2種乳酸菌對軍曹魚幼魚生長及消化酶、免疫酶活性的影響

林艾影，王維政，陳 剛，張健東，黃建盛，潘傳豪，施 鋼，謝瑞濤,2，周 暉，湯保貴

2種乳酸菌對軍曹魚幼魚生長及消化酶、免疫酶活性的影響

林艾影1，王維政1，陳 剛1，張健東1，黃建盛1，潘傳豪1，施 鋼1，謝瑞濤1,2，周 暉1，湯保貴1

（1. 廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)魚畜禽飼料重點實驗室，廣東 湛江 524025）

【】研究配合飼料中添加乳酸桿菌和糞腸球菌對軍曹魚幼魚生長、消化酶和免疫酶活性的影響。在基礎飼料中分別按1.0×108、3.0×108、5.0×108cfu/g單獨噴灑乳酸桿菌和糞腸球菌兩種菌，制作6種飼料，投喂初始體質量（10.66±0.09）g的健康軍曹魚幼魚10周，以基礎飼料為對照組，測定幼魚生長性能、消化酶和免疫酶指標。與對照組比，乳酸菌組幼魚餌料系數(shù)降低（< 0.05），增重率和特定生長率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，并顯著高于對照組（< 0.05），乳酸桿菌添加組的增重率和特定生長率整體顯著高于糞腸球菌添加組（< 0.05），在3.0×108cfu/g乳酸桿菌添加組達到最大值；乳酸菌組的淀粉酶（AMS）、胰蛋白酶（TRY）和脂肪酶（LPS）活性均顯著高于對照組（< 0.05）；兩種乳酸菌添加組的超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶（LZM）活性高于對照組，而丙二醛（MAD）活性顯著低于對照（< 0.05）。以噴灑方式在飼料中添加乳酸桿菌和糞腸球菌，可顯著提高軍曹魚的生長性能、消化能力和非特異性免疫力，影響效果與添加量和添加乳酸菌種類有關，乳酸桿菌對軍曹魚的相關作用效果優(yōu)于糞腸球菌，以3.0×108cfu/g乳酸桿菌的效果最佳。

軍曹魚；生長性能；消化酶；非特異性免疫酶；乳酸桿菌；糞腸球菌

軍曹魚() 又稱海鱺、海龍魚，隸屬于鱸形目(Perciformes) 鱸亞目(Perxoidei) 軍曹魚科(Rachycentridae) 軍曹魚屬()，有繁殖能力高、生長快、抗病力強、產(chǎn)量高、肉厚質細、味鮮美等特點[1-4]，是廣東湛江、徐聞，茂名，海南，福建等近海地區(qū)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要品種之一[5]。隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的推廣，養(yǎng)殖密度過大等問題導致軍曹魚病害頻發(fā)。廣譜化學試劑和抗生素的使用可能導致抗生素抗性菌株的產(chǎn)生[6-7]、水體污染或惡化[8]，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中殘留抗生素的積累，危害人類健康[9-10]。因此，在養(yǎng)殖中使用環(huán)境友好的益生菌漸受重視[11]。

乳酸菌是一種重要的益生菌，可提供機體營養(yǎng)物質，促進機體生長[12]，并有效改善機體消化道的微生態(tài)環(huán)境，并通過增加免疫系統(tǒng)免疫分子的調(diào)節(jié)功能（如增加非特異性免疫酶活性）達到提高非特異性免疫的效果[12]。王國霞等[13]在凡納濱對蝦（）飼料中添加不同水平的乳酸菌時發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可顯著提高溶菌酶和血清過氧化氫酶的活性，一定程度上改善凡納濱對蝦的非特異性免疫力。飼料中添加乳酸菌可提高草魚（）[14]、建鯉（var.）幼魚[15]和凡納濱對蝦[13,16]、大菱鲆（）[17]等的生長性能，消化酶和免疫酶活性。有關飼料中添加乳酸菌對軍曹魚生長、消化和免疫等指標影響的研究鮮見報道。本研究以直接噴灑方式在軍曹魚幼魚配合飼料中添加乳酸桿菌和糞腸球菌，探討兩種乳酸菌對幼魚生長性能、消化酶和非特異性免疫酶活性的影響，為益生菌在軍曹魚養(yǎng)殖中高效、合理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與實驗飼料

