姜黃素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)鯉肝臟損傷的修復(fù)作用

張媛媛，宋理平，郭 輝，王曉麗

姜黃素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)鯉肝臟損傷的修復(fù)作用

張媛媛1，宋理平1，郭 輝2，王曉麗1

（1. 山東省淡水漁業(yè)研究院，山東 濟(jì)南 250013；2. 山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250022）

【】研究姜黃素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的鯉（）肝臟損傷的修復(fù)作用，為篩選治療魚類肝臟綜合征的綠色藥物提供理論依據(jù)。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、60、120、240 mg/kg姜黃素，制備4種等氮、等能飼料。試驗(yàn)設(shè)5組，陰性對(duì)照組注射橄欖油，飼喂基礎(chǔ)飼料，陽性對(duì)照組和各姜黃素組注射體積分?jǐn)?shù)15%的CCl4溶液，分別以添加0、60、120、240 mg/kg姜黃素飼料飼喂14 d，測定各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活力，丙二醛（MDA）含量，血漿總蛋白（TP）含量，總能氧化能力（T-AOC），肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力，以及肝細(xì)胞核相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2）含量等指標(biāo)，并對(duì)各組肝臟細(xì)胞進(jìn)行組織學(xué)觀察，研究姜黃素對(duì)鯉肝損傷的修復(fù)作用。在四氯化碳誘導(dǎo)初期，陽性對(duì)照組，60、120、240 mg/kg姜黃素組的GPT、GOT活力和MDA含量顯著高于陰性對(duì)照組(< 0.05)，隨著投喂時(shí)間的增加，各姜黃素組GPT、GOT活力和MDA含量平均值均有不同程度的降低，其中，120 mg/kg組的GPT、GOT活力和MDA含量以及240 mg/kg組的GPT活力差異顯著(< 0.05)；TP含量，T-AOC、SOD、GSH-Px活力，GSH含量的變化趨勢(shì)與GPT和GOT等相反，且隨著投喂時(shí)間的增加，120 mg/kg組的T-AOC、SOD、GSH-Px活力和TP、GSH含量以及240 mg/kg組的SOD、GSH-Px活力和GSH含量呈先降后升趨勢(shì)(< 0.05)，其余各組差異均不顯著 (> 0.05)；肝臟組織切片顯示，飼料中添加姜黃素可一定程度上修復(fù)鯉魚幼魚的肝臟損傷，且以120 mg/kg組效果最佳；飼料中添加姜黃素可提高鯉魚肝臟mRNA表達(dá)量，促使Nrf2由肝細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核中。姜黃素可通過介導(dǎo)Nrf2提高鯉魚相關(guān)抗氧化酶的活力，對(duì)魚體的肝臟損傷進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)姜黃素的添加水平為120 mg/kg時(shí)，機(jī)體的抗氧化功能最強(qiáng)，對(duì)肝臟損傷的修復(fù)作用最強(qiáng)。

鯉；肝臟損傷；修復(fù)；姜黃素；Nrf2

魚類在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常受抗生素等藥物或化學(xué)物質(zhì)的應(yīng)激，致使其生理動(dòng)態(tài)平衡嚴(yán)重紊亂。CCl4等有毒物質(zhì)的侵襲可直接作用于肝臟細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜或生物大分子，導(dǎo)致魚體肝臟膜脂質(zhì)過氧化，膜蛋白變性，膜結(jié)構(gòu)性損壞，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[1]，俗稱肝膽綜合征，近年來較為頻發(fā)，死亡率高。目前，關(guān)于魚類肝膽綜合征的治療主要以抗生素為主，但魚類內(nèi)服抗生素等藥物不僅會(huì)引起腸道反應(yīng)而食欲不振，還對(duì)魚體肝膽、腎臟等造成直接損傷，且易在魚類體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性，并造成藥物殘留而威脅人類健康[2-3]。姜黃素是目前世界上銷量最大的天然食用色素之一，其毒性低、不良反應(yīng)少，是世界衛(wèi)生組織和美國食品藥品管理局以及多個(gè)國家認(rèn)定的安全藥物[4]。2014年，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)姜黃素作為新飼料添加劑，現(xiàn)已證明其有殺菌消炎[5-6]、抗氧化[7]、清除自由基[7]及抗癌[8]等多種功效。有研究顯示，姜黃素可明顯激活人類肝癌細(xì)胞中HepG2細(xì)胞的核相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（nuclesr factor crythroid 2-related factor 2, Nrf2）系統(tǒng)，并對(duì)抗葡萄糖氧化酶，（glucose oxidase, GO）氧化應(yīng)激所致的蛋白激酶B （protein kinase B，PKB）磷酸化損害[9]，亦可通過誘導(dǎo)Nrf2活性對(duì)蛋氨酸-膽堿所引起的小鼠（）非酒精性脂肪肝炎有一定保護(hù)作用[10]，還可保護(hù)人類或小鼠等免受鎘[11]、汞[12]等毒性物質(zhì)引起的腎臟、睪丸等組織嚴(yán)重?fù)p傷[13]。目前對(duì)姜黃素的應(yīng)用研究主要在哺乳動(dòng)物方面，在魚類中的研究尚處起步階段，主要集中在對(duì)機(jī)體的促生長、提高免疫以及抗氧化功能方面，即姜黃素對(duì)大黃魚（）[14]、羅非魚（）[15]、草魚（）[16]、大菱鲆（）[17]等生長、消化吸收、非特異性免疫和抗氧化功能研究。在姜黃素對(duì)魚體肝臟損傷方面研究僅見對(duì)草魚[18]、建鯉（var.）[19]和鯽（）肝細(xì)胞[20]急性肝臟損傷的保護(hù)作用研究，缺乏對(duì)魚類肝臟損傷修復(fù)作用的研究。本研究以CCl4構(gòu)建魚體肝臟損傷模型，結(jié)合魚體生理、抗氧化及相關(guān)分子指標(biāo)，探討姜黃素可否通誘導(dǎo)Nrf2活力，對(duì)魚體肝臟損傷進(jìn)行修復(fù)，為姜黃素作為無公害中成漁藥在魚病防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚與養(yǎng)殖管理

