菌霉菌酸和蛋白合成來殺滅結核桿菌，在無氧和有氧條件下都可以高效殺滅結核桿菌，有出色的組織滲透性[3]，對耐藥結核桿菌有高度的敏感性[4]，PaMZ 對多重耐藥性結核病有理想的治療效果[5]。如何使載藥人工骨既能滿意釋藥，又能滿足支撐強度是人工骨制作中必須首先回答的問題。載藥人工骨的藥物配比及不同孔徑對釋藥均有影響，亦對3D 打印人工骨壓縮強度產(chǎn)生影響，在確保足夠強度的前提下，確定材料不同孔徑及不同載藥量的配比是此部分研究的關鍵。本研究通過對不同孔徑nHA 與不同含量的PaMZ 藥物構成的9 種載藥抗結核人工骨的釋藥性能和抗壓縮強度測試，篩選出最優(yōu)藥物配比和孔徑的載PaMZ 的nHA 抗結核人工骨。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

高效液相色譜儀（安捷倫公司）；RGM-G010電子萬能材料試驗機（深圳市瑞格爾儀器有限公司）；AL-204 電子天平（上海梅特勒有限公司）；QL-861 渦旋混合器（中國其林貝爾儀器制造公司）；納米羥基磷灰石晶須粉體、羥基磷灰石粉體（西安點云公司）；聚乳酸-羥基乙酸（poly lactic co glycolic acid，PLGA）75/25OH（濟南岱罡生物工程有限公司）；二氯甲烷（徐州天鴻化工有限公司）、丙酮（煙臺市雙雙化工有限公司）、無水乙醇（天津市天力化學試劑有限公司）；Pa 樣品（美國MedChemExpress 公司）、M（大連美侖生物技術有限公司），Z（大連美侖生物技術有限公司）；3D 打印機（西安點云公司）。聚乙烯醇（PVA）（天津光復精細化工研究所）。Pa 標準品（廈門慧嘉生物技術有限公司）；M 標準品（大連美侖生物技術有限公司）；Z 標準品（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜級）（Fisher chemical 公司）。

1.2 材料制備

1.2.1 nHA 漿料的制備 nHA 和納米羥基磷灰石晶須按照1∶10 的比例混勻，加入一定比例的PVA 粘接劑，將三者混勻充分后備用。

1.2.2 制備PaMZ-PLGA 固體分散體溶液 分別制備3 種不同的固體分散體溶液，Pa 加到丙酮中渦旋溶解形成溶液a；PLGA 加入到二氯甲烷渦旋溶解形成溶液b，M、Z 加入到無水乙醇中渦旋溶解形成溶液c，將a、b、c 溶液充分混合后，加熱到70 ℃，待揮發(fā)至少量時，降低溫度至25 ℃，將該固體分散體黏稠液體加入到上述制備的nHA漿料中混勻，準備行3D 打印。

1.2.3 載抗癆藥人工骨的3D 打印 按照是否載藥分為載藥和非載藥人工骨組，按照孔徑及載藥量不同，載藥人工骨分為 A、B、C、D、E、F、G、H、I組（共 9 組），非載藥人工骨分為 J、K、L 組（共 3組）。將上述配制的混勻漿料加入到3D 打印機中進行常規(guī)打印。

1.2.4 載PaMZ/nHA 3D 打印人工骨大體形態(tài)學觀察 載藥組為長方體狀，呈奶白色，質韌而硬，表面粗糙，可以看到孔隙，非載藥組，長方體狀，呈白色，質硬，表面粗糙（圖1）。

1.3 實驗分組

設計的支架體積為10 mm×8 mm×8 mm，孔徑分別是 200、400 和 600 μm，孔隙率 60%，實驗組（載PaMZ 的3D nHA 抗結核人工骨組）根據(jù)上述不同孔徑、不同載藥量制作成不同人工骨分為9 組，即 A、B、C、D、E、F、G、H、I 組，根據(jù)藥物配比分為 3 個組，藥物配比 6∶12∶45∶95 為實驗組 1（A、B、C 組），藥物配比 4∶12∶45∶244 為實驗組 2（D、E、F 組），藥物配比 3∶12∶45∶140 為實驗組 3（G、H、I 組）。對照組（非載藥的 nHA 人工骨）根據(jù)上述不同孔徑制作成非載藥人工骨分為3組 ：J、K、L 組 中 加 入 nHA 混 合 物 總 量 均 為429.59 mg。將人工骨冷凍干燥后，鈷60 滅菌后保存?zhèn)溆茫ū?）。

