尼羅羅非魚Cullin-1基因克隆及表達

劉鑫潮，黃 瑜，簡紀常

尼羅羅非魚基因克隆及表達

劉鑫潮，黃 瑜，簡紀常

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室暨水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制廣東省普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】探究尼羅羅非魚（）（）基因在尼羅羅非魚抵抗病原細菌過程中的作用。從尼羅羅非魚脾臟組織中克隆基因（記為），對其進行生物信息學分析，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)分析在健康魚胸腺、鰓、肝、脾、腸道、頭腎、腦、肌肉、皮膚、血液組織，以及經(jīng)無乳鏈球菌刺激后病魚脾、腸道、頭腎中的表達?！尽浚℅enBank登錄號XM_003459470.5）編碼區(qū)為2 331 bp，編碼776個氨基酸，理論分子質(zhì)量為89 ku，理論等電點為8.16。氨基酸序列分析顯示，有1個高度保守的泛素樣蛋白結(jié)構(gòu)域Nedd8（ubiquitin-like domain），N′ 端有一個的信號肽序列。系統(tǒng)進化樹分析表明，序列與伯氏擬麗魚（）相似性最高，為98.7%。qRT-PCR顯示在健康尼羅羅非魚各組織中均有表達，其中在頭腎中表達量最高，其次是胸腺、腦、皮膚，在腸道中表達量最低。經(jīng)無乳鏈球菌刺激后，表達量在脾臟和腸道中均顯著上調(diào)，頭腎、脾臟和腸道均在48 h表達量最大。參與尼羅羅非魚抵抗無乳鏈球菌過程中的免疫應(yīng)答。

尼羅羅非魚；；基因表達；免疫應(yīng)答；無乳鏈球菌

尼羅羅非魚（）有肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高、環(huán)境適應(yīng)能力強、生長速度快等特點，是我國南方重要的養(yǎng)殖品種[1]。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，近年來鏈球菌病頻發(fā)，嚴重影響國內(nèi)尼羅羅非魚養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定發(fā)展[2-4]。羅非魚免疫研究有助于抗菌藥物及疫苗的開發(fā)，研究其免疫系統(tǒng)及免疫應(yīng)答有重要意義。

（）在蛋白質(zhì)降解和泛素化中有重要作用，是SCF（SKP1-CUL1-Fbox）E3泛素連接酶復(fù)合物的重要組成部分，可介導泛素化蛋白參與細胞周期進程、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄，在先天免疫應(yīng)答中有調(diào)控作用。目前對該基因的研究報道主要是在植物的細胞周期調(diào)控[5]和人的腫瘤[6-7]、癌癥[8]等方面，在尼羅羅非魚中尚未見報道。本研究通過克隆尼羅羅非魚基因（），分析該基因氨基酸序列，研究在健康和經(jīng)無乳鏈球菌刺激的羅非魚體內(nèi)的表達模式，為更好地研究羅非魚免疫機制提供理論基礎(chǔ)和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

健康尼羅羅非魚購自湛江市某羅非魚養(yǎng)殖場，在廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室于(28±2) ℃條件下暫養(yǎng)1周，體質(zhì)量約100 g。RNA提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、cDNA合成試劑盒、qPCR試劑盒購自北京全式金公司；克隆質(zhì)粒 pMD18-T載體購自TaKaRa 公司（大連）；RNAlater、DNA 膠回收純化試劑盒購自Thermo公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。克隆感受態(tài)細胞大腸桿菌() DH5α及無乳鏈球菌（ZQ0910）菌種由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 隨機取健康羅非魚，剖取適量脾臟組織于2.0 mL無RNA離心管，浸泡于1 mLTrizol后立刻使用研磨器研磨，按照TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取羅非魚脾臟總RNA。根據(jù)TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

