液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1不確定度分析

王玉梅　劉真　孫小杰

摘 要：針對(duì)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定?；贕B 5009.24-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》（第一法）對(duì)牛奶中黃曲霉毒素M1含量進(jìn)行定量分析，評(píng)估檢測(cè)過程中產(chǎn)生不確定度的因素，并量化和合成不確定度分量。結(jié)果顯示液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1含量的不確定度的結(jié)果為（1.181 5±0.05128）?g/kg（K=2）。分析影響因素表明，此檢測(cè)方法中標(biāo)準(zhǔn)溶液及其工作液的制備是影響結(jié)果的最重要因素。

關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法;牛奶;黃曲霉毒素M1;不確定度

黃曲霉毒素M1（AFM1）是含有二呋喃環(huán)的氧雜萘鄰?fù)?，是由黃曲霉毒素B1羥基化衍生而來[1]。AFM1對(duì)酸、光及熱都很穩(wěn)定，主要存在于動(dòng)物的可食部分，比如蛋類、牛奶、肝臟等，其中以牛奶最為常見，目前已經(jīng)成為乳制品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的主要危害因素[2]。AFM1是目前發(fā)現(xiàn)的致癌性較強(qiáng)的毒素之一，它能夠很大程度上破壞人及動(dòng)物的肝臟組織，對(duì)人體產(chǎn)生肝腎等毒性，也存在致畸、致癌、致突變等風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡[3]。本文參照J(rèn)JF 1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[4]、JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[5]，JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》[6]和JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[7]，依據(jù)GB 5009.24-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》（第一法 同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）[8]分析了牛奶中黃曲霉毒素M1含量檢測(cè)的不確定度，以期為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供有力的依據(jù)，同時(shí)也為其他真菌毒素類物質(zhì)測(cè)定的不確定度分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470串聯(lián)四極桿液相色譜質(zhì)譜儀（配制ESI源）;ME503T電子天平（d=0.001 g）;黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品（10.0 μg/mL，純度≥99%，阿爾塔）;13C17-黃曲霉M1標(biāo)準(zhǔn)品（BZYX483）（0.507 μg/mL，純度≥

99.9%，ROMER）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確移取黃曲霉毒素M11.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確移取13C17-黃曲霉毒素M11.00 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成50.7 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液。

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，得到質(zhì)量濃度為0.5、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL與25.00 ng/mL的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為0.507 ng/mL，供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.2.2 樣品前處理

按照GB 5009.24-2016[8]標(biāo)準(zhǔn)方法，稱取4 g混合均勻的試樣（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入

10 μL13C17-AFM1內(nèi)標(biāo)溶液（50.7 ng/mL）振蕩混勻后靜置30 min，加入10 mL甲醇，渦旋3 min。置于4℃、5000 r/min下離心10 min，經(jīng)玻璃纖維濾紙，將適量濾液轉(zhuǎn)移至燒杯中，加40 mL水;將恢復(fù)至室溫的免疫親和柱內(nèi)的液體棄掉，將上述樣液移至50 mL注射器筒中，控制下滴流速為1～

3 mL/min。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入10 mL水，并抽干親和柱，加入2×2 mL乙腈（或甲醇）洗脫親和柱，收集全部洗脫液。在50 ℃下氮吹至近干，用初始流動(dòng)相定容至1.0 mL溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾，待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD，粒度1.8?m，50×2.1mm（內(nèi)徑）;流速：0.3mL/min;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：1?L;流動(dòng)相：A—乙腈;B—0.1%甲酸/水，梯度洗脫程序見表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）;正離子方式檢測(cè)，檢測(cè)方式為多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;定量分析的離子對(duì)為：黃曲霉毒素M1母離子m/z 329.0，定量子離子m/z 272.7，定性子離子m/z 258.7;13C17-黃曲霉毒素M1母離子m/z 346.0，定量子離子m/z 287.9，定性子離子m/z 242.0。

1.2.5 數(shù)學(xué)模型的建立

被測(cè)物殘留量X計(jì)算方法見式（1）。

（1）

式（1）中：X─試樣中黃曲霉毒素M1的含量，?g/kg;C─儀器檢出目標(biāo)物含量，ng/mL;V─溶解試樣或濃縮后所定容的體積，V=1.00 mL;m─試樣質(zhì)量，g;K─凈化過程取樣體積換算系數(shù)，K=1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的來源分析

根據(jù)上述方法對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí)，測(cè)量的不確定度的主要有以下幾個(gè)方面：①儀器檢出目標(biāo)物含量引入的不確定度。包含標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度。②樣品前處理過程引入的不確定度。包括樣品的稱量、添加內(nèi)標(biāo)溶液、量取溶液體積以及加標(biāo)回收率引入的不確定度。③樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度。

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 儀器檢出目標(biāo)物含量引入的不確定度Urel（1）

儀器檢出目標(biāo)物含量的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)品純度、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配置帶來的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制又分為儲(chǔ)備液的配制、儲(chǔ)備液的稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制。

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（1-1）

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品證書提供的信息，黃曲霉毒素M1純度不小于99%，按照矩形分布，由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

