UPLC法測定西洋參保健食品中13種人參皂苷的含量

程燕，譚順中，伍蓉，鄭蓉，熊有明

重慶市萬州食品藥品檢驗所（萬州 404000）

西洋參保健品以西洋參或西洋參提取物為主要原料，是具有滋補或特定保健功能的產(chǎn)品，歸屬于傳統(tǒng)滋補類保健品大類[1-2]。研究表明，人參皂苷是人參的主要藥效成分[3-6]。因此人參皂苷的種類及其含量常用來評價人參的品質(zhì)，也被作為評價人參類保健食品品質(zhì)的主要指標(biāo)。目前測定人參類保健食品功效成分人參皂苷的常用方法為《保健食品檢驗檢測規(guī)范》的紫外分光光度法和高效液相色譜法。紫外分光光度法測定的是總皂苷的含量，該方法前處理復(fù)雜，干擾較大，準(zhǔn)確性差，重現(xiàn)性一般；高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏、重現(xiàn)性好、應(yīng)用范圍廣等特點，但是人參皂苷類成分結(jié)構(gòu)差異多數(shù)在糖的位置和數(shù)量，因此極性非常相近，在一般C18色譜柱上的保留行為相似，難以達到很好的分離，為獲得滿意的分離效果，色譜分析時間在80 min以上。UPLC借助于HPLC的理論和原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積等全新技術(shù)，具有超高速度、超高柱效、超高分離度、高靈敏度等優(yōu)勢，極大地縮短了分析時間。Kinetex F5色譜柱（五氟苯基柱）采用重現(xiàn)性極高的五氟苯基丙基相，完美融合了核-殼性能和疏水性、芳香性、靜電作用、立體/平面結(jié)構(gòu)、氫鍵5種相互作用機理，能夠提供色譜分析中化合物分離所需的極性、疏水性、芳香性和結(jié)構(gòu)選擇性。5種相互作用機理分別為：鏈和苯環(huán)骨架的疏水性，可保留中性/疏水性物質(zhì)；在非乙腈流動相中，碳環(huán)的π-π電子與分析物的π-π電子相互作用，可提升保留效果；高負電性含氟基團產(chǎn)生的偶極矩，有助于保留極性化合物，誘導(dǎo)偶極矩也有助于中性化合物的保留；結(jié)構(gòu)選擇性可以實現(xiàn)傳統(tǒng)烷基相無法實現(xiàn)的異構(gòu)體分離；分析物極性官能團與吸電子的含氟基團相互作用形成氫鍵，從而形成極其有效的保留機制。

試驗采用Kinetex F5柱，建立了UPLC測定西洋參保健食品中13種人參皂苷含量的方法，并對市售的5批西洋參保健食品進行測定，根據(jù)測定結(jié)果，以皂苷總量、Rb1/Rg1的比例和Rf為指標(biāo)評價樣品品質(zhì)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（Waters ACQUITY UPLC）。

人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rg2對照品、人參皂苷Rc對照品、人參皂苷Rb2對照品、人參皂苷Rb3對照品、人參皂苷f1對照品、人參皂苷Rd對照品、人參皂苷f2對照品、人參皂苷Rg3對照品、人參皂苷Rh2對照品；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；超純水。

1.2 色譜條件

Kinetex F5柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）。流動相A為水，流動相B為甲醇。梯度洗脫：0～6 min，83% A→80% A；6～7.5 min，80% A→70% A；7.5～11 min，70% A；11～13 min，70% A→60% A；13～15 min，60% A→21% A；15～20 min，21% A→5%A；；20～21 min，5% A→0% A；；21～22 min，0%A→83% A；22～25 min，83% A→83% A。流速0.4 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長203 nm，進樣量2 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取適量上述13種藥物對照品，分別用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-10 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)溶液液：分別吸取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以初始流動相為稀釋液，配制成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 供試溶液制備

稱取適量供試品，研細，置于50 mL離心管中，加入50 mL 80%甲醇水，超聲20 min，定容至刻度，過0.22 μm濾膜，待測。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性范圍及檢出限

按1.3小節(jié)進行配制質(zhì)量濃度為2～200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積對對照品濃度（μg/mL）進行回歸分析，按S/N=3計算檢出限。13種人參皂苷在2～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998～0.999。檢出限詳見表1。

2.1.2 重復(fù)性和穩(wěn)定性

取6份同一樣品，按1.4小節(jié)處理，進樣分析，測得RSD為1.05%～4.08%，表明該方法重復(fù)性良好。供試品溶液放置1，2，6，12和24 h后分別進樣，13種皂苷峰面積的RSD為0.21%～1.07%，說明在24 h內(nèi)待測組分穩(wěn)定性較好。