幼鯉（）約50 g，由山東省淡水漁業(yè)研究院良種場提供。試驗(yàn)開始前，用通威飼料公司提供的沉性飼料暫養(yǎng)1周，隨機(jī)將450尾大小、規(guī)格、體質(zhì)基本一致的幼魚隨機(jī)放入15個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖桶（水體積250 L）中，試驗(yàn)分為5組。每組試驗(yàn)所用循環(huán)桶在空間位置上隨機(jī)分散排布，減少試驗(yàn)組之間因光線等因素造成的誤差。每天分別于8:30、12:30和4:30近飽食投喂1次，每次投喂持續(xù)30 min以上。每天吸污1次，飼養(yǎng)期間水溫24.5 ~ 27.5 ℃，溶解氧6 mg/L以上，氨氮0.1 mg/L以下，亞硝酸鹽0.1 mg/L以下，pH 6.8 ~ 7.0。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)鯉魚腹腔注射由橄欖油稀釋的體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%、20%、25%、30% CCl4，觀察7 d，確定造成鯉魚肝臟損傷但不致死的CCl4體積分?jǐn)?shù)為15%。

試驗(yàn)分為5組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾魚。試驗(yàn)組按每100 g體質(zhì)量0.5 mL的比例對(duì)鯉魚腹腔注射體積分?jǐn)?shù)15%的CCl4溶液(溶于橄欖油)，注射12 h后，鯉魚出現(xiàn)明顯的活力弱、不進(jìn)食等病癥，向魚體飼喂添加0（基礎(chǔ)飼料，陽性對(duì)照）、60、120、240 mg/kg姜黃素飼料；陰性對(duì)照組按相同比例腹腔注射橄欖油，養(yǎng)殖模式處理同試驗(yàn)組，飼喂無添加姜黃素飼料（基礎(chǔ)飼料）。在開始投喂飼料時(shí)以及投喂后1、4、7、14 d時(shí)分別采樣，分析姜黃素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷的影響。

1.3 試驗(yàn)飼料

由山東省淡水漁業(yè)研究院營養(yǎng)與飼料加工研究室制備。將飼料原料粉碎，過孔徑380 μm的篩，采用逐級(jí)混勻方法充分混勻原料，加水后用小型顆粒機(jī)（SLP-45，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械研究所）制成直徑為3 mm的顆粒，基礎(chǔ)飼料見表1。

表1 試驗(yàn)飼料配方與營養(yǎng)水平

注：1）每千克維生素預(yù)混料包含以下維生素：VA, 900 000 IU; VD,200 000 IU; VE, 4 500 mg; VK3, 220 mg; VB1, 320 mg; VB2, 1090 mg; 煙酸 2 800 mg; VB5, 2 000 mg; VB6, 500 mg; VB12, 1.6 mg; VC, 5 000 mg; 泛酸, 1 000 mg; 葉酸, 165 mg; 膽堿, 60 000 mg。

2）每千克礦物質(zhì)預(yù)混料包含以下礦物質(zhì)：FeSO4·7H2O, 25 g; CuSO4·5H2O, 2.0 g; ZnSO4·7H2O, 22 g; Na2SeO3, 0.04 g; KI, 0.026 g; MnSO4·4H2O, 7 g; CoCl2·6H2O, 0.1 g。

Notes: 1) One kilogram vitamin premix supplied the following vitamins: Vitamin A, 900000 IU; Vitamin D, 200000 IU; Vitamin E, 4500 mg; Vitamin K3, 220 mg; Vitamin B1,320 mg; Vitamin B2, 1090 mg; Niacin, 2800 mg; Vitamin B5, 2000 mg; Vitamin B6, 500 mg; Vitamin B12, 1.6 mg; Vitamin C, 5000 mg; Pantothenate, 1000 mg; Folic acid, 165 mg; Choline, 60000 mg.

2) One kilogram mineral premix supplied the following minerals: FeSO4·7H2O, 25 g; CuSO4·5H2O, 2.0 g; ZnSO4·7H2O, 22 g; Na2SeO3, 0.04 g; KI, 0.026 g; MnSO4·4H2O, 7 g; CoCl2·6H2O, 0.1 g.

1.4 采樣與處理

每桶隨機(jī)取魚3尾，用100 mg/L的MS-222快速深度麻醉，采血（尾靜脈），血樣在抗凝管中以4 ℃、6 000 r/min條件離心10 min，制備的血漿于?80 ℃下凍存?zhèn)溆谩Ｃ课掺~同時(shí)采集肝臟，一部分存于波恩氏液中以備切片用，另一部分存儲(chǔ)在?80 ℃冰箱以進(jìn)一步分析。

1.4.1 血漿肝功能指標(biāo)測定 總蛋白(TP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和總抗氧化能力(T-AOC) 用南京建成生物工程研究所科技有限公司試劑盒采用比色法測定。

1.4.2 肝臟抗氧化指標(biāo)測定 凍存的肝臟樣品在4 ℃冰箱溶解后，用生理鹽水沖洗去血液，用濾紙吸干，以生理鹽水為介質(zhì)按照1∶9（1 g組織樣品、9 mL生理鹽水）制成勻漿液，離心10 min (3 000 r/min)，取上清液，用南京建成生物工程研究所科技有限公司試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 和谷胱甘肽(GSH)。SOD活力由黃嘌呤氧化產(chǎn)生活性