1.4 抗壓縮強度的測定

將制備好的底面邊長為8 mm、高度為10 mm的長方體載藥或不載藥人工骨共9 組，依次固定在電子萬能材料試驗機上，將壓縮沖頭的速度設置為1 mm·min-1，施加不同的載荷于樣品上，直到樣品在垂直方向壓縮至 80%停止，以載荷-位移曲線中載荷下降時最大載荷時的壓強確定為各人工骨的最大抗壓縮強度。每組均做3 個，記錄每次測量值。

表1 不同載藥配比人工骨重量的比較

1.5 高效液相色譜對載PaMZ/nHA 抗結核人工骨釋藥性能進行觀察

1.5.1 建立色譜條件及標準曲線 采用色譜柱：GL sciences WondasilTM C18superb 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長 250 nm；柱溫 40℃；進樣量10 μL。流動相條件為：甲醇-0.1%的冰乙酸，流速為1 mL·min-1，梯度出峰進樣。利用Pa標準品分別配置 0.1～10 μg·mL-1之間的濃度，M分別配置 0.1～1000 μg·mL-1之間的濃度，Z 分別配置 0.1～2000 μg·mL-1之間的濃度。按照上述的色譜條件進行測定，記錄峰面積。以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）。將呈線性的點連接，形成標準曲線方程（表2）。

表2 PaMZ 標準曲線方程

1.5.2 載PaMZ/nHA 抗結核人工骨釋藥性能的觀察及參數(shù)的測定 分別將上述的9 種不同的載藥人工骨（A～I 組）裝入一端扎好的透析袋中，注入2 mL 磷酸鹽緩緩沖液（pH=7.4）液，將另一端扎緊，置入裝有5 mL PBS 液的離心管中，在37 ℃下，以100 r·min-1的水浴搖床中進行體外釋藥試驗。于 1、4、8、12、24、36 和 48 h 取樣，第 3天及第3 天以后每天同一時間段取樣，3 d 后的取樣時間為第 4、5、7、11、14、21、28、35 和 42 天（6 周）。取樣于-20℃密封、凍存待檢。同時補充5 mL 新鮮PBS 液于離心管中。將所取的樣品經(jīng)過 0.22 μm 的微孔濾膜過濾后，取 10 μL 利用前面建立的液相條件進樣記錄峰面積，并根據(jù)標準曲線方程計算出濃度、累積釋藥率。

1.6 統(tǒng)計學方法

結果數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析，所有計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用F 檢驗，孔徑及藥物配比的比較采用 2×2 析因設計方差分析，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人工骨抗壓縮強度測定結果

不同孔徑非載藥人工骨的最大抗壓強度間的差異無統(tǒng)計學意義（F=2.532，P=0.160），表明非載藥人工骨的最大抗壓強度和孔徑無關（表3）。同孔徑載藥和非載藥人工骨的最大抗壓縮強度間的差異無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）（表3）。表明nHA 的人工骨的最大抗壓強度和是否載藥無關。藥物配比及孔徑兩因素析因設計的方差分析中，不同藥物配比人工骨的最大抗壓縮強度間差異有統(tǒng)計學意義（F=18.873，P＜0.001）（圖 2），表明各組中載藥人工骨的最大抗壓縮強度和藥物配比有關。其中 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實驗組3）的最大抗壓縮強度高于其余實驗組（P均＜0.01）（圖 2）。表明 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實驗組3）的最大抗壓縮強度最大。不同PLGA 含量的人工骨的最大抗壓強度間的差異有統(tǒng)計學意義（F=18.873，P＜0.001），表明各組中載藥人工骨的最大抗壓縮強度和人工骨中PLGA的含量有關，其中，PLGA20.95%的載藥人工骨（3∶12∶45∶140）（實驗 3 組）的最大抗壓強度高于其余實驗組（P 均＜0.01），表明載藥人工骨中PLGA含量20.95%的人工骨最大抗壓強度是最大的。

2.2 載藥人工骨的Pa、M、Z 的釋藥性能分析

記錄不同組別載藥人工的釋藥情況（表4），9 組載藥人工骨間的6 周Pa 釋藥率間的差異有統(tǒng)計學意義（F=8.449，P＜0.001）（圖 3），其中 G組Pa 的6 周累積釋藥率均低于除B 組外的其他各組（P 均＜0.05 或＜0.01）；B 組的 Pa 的 6 周累積釋藥率低于除C、G 組外的其余各組（P 均＜0.05或＜0.01）；B、G 組間 Pa 釋藥率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B、G 組間 Pa 釋藥率相對較低，G 組的Pa 釋藥率9 組中最小的是16.74%。