空白對照腹腔注射滅菌的0.1 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，實驗組注射0.1 mL PBS重懸過的1×107cfu mL-1無乳鏈球菌。分別在注射后0、3、6、12、24、48、72、96 h各取羅非魚3尾，取適量脾臟、頭腎和腸道組織，放入2.0 mL無RNA離心管，浸泡于1 mL Trizol 后立即用研磨器研磨。同法提取RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA。– 80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 尼羅羅非魚基因的克隆 根據(jù)本實驗室所測得的羅非魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA244908)，利用Primer Premier 5.0分別設(shè)計克隆引物-F/R和熒光定量引物--436F/--532R（表1），以β-actin為內(nèi)參。以羅非魚脾臟cDNA為模板，利用引物F/R對羅非魚基因編碼序列片段進行擴增，反應(yīng)體系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7 μL，cDNA模板1 μL，F(xiàn)/R各1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min 20 s，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、目的條帶切膠回收后與載體pMD 18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含Amp+的LB瓊脂平板，于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。挑取單菌落于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)1 h，通過菌落PCR鑒定，陽性菌送生工生物(廣州) 股份有限公司測序。

表1 引物

1.2.3基因序列分析 將陽性克隆的測序結(jié)果用DNAMAN軟件拼接，從而獲得On-CUL1編碼序列和推導氨基酸序列，用ExPASy (http:// expasy.org/tools/) 進行蛋白質(zhì)分析得到理論等電點預(yù)測、分子質(zhì)量和親水性參數(shù)等。用InterProScan程序（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/ iprscan/）預(yù)測結(jié)構(gòu)域。用Soft Berry-Psite (http://lin-ux1.softberry. com/berry.phtmltopic=psite&group=pro-grams&sub group=prolocInterProscan)預(yù)測氨基酸基本功能位點分布。用PORTER (http://www. distill. ucd.ie/porter)、SWISSM-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/11 intera-ctive)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)。通過在線BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對核苷酸序列和氨基酸序列進行同源性比對。用DNAMAN程序?qū)n-CUL1氨基酸序列進行多重比對。通過MEGA6.0軟件，用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 qPCR驗證羅非魚CUL1組織分布 以β-actin為內(nèi)參基因，cDNA為模版，通過ABI7500 Real-Time定量PCR儀（Bio-Rad，CA，USA）進行qRT-PCR。引物見表1。反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用ABI 7500 Software V2.0.5，采用2-△△Ct法計算在組織中的相對表達量。用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用單因素方差分析，表示為平均值±標準差，顯著性水平= 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚CUL1基因克隆與序列分析

克隆的（GenBank登錄號：XM_003459470.5）全長為2 331 bp，可編碼776個氨基酸（圖1）。分析推導的氨基酸序列，CUL1蛋白理論分子質(zhì)量為89 ku，等電點為8.16，其中亮氨酸（Leu）比例最高，為11.7%，其次為賴氨酸（Lys），為8.5%，其中帶正電荷的氨基酸有103個，帶負電荷的氨基酸有107個。

“”，N-糖基化位點；“”，蛋白激酶C磷酸化位點；“”，酪氨酸激酶磷酸化位點；“”，豆蔻酰化位點；“”，酰胺化位點；“”，異戊二烯基結(jié)合位點；“”，微體c端定位信號；“*”，終止子；加粗部分，信號肽。

經(jīng)預(yù)測，CUL1序列無跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2），有1個N-糖基化位點，11個蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，1個豆蔻?；稽c，2個酰胺化位點，1個異戊二烯基結(jié)合位點，17個微體c端定位信號；存在信號肽，1 ~ 20為信號肽區(qū)域，其中信號肽剪切位點在第20 ~ 21位氨基酸之間；該蛋白總平均親水值為0.937，可能是疏水性蛋白。ProtScale分析表明，On-CUL1蛋白疏水性氨基酸含量較高，疏水區(qū)域較大，為疏水性蛋白，與理化分析結(jié)果一致。因此推測基因編碼的蛋白質(zhì)為疏水性蛋白。