內(nèi)標(biāo)物純度≥99.9%，內(nèi)標(biāo)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的影響可相互抵消，因此由內(nèi)標(biāo)物純度引起的不確定度不予考慮。

（2）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配置過程產(chǎn)生的不確定度Urel（1-2）

儲(chǔ)備液配置及工作液稀釋過程產(chǎn)生的不確定度Urel（p）：準(zhǔn)確移取黃曲霉毒素M11.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

在標(biāo)準(zhǔn)溶液配置及工作液稀釋過程中，使用10 mL容量瓶2次，1 mL移液管2次，按照J(rèn)JG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》的要求進(jìn)行計(jì)算。

A級(jí)單標(biāo)線1 mL（V1）移液管最大允許誤差為：±0.007 mL，取矩形分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

U（V1）=0.007/=0.004 041 mL;實(shí)驗(yàn)室溫度為（20±5）℃，有機(jī)溶劑體積膨脹系數(shù)為1.1×10-3/℃，1 mL移液管由溫度引起的體積不確

定度為U（Vt1）=5×1.1×10-3/℃×1/ 0.003175 mL，兩者合成得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

A級(jí)單線10 mL（V2）容量瓶，最大允許誤差為：±0.020 mL。取矩形分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U（V2）=0.020/0.01155 mL;10 mL容量瓶由溫度引起的體積不確定度為U（Vt2）=5×1.1×

10-3/℃×10/ =0.03175 mL，兩者合成得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

由此合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配置及工作液稀釋過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（x）：標(biāo)準(zhǔn)工作液配置過程為分別精密移取5、20、50、100、200 ?L與250 ?L標(biāo)準(zhǔn)工作液至1 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容至刻度，得濃度為0.5、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL與25.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。移液器刻度誤差參考JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》的要求，按照均勻分布處理，標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。

則由標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配置過程中由各分量合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

綜上，由儀器檢出目標(biāo)物含量引入的相對(duì)不確定度為：

。

2.2.2 樣品前處理過程引入的不確定度Urel（2）

（1）樣品稱量引入的不確定度

Urel（2-1）

電子天平校準(zhǔn)的最大允許誤差為±0.001 g，稱取食用油樣品4 g，按矩形分布，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

（2）添加內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度Urel（2-2）

準(zhǔn)確移取13C17-黃曲霉毒素M1儲(chǔ)備液1.00 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成5.07 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液。采用200 ?L移液器準(zhǔn)確量取5.07 ng/mL的13C17-黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)工作液

100 ?L，按照J(rèn)JG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》的要求，10 ?L移液器移取

10 ?L時(shí)允許誤差為±2.0%，取矩形分布，由移液器引入的不確定度為：

。

（3）量取溶液體積引入的不確定度Urel（2-3）

量取體積產(chǎn)生的不確定度主要是最終定容體積引入的不確定度。A級(jí)1 mL單標(biāo)線吸管最大允許誤差為：±0.007 mL，取矩形分布，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

（4）加標(biāo)回收率引入的不確定度Urel（2-4）

對(duì)樣品進(jìn)行8次加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加水平為6.25 μg/kg，回收率分別f為101.2%、98.7%、96.5%、101.8%、103.0%與99.5%（見表3），平均回收率f為99.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.58%，由加標(biāo)回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

綜上，在樣品前處理過程中，各分量合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

對(duì)被測(cè)樣品溶液測(cè)量2次，由回歸方程計(jì)算得到樣品中的黃曲霉毒素M1最佳估計(jì)值（Co），見表4。

2.2.3 樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度Urel（3）

對(duì)同一樣品進(jìn)行前處理和測(cè)定，重復(fù)8次，計(jì)算得到樣品中黃曲霉毒素M1含量分別為6.0092、6.0642、6.0313、5.9624、5.9770、6.0485、5.9953 ?g/kg與5.9776 ?g/kg。

平均值為6.0082 ?g/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0377 ?g/kg。由樣品重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

3 測(cè)量不確定度的評(píng)定與報(bào)告

3.1 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由上述計(jì)算得到的各不確定度分量的數(shù)據(jù)合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

。

3.2 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》，在95.45%的置信水平下，取包含因子k=2，牛奶中黃曲霉M1的測(cè)量平均值為

4.7342 ng/mL，結(jié)合稱樣量m和定容體積V，計(jì)算得到樣品中黃曲霉毒素M1的含量為1.1815 ?g/kg，則擴(kuò)展不確定度為：U=1.1815×0.02170×2=

0.05128 ?g/kg。

3.3 測(cè)定結(jié)果

按照該方法測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量為：X=（1.1815±

0.05128）?g/kg;k=2。

4 結(jié)論

通過本次測(cè)定的不確定度評(píng)定的過程可以看出，使用GB 5009.24-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》（第一法）定量分析牛奶中黃曲霉毒素M1含量時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為（1.1815±0.05128）g/kg，k=2，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液及其工作液的制備對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生的影響最大，所以在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，需要提高檢驗(yàn)人員在標(biāo)準(zhǔn)溶液配置方面的操作技能來提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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作者簡(jiǎn)介：王玉梅（1990—），女，江蘇鹽城人，碩士，工程師。研究方向：食品農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)。