表3 非載藥人工骨和載藥人工骨抗壓強度的比較（，MPa）

表3 非載藥人工骨和載藥人工骨抗壓強度的比較（，MPa）

組別 n 不同孔徑支架抗壓強度 F 值 P 值200 μm 400 μm 600 μm非載藥 3 6.40±0.18 5.85±0.15 7.64±1.71 2.532 0.160載藥 9 6.01±0.80 6.24±1.98 6.19±2.24 0.068 0.934 t 值 0.641 0.28 0.981 P 值 0.442 0.271 0.343

表4 不同組別載藥抗結核人工骨中PaMZ 各藥的釋藥情況比較

2.3 孔徑和藥物配比兩因素析因設計釋藥率的方差分析

孔徑和藥物配比兩因素設計的釋藥率方差分析中，不同孔徑載藥人工骨的Z 和M 關鍵點（釋藥1、8、12 和24 h）釋藥率總和間差異無統(tǒng)計學意義（F=0.7859，P=0.4708），表明各組中載藥人工骨的釋藥率與孔徑無關。藥物配比間的差異有統(tǒng)計學意義（F=6.525，P=0.0074）（圖 4）。表明各組中載藥人工骨的釋藥率和藥物配比有關，其中，藥物配比 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實驗組3）的釋藥率是最小的，其和 6∶12∶45∶95（實驗組1）及 4∶12∶45∶244（實驗組 2）的比較差異有統(tǒng)計學意義（P 均<0.01）（圖 4）。

2.4 孔徑和藥物配比兩因素析因設計釋藥時間的方差分析

孔徑和藥物配比兩因素的釋藥時間的方差分析中，不同藥物配比的Z 和M 的釋藥率90%時的釋藥時間總和之間的差異有統(tǒng)計學意義（F=7.449，P=0.0044）（圖 4），表明各組載藥人工骨的親水性藥物釋藥時間與藥物配比有關。其中，藥物配比 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實驗組 3）的親水性藥物釋藥時間最長，和 4∶12∶45∶244（實驗組 1）及 6∶12∶45∶95（實驗組 2）比較差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01）（圖 5）。A～I 組的載藥人工骨孔徑和藥物配比兩因素析因設計的Z 和M 釋藥率90%的釋藥時間總和的方差分析中，實驗組1、實驗組2 均與實驗組3 的差異有統(tǒng)計學意義。其中，實驗組3 的Z 和M 釋藥率為90%的釋藥時間之和最大。

2.5 最優(yōu)載藥人工骨的篩選結果及其釋藥曲線

以最大抗壓強度為載藥人工骨的篩選指標，最佳載藥人工骨為實驗組3，以釋藥性能為載藥人工骨的篩選指標，最佳載藥人工骨為G 組，因而，以最大抗壓強度和釋藥性能為總的篩選條件得出最佳載藥人工骨為G 組。G 組的釋藥曲線如圖6。

3 討論

3D 打印的載藥nHA 支架可望解決脊柱結核病灶局部濃度不足及植骨材料缺乏的臨床難題。nHA 是構建骨組織工程支架的理想材料，3D打印可以設計nHA 的孔徑及孔隙率。3D 打印后的多孔結構材料機械強度必然下降[6-9]。如何在孔結構和強度之間進行調節(jié)，快速成型技術可以解決這一難題[10]；如何在材料載藥后確保nHA 支架足夠的支撐強度，確定材料最優(yōu)的的孔徑及合適的藥物配比是成為人工骨制作中首要解決的問題。

3.1 最佳強度時配比的確定

本研究觀察9 組載藥PaMZ 的nHA 抗結核支架中，藥物輔料配比 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實驗組3）的人工骨具有最優(yōu)的抗壓縮強度，表明PLGA 占支架20.95%時，載藥人工骨的抗壓縮強度最大。在孔徑相同的情況下，載藥和非載藥的人工骨的最大抗壓縮強度無差別，說明加入藥物PaMZ 的載藥人工骨的最大抗壓縮強度和非載藥人工骨的基本相同，孔隙率60%時的人工骨既確保了載藥人工骨植入骨缺損處的支撐作用，又確保了在骨缺損處的成骨和足夠的藥物濃度。