圖2 On- CUL1氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析

2.2 On-CUL1二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

經(jīng)預(yù)測，羅非魚CUL1蛋白二級結(jié)構(gòu)（圖3）有無規(guī)則卷曲（24.23%）、α-螺旋（64.95%）、β-折疊（3.61%）、拓展鏈（7.22%）。圖4為對On-CUL1蛋白同源建模結(jié)果，是以2hac.1.A為模版，分別用羅非魚和人類的CUL1氨基酸序列構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)。對氨基酸三維建模佐證了二級結(jié)構(gòu)的正確性。

2.3 羅非魚CUL1序列同源比對及進化分析

克隆的與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種序列的比對結(jié)果表明，與伯氏樸麗魚（）同源性最高，為98.71%，與大黃魚（）的為94.25%，與金頭鯛（）的為94.21%。與非洲爪蟾（）、伯氏樸麗魚、大西洋鮭（）、野豬（）、人（）、大杜鵑（）的基因同源性比對結(jié)果（圖5）顯示，二者相似性均達到90%以上，分別為95.24%、98.71%、96.78%、95.68%、95.45%、95.88%，說明功能十分保守，進化變異極小。推測它們是同源序列氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹可見，羅非魚與伯氏樸麗魚及斑點叉尾鮰（）聚為一支（圖6），顯示了較高的同源性。

Fig. 4 Three-dimensional structure of CUL1 in tilapia and Homo sapiens

S. salar, XP_014045939.1; O. niloticus, XP_003459518.1; H. burtoni, XP_014185177.1; H. sapiens, NP_001357590.1; X. tropical, NP_001039255.1; S. scrofa, XP_020919247.1; C. canorus, XP_009566761.1；“.”為相同的氨基酸序列

圖6 N-J 法構(gòu)建CUL1氨基酸系統(tǒng)進化樹

2.4 尼羅羅非魚CUL1組織表達分析

圖7顯示，在10個組織中均可表達，在頭腎中表達量最高，其次是胸腺、腦和皮膚，在腸道、肝臟和鰓中表達量較低。經(jīng)無乳鏈球菌（）刺激后，在頭腎、脾臟和腸道中不同時間點的表達量差異較大（圖8），但均在48 h達到表達高峰。

In，腸道；Li，肝；Bl，血液；Gi，鰓；Sp，脾；Sk，皮膚；Mu，肌肉；Br，腦；Th，胸腺；HK，頭腎

*，與0 h比較P＜0.05；**，與0 h比較P＜0.01

3 討論

本研究克隆獲得尼羅羅非魚序列，其ORF為2 331 bp，編碼776個氨基酸，與其他魚類之間同源性較高，其中許多氨基酸和功能位點是保守的。推導得到編碼CUL1的氨基酸序列，預(yù)測該序列含有一個信號肽區(qū)域和一個泛素樣蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域有1個蛋白激酶C (PKC) 磷酸化位點(氨基酸位點739 ~ 741)，暗示該蛋白有完整的抗原結(jié)合位點，這在抗原信息傳遞過程中有重要作用[9]。經(jīng)比對，與伯氏樸麗魚的同源性為98.71%，該蛋白在系統(tǒng)進化樹中與伯氏樸麗魚聚為一支，而與其他物種親緣關(guān)系較遠。綜上，CUL1蛋白在進化過程中保守性較高，在不同物種間可能有一定差異性。

人在不同組織中均可表達，主要是免疫系統(tǒng)、肌肉、腸道、腦和肺等中有較高的表達。目前尚未見在魚類中表達的研究報道。本研究顯示，在頭腎中表達量最高，其次是胸腺、腦、皮膚、肌肉和脾臟，在腸道中表達量最低。頭腎是羅非魚的重要免疫器官之一，含有大量B和T淋巴細胞，可制造白細胞與毀滅陳舊紅細胞[10-12]。胸腺亦為羅非魚的重要免疫器官，是T細胞增殖分化的主要場所[13-14]，在腦組織中的高量表達可能是因為無乳鏈球菌獨特的感染方式，無乳鏈球菌可穿過血腦屏障感染魚類腦部，被巨噬細胞吞噬后隨血液進入顱腔，從而引發(fā)疾病[15-16]。皮膚和腸道是重要的黏膜免疫組織，羅非魚皮膚是免疫保護的第一道防線，其表面可分泌黏液，分布有大量的T淋巴細胞及其他白細胞，從而有參與細胞免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)[17-18]。而CUL1在尼羅羅非魚中的研究尚淺，具體抵御病原細菌入侵的機制尚不清楚，需進一步研究。