實驗用乳酸桿菌（sp.）和糞腸球菌（）購自廣東湛江綠百多生物開發(fā)有限公司，粉制劑，分別含活菌1.0×1011、1.0×1010cfu/g。將乳酸桿菌制劑按照質量分數(shù)0.1%、0.3%和0.5%，糞腸球菌制劑按照質量分數(shù)1%、3%、5%溶入中性緩沖液（0.1 mol/L的KH2PO4和0.1 mol/L的Na2HPO4·12H2O按體積比4∶6混合成pH 7.0的磷酸鹽緩沖液），均勻噴灑在基礎飼料表面，即飼料中分別添加1.0×108、3.0×108、5.0×108cfu/g乳酸桿菌和糞腸球菌（分別記為T1-1、T1-2、T1-3、T2-1、T2-2、T2-3組），對照組噴灑相同比例中性緩沖液（記為T0組）。實驗飼料在每天投喂前噴灑，在陰涼通風處稍晾干，置于-20℃冰箱保存?；A飼料為廣東上上生物有限公司的海水魚配合飼料（膨化料），營養(yǎng)成分質量分數(shù)分別約為粗蛋白50%、粗脂肪10%、粗纖維2.5%、粗灰分16%、水分10%、鈣2.0%、總磷18%。

1.2 實驗魚與飼養(yǎng)管理

實驗在廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司863基地室內(nèi)24 h持續(xù)充氣的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)（1 m3樹脂桶）中進行。實驗用水是砂濾海水。實驗魚取自廣東海洋大學湛江東海島海洋生物研究基地。挑選健康無病狀、規(guī)格均一、初始體質量（10.66±0.12）g的軍曹魚幼魚，隨機分為7組，每組3個平行，每個平行25尾，分別置于水體為1 m3的圓桶型養(yǎng)殖水槽內(nèi)暫養(yǎng)1周后進行實驗。每天于8:00、16:00飽食投喂實驗飼料。實驗期間自然光照，水體溶解氧5.6 mg/L以上，氨氮0.02 mg/L以下，pH 7.4 ~ 7.8，水溫29.0 ~ 32.2 ℃，鹽度28 ~ 31，共飼養(yǎng)10周。

1.3 樣品采集與測定

養(yǎng)殖實驗結束后，停飼24 h，每桶分別一次性撈取所有魚，用MS-222麻醉，對實驗魚逐一稱重并計數(shù)。每桶隨機取魚3尾，剖取腸道，剔除腸道外脂肪，用生理鹽水沖洗，分別裝入已編號的凍存管中，迅速放進液氮中，置? 80 ℃超低溫冰箱保存，用于消化酶與免疫酶活性檢測。

腸道樣品分別按每克待測組織加入9 mL生理鹽水的比例置冰上研磨、勻漿，以4 ℃、3 000 r/min條件離心15 min，取上層清液用于酶活性檢測。淀粉酶（AMS）（淀粉-碘比色法）、胰蛋白酶（TRY）（紫外比色法）、脂肪酶（LPS）（甲基試鹵靈底物法）、超氧化物歧化酶（SOD）（WST-1法）、溶菌酶（LZM）（比濁法）、丙二醛（MDA）（TBA法）活性，腸道組織中蛋白含量（考馬斯亮藍法）均用南京建成生物工程研究所的試劑盒按照試劑盒說明書測定。

1.4 相關指標計算

成活率（Survival rate，SR，%）= 終末魚數(shù) / 初始魚數(shù)，

飼料系數(shù)（Feed coefficient ratio，F(xiàn)CR）= 攝食量 /（終末總質量 + 死亡個體總質量 ? 初始總質量），

增重率（Weight gain ratio，WGR，%）= （終末平均體質量 ? 初始平均體質量）/ 初始平均體質量，

特定生長率（Specific growth rate，SGR，%/d）=（ln 終末平均體質量? ln 初始平均體質量）/ 實驗時間。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著(< 0.05) 時進行Duncan多重比較，結果以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 不同乳酸菌對軍曹魚幼魚生長性能的影響

由表1可知，添加質量分數(shù)0.3%乳酸桿菌的T1-2組餌料系數(shù)最低，且除添加質量分數(shù)5%糞腸球菌T2-3組外，各實驗組均顯著低于對照組（< 0.05）；兩種乳酸菌對軍曹魚幼魚的成活率無顯著影響（<0.05）；各乳酸菌實驗組的增重率和特定生長率隨添加量的增加，分別均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，且均顯著高于對照組（< 0.05），在T1-2組達到最大值；乳酸桿菌添加組的增重率和特定生長率整體上顯著高于糞腸球菌添加組（< 0.05）。

表1 不同乳酸菌對軍曹魚幼魚生長的影響

注：同列凡含一個相同字母表示差異不顯著（> 0.05）。

Note: Values within the same column with a same letter mean no significant difference (< 0.05).