在脊柱結核病灶局部治療中，人工骨需要有一定孔隙率和足夠載藥量，才能滿足長程、緩慢釋藥的要求。而本組載藥支架的孔隙率盡可能達到松質骨孔隙率的50～90%[11]。而松質骨的抗壓強度2～12 MPa[10]。本研究所制備的載PaMZ 的3D nHA 抗結核支撐人工骨能夠滿足以上條件，具有較高的60%孔隙率，抗壓強度較大，平均6.17 MPa，承載足量的抗結核藥物，可以滿足支撐植骨的要求。

3.2 PLGA 對人工骨強度有加強作用

多孔HA 的抗壓強度很低，多孔HA 的支架強度為0.88 MPa 左右[12]。常難以達到支撐植骨。本組研制的載藥多孔HA 抗壓強度，平均達6.17 MPa，非載藥多孔HA 最大抗機械壓縮強度平均為7.06 MPa，明顯高于多孔HA，達到松質骨的強度。理論上HA 支架加入大比例抗結核藥物后抗壓強度將下降[13]，但本研究采用的nHA 加入三種藥物總量百分比從5.99%增加到11.93%，載藥人工骨的抗壓強度卻無明顯下降，究其原因，我們認為PLGA 抵消了加入藥物所造成機械強度的下降，當載藥輔料PLGA 從17.99%增加到20.95%，載藥人工骨的最大壓縮強度逐漸增大，從20.95%增加到23.94%時，載藥人工骨的最大抗壓縮強度逐漸下降，說明PLGA 增加了材料的機械強度，并且在PLGA 質量比為20.95%時，機械強度最大，隨后又開始下降。Chen 等[14-18]認為，PLGA 可增強磷酸鈣骨水泥的機械強度，機制是PLGA 強化了nHA 晶體矩陣，減少了HA 孔壁的裂隙缺陷數(shù)目，改善了脆性nHA 基質的機械穩(wěn)定性。HA孔隙表面上缺陷的減少導致機械強度的增加[15]。但當濃度過大時，PLGA 強度畢竟遠小于nHA，并使nHA 晶體間分布過于松散，最大抗機械壓縮強度就會開始變小。

3.3 最佳釋藥性能時配比的確定

本研究觀察9 組載藥PaMZ 的nHA 人工骨在體外釋藥時，其中G 組釋藥最佳，Pa 釋藥6 周遠遠未達到完全釋放，緩釋效果很好。Pa 是脂溶性藥物，在磷酸鹽緩釋液中緩釋效果相對較好，Z和M 是偏水溶性藥物，會出現(xiàn)明顯的突釋，如能增加Z 和M 的釋藥時間和減少二者關鍵點（釋藥 1、8、12 和 24 h） 的釋藥率，PaMZ 復合配方就是最佳的。本研究結果顯示，G 組Pa 釋藥時間最長，Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實驗組 3）的載藥人工骨關鍵點（釋藥 1、8、12 和 24 h）上 Z 和 M的釋藥率總和是最小的，該組Z、M 的釋藥時間也是最長的，唯有G 組Pa 在釋藥2 周、Z 在釋藥24 h、M 在釋藥120 h 的藥物平均濃度均高于各自藥物10 倍的最低抑菌濃度。Z、M、Pa 的體外藥物最 低 抑 菌濃 度 分 別 是 2[19]、0.025 ～0.5[20]和0.015～0.25 μg·mL-1[3]。因而同時滿足 Pa 優(yōu)良釋藥率、Z 和 M 的關鍵點（釋藥 1、8、12 和 24 h）釋藥率總和最小、最大Z 和M 的釋藥率90%時的釋藥時間總和、10 倍的MIC 的只有G 組。

綜上，載PaMZ/nHA 抗結核具有較好的載藥緩釋特性和理想的抗機械壓縮強度，可以滿足脊柱結核術后骨缺損的支撐植骨和局部有效殺菌的要求。研究確定 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140，孔徑200 μm 為最佳，三種藥物釋放均在10 倍最低抑菌濃度以上。支架在較高孔隙率60%時，人工骨抗壓強度可達平均6.17 MPa，達到了松植骨的抗壓強度，能夠滿足骨缺損的椎間支撐植骨要求。PLGA 可增加載藥人工骨的機械抗壓強度，當PLGA 含量達到20.95%時，其抗壓強度最大。