經(jīng)無乳鏈球菌刺激后，在頭腎、腸道、脾臟組織中，表達總體上均呈先升后降的趨勢，于48 h時達到高峰。在腸道組織中，于48 h時表達量達到高峰，其表達量約為對照組的3倍，在96 h時再次出現(xiàn)一個小高峰，可能與腸道免疫系統(tǒng)的二次免疫有關(guān)。在頭腎組織中，在6、24 h時表達量下調(diào)，于48 h達到高峰，其表達量約為0 h時表達量的2倍。這可能與頭腎這一重要的免疫器官在感染初期無乳鏈球菌可抑制免疫應(yīng)答功能[19]相關(guān)。脾臟組織經(jīng)無乳鏈球菌感染后呈大幅度上調(diào)趨勢，于48 h時達到高峰，其表達量約為對照組0 h時的18倍以上。脾臟是無乳鏈球菌感染主要的感染器官[20]，脾臟中的高水平表達說明羅非魚脾臟在對機體的免疫保護上可能發(fā)揮著更大的作用[21]。以上結(jié)果均表明，在宿主免疫防御中起重要作用，為參與免疫的研究提供重要依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆，On-CUL1有1個高度保守的泛素樣蛋白結(jié)構(gòu)域CUL1 Nedd8，序列在不同物種間的保守性極高。在10種組織中均有表達，其中頭腎、胸腺、腦中表達量較高。經(jīng)無乳鏈球菌刺激后，腸道、頭腎、脾臟的表達量呈時序性上調(diào)，在刺激48 h時，三組織中的表達量均最高，說明參與了尼羅羅非魚抵御細菌侵染過程中的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

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Cloning and Tissue Expression Analysis of the Cullin-1 in Nile Tilapia()

LIU Xin-chao, HUANG Yu, JIAN Ji-chang

(,,524088,)

【】To explore the role of cullin-1 (CUL1) gene of the Nile tilapia () inthe defense of pathogenic bacteria. 【】The CUL1 gene (named) was cloned from the spleen of the Nile tilapia (), and bioinformatics analysis of the gene was performed, and the expression of On-in the thymus, gills, liver, spleen, intestine, head kidney, brain, muscle, skin, and blood tissues of healthy fish, and the spleen, intestine, and head kidney ofstimulated fish was analyzed by fluorescence quantitative PCR. 【】The coding region of On-CUL1 gene was 2 331 bp, and encoding a 776 amino acids protein with a theoretical molecular mass 89 ku, and isoelectric point 8.16. On-CUL1 had a highly conserved ubiquitin-like domain,Nedd8 (ubiquitin-like domain), and a signal peptide sequence at the Nterminal.showed the highest similarity with(98.7%).was expressed in all tissues of healthy Nile tilapia, with the highest expression in head kidney, followed by thymus, brain and skin, and the lowest expression in intestine.After it was stimulated by inactivated. The expression ofwas significantly up-regulated in the spleen and intestine. The expression levels in the body kidney, spleen and intestine peaked at 48 h. 【】was involved in the immune response of Nile tilapia against

;; gene expression; immune response;

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）05-0027-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.004

2020-03-06

國家自然科學基金（31572651）；高校重大科研成果培育計劃類項目（GDOU2013050309）；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項目（230419083）

劉鑫潮（1996－），男，碩士，研究方向為水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制。E-mail: 767322063@qq.co

簡紀常，男，教授，研究方向為水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害防治。E-mail: jianjc@gmail.com

黃瑜，男，博士，研究方向為水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害防治。 E-mail: huangyu@gdou.edu.cn

劉鑫潮，黃瑜，簡紀常. 尼羅羅非魚Cullin-1基因克隆及表達[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（5）：27-33.

（責任編輯：劉慶穎）