2.2 不同乳酸菌對軍曹魚幼魚腸道消化酶活性的影響

由圖1可知，隨乳酸菌添加量的增加，兩種乳酸菌處理組的淀粉酶（AMS）活性分別呈先升后降的變化趨勢，且均顯著高于對照組（< 0.05）；其中，分別在添加質量分數(shù)0.3%乳酸桿菌的T1-2組和3%糞腸球菌的T2-2組達最高值（< 0.05）。脂肪酶（LPS）活性變化趨勢與淀粉酶活性變化趨勢相似，且均顯著高于對照組（< 0.05）。但是胰蛋白酶（TRY）在乳酸桿菌添加組內(nèi)呈上升趨勢，而在糞腸球菌添加組內(nèi)呈先升后降趨勢，均顯著高于對照組（<0.05）；其中添加質量分數(shù)3%糞腸球菌的T2-2組顯著高于其他實驗組（< 0.05）。

凡含一個相同字母表示組間消化酶活性無顯著差異（P > 0.05）

2.3 不同乳酸菌對軍曹魚幼魚腸道免疫酶的影響

由圖2可知，對照組的超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶（LZM）顯著低于其他處理組，丙二醛（MAD）活性顯著高于其他組（< 0.05）；乳酸桿菌處理組中，SOD和LZM的活性隨添加量的增加呈上升趨勢，而糞腸球菌處理中LZM活性隨添加量的增加呈下降趨勢，均顯著高于對照組（< 0.05）；糞腸球菌處理組中SOD活性隨添加量增加呈先降后升的趨勢，各組間差異顯著（< 0.05）；在兩種乳酸菌添加組中，丙二醛活性隨添加量的增加均呈下降趨勢，各組間差異顯著（< 0.05）。

凡含一個相同字母表示組間消化酶活性無顯著差異（P > 0.05）

3 討論

3.1 乳酸菌對軍曹魚幼魚生長性能的影響

乳酸桿菌和糞腸球菌是養(yǎng)殖業(yè)常用的飼料益生菌添加劑，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物有促生長作用[19-20]。本研究表明，飼料中添加乳酸桿菌和糞腸球菌可顯著提高軍曹魚幼魚的增重率和特定生長率，還可顯著降低飼料系數(shù)。其作用效果與兩種乳酸菌添加量有關，在飼料中添加適當比例的乳酸菌方可更好地促進軍曹魚幼魚的生長，添加量過高對軍曹魚幼魚的促生長效果降低，這與草魚[15]、建鯉幼魚[16]和凡納濱對蝦[17]等的研究結果類似?？赡苁沁^量的乳酸菌抑制了軍曹魚幼魚體內(nèi)的其他有益菌生長，從而影響軍曹魚幼魚的促生長效果，具體作用機理仍有待深入研究。另外，不同的乳酸菌對軍曹魚幼魚的促生長效果不同。乳酸桿菌添加組的增重率和特定生長率的整體水平均高于糞腸球菌添加組，分析兩種乳酸菌促進軍曹魚幼魚生長的原因可能與其可以抑制腸道內(nèi)有害菌生長，維持腸道微生態(tài)平衡等作用有關。

3.2 乳酸菌對軍曹魚幼魚消化酶活性的影響

生物體內(nèi)的消化酶活性是反映機體消化能力強弱的指標，胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是機體內(nèi)重要的消化酶，研究三種消化酶可進一步探究兩種乳酸菌對軍曹魚幼魚的促生長機理。本研究表明，添加乳酸桿菌和糞腸球菌可顯著提高軍曹魚幼魚腸道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性，說明乳酸桿菌和糞腸球菌兩種乳酸菌可促進軍曹魚幼魚腸道分泌這三種消化酶，與異育銀鯽（）[21]、凡納濱對蝦[14]等的結果一致。乳酸桿菌和糞腸球菌添加組的淀粉酶隨添加比例的增加呈先升后降的趨勢，且乳酸桿菌添加組的整體水平均高于糞腸球菌添加組，變化規(guī)律與生長特性的相似，說明兩種乳酸菌可能通過促進軍曹魚幼魚腸道內(nèi)消化酶的活性進而促進幼魚的生長，但作用效果與兩種乳酸菌的種類和添加量有關。

3.3 乳酸菌對軍曹魚幼魚非特異性免疫酶的影響

超氧化物歧化酶是水產(chǎn)動物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除氧自由基產(chǎn)生活性氧，起抗病作用；溶菌酶是可以水解致病菌細胞壁上的黏多糖而使細菌溶解的堿性酶；丙二醛含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，可反映機體脂質過氧化速率和強度，亦可間接反映組織過氧化損傷程度。本研究中，隨乳酸菌種類和添加比例的變化，超氧化物歧化酶和溶菌酶活性在各處理組中均高于對照組，說明飼料中添加適量的乳酸桿菌和糞腸球菌可提高超氧化物歧化酶和溶菌酶活性，這與草魚[22]、鯽魚[23]等相關研究結果相似。而各處理組丙二醛含量顯著低于對照組，說明飼料中添加適量的乳酸桿菌和糞腸球菌可有效降低丙二醛含量，與植物乳桿菌對大菱鲆[18]幼魚相關研究相似。

4 結論

以噴灑方式在飼料中添加乳酸桿菌和糞腸球菌，可顯著提高軍曹魚幼魚的生長性能、消化能力和非特異性免疫力，其作用效果與添加量和添加乳酸菌種類相關；乳酸桿菌對軍曹魚的作用效果優(yōu)于糞腸球菌，以添加質量分數(shù)0.3%乳酸桿菌的效果最佳。

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Effects of Two Lactic Acid Bacteria on Growth Performance and Activities of Digestive and Non-specific Immune Enzymes of Juvenile Cobia ()

LIN Ai-ying1, WANG Wei-zheng1, CHEN Gang1, ZHANG Jian-dong1, HUANG Jian-sheng1,PAN Chuan-hao1, SHI Gang1, XIE Rui-tao1,2, ZHOU Hui1, TANG Bao-gui1

（1.,524088,; 2.,,,524025,）

【】To investigate the effects of adding two lactic acid bacteria ( i.e.spand) to feed on the growth performance, digestive enzymes and immune enzymes activities of juvenile cobia ().【】The basic compound feed was used as the control group, andsp. andwere sprayed separately onto the base feed at 1.0×108, 3.0×108and 5.0×108cfu/g, respectively. Healthy cobia with (10.66±0.09 g) were cultured for 10-weeks. The growth performance, digestive enzymes and immune enzymes activities were determined.【】Compared with the control group, addition of lactic acid bacteria in the feed reduced the feed efficiency. The rate of weight gain (WGR) and the specific growth (SGR) increased initially and then decreased, which were significantly higher than those of the control group (<0.05). The WGR and SGR in groups ofsp. were higher than those in groups of(< 0.05), and reach the maximum with thesp. addition of 3.0×108cfu/g; Amylase (AMS), trypsin (TRY) and lipase (LPS) of the two lactic acid bacteria added groups both were significantly higher than those of the control group (< 0.05). The superoxide dismutase (SOD) and lysozyme (LZM) of the two lactic acid bacteria added groups were higher than those of the control group. Malondialdehyde (MAD) activity was significantly lower than the control (< 0.05).【】Under this experimental conditions, the addition ofsp. andby spraying can significantly improve the growth performance, digestive capacity and non-specific immunity of cobia. Its effect is related to the amount and species of added lactic acid bacteria. The effect ofsp. on cobia is better than that of, especiallysp. is best with 3.0×108cfu/g.

; growth performance; digestive enzyme; non-specific immune enzyme;sp.;

S965.399

A

1673-9159（2020）05-0112-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.014

2019-06-03

2017年國家海水魚產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARA-47-G08）

林艾影（1992―），女，碩士，研究方向為魚類種子工程與健康養(yǎng)殖。E-mail:361656643@qq.com

陳剛，男，教授，研究方向為魚類種子工程與健康養(yǎng)殖。E-mail: cheng@gdou.edu.cn

林艾影，王維政，陳剛，等. 2種乳酸菌對軍曹魚幼魚生長及消化酶、免疫酶活性的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（5）：112-117.

（責任編輯：劉慶穎）