2.1.3 回收率

稱取9份同一份已知本底值的樣品，加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按1.4小節(jié)處理，測定加標(biāo)回收率。13種人參皂苷的回收率見表1。

表1 13種人參皂苷的回收率、精密度（n=3）及檢出限

接表1

2.2 實際樣品的測定

2.2.1 單一人參皂苷的含量

應(yīng)用該方法對13批人參類保健食品進行分析測定。5批樣品中，13種人參皂苷的結(jié)果見表1。從單一皂苷成分來看，5批樣品中含量較高的人參皂苷為Rb1，Rb3，Re，f1，Rd，含量較低的為Rg3，基本不含人參皂苷Rh2和Rf。Rb1/Rg1的比值為0.61%～10.64%，Rb1、Rb2、Rc、Re、Rg1、Rd的總和為1.75%～6.75%，詳細數(shù)據(jù)見表2。

2.2.2 原人參二醇型和原人參三醇型人參皂苷的含量

人參皂苷根據(jù)苷元部分的不同可以分為3類：原人參二醇型皂苷，包括Ra1，Ra2，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg3，Rh2，f2，糖苷基PD；原人參三醇型皂苷，包括Re，Rg1，Rf，Rg2，Rh1，f1糖苷基PT；齊墩果酸型皂苷，包括人參皂苷Ro[7-8]。此次試驗將測得的13種人參皂苷按這3種類型分別計算其含量，結(jié)果見表2。5批樣品中4批樣品的原人參二醇型皂苷含量高于三醇型，1批樣品的原人參二醇型皂苷含量略低于三醇型。

表2 樣品測定結(jié)果表

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇

在參考文獻[9]的基礎(chǔ)上，試驗選擇80%甲醇水溶液為提取溶劑，考察了超聲提取和液液萃取2種方法制備供試品溶液。結(jié)果表明，液液萃取方法復(fù)雜且大部分化合物不會顯著提高提取效率，故采用超聲提取制備供試品溶液。

3.2 色譜柱的選擇

結(jié)合人參皂苷類化合物的性質(zhì)和Kinetex F5柱特征，選擇Kinetex F5。經(jīng)改變流動相梯度，13種人參皂苷類化合物能在15 min內(nèi)分析完畢，并全部能達基線分離，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和樣品色譜圖見圖1和圖2。

圖2 樣品色譜圖

3.3 樣品品質(zhì)評價

查閱大量研究人參皂苷分析方法的文獻發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究將皂苷總量和Rb1/Rg1的比例作為人參產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)，此外可用標(biāo)記化合物的存在與否進行種類鑒別[10-14]。通常Rb1/Rg1比值為1～3，這是人參（亞洲人參）的特點[10]，西洋參根提取物Rb1/Rg1比值較大，一般10以上[10]，而西洋參莖葉提取物該比值比較小，有研究表明大都小于1[15]。在皂苷總量方面，美國藥典西洋參和人參根提取物的專論中人參皂苷的總量以人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re、Rg1、Rd的總和計算，使用高效液相色譜-紫外法測定，西洋參根人參皂苷的含量不低于4%。在標(biāo)記化合物的存在與否方面，據(jù)報道人參皂苷Rf不存在于西洋參，可用于排除摻假[10]。

根據(jù)上述指標(biāo)對所測的5批樣品進行品質(zhì)評價。5批樣品均不含Rf，符合西洋參不含人參皂苷Rf這一規(guī)律。此外，樣1和樣5的Rb1/Rg1大于10%，Rb1等6種皂苷的總量超過4%，符合西洋參根部提取物特征；樣2和樣3的Rb1/Rg1的比例為1%左右，符合西洋參莖葉提取物特征。樣4的測定結(jié)果出現(xiàn)一定偏差。樣4出現(xiàn)異常情況，一方面可能跟采用的方法不同有關(guān)，通過大量研究人參皂苷分析方法的文獻發(fā)現(xiàn)，采用不同的方法，定量結(jié)果會出現(xiàn)一定偏差；另一方面也不排除樣4存在品質(zhì)問題。

張玉婷等[15]研究發(fā)現(xiàn)西洋參根提取物、西洋參莖葉提取物中二醇型皂苷含量均高于三醇型，此次試驗樣品測定結(jié)果基本與其一致。

4 結(jié)論

試驗建立了UPLC同時測定人參類保健食品中13種人參皂苷含量的方法。該方法對13種人參皂苷有較好的分離度和柱效。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法具有較好的線性、回收率和精密度，可測定西洋參保健食品中13種人參皂苷。應(yīng)用該方法測定5批樣品，根據(jù)測定結(jié)果，以皂苷總量、Rb1/Rg1的比例和Rf為指標(biāo)評價樣品品質(zhì)，5批樣品中有2批可能含西洋參根，2批為西洋參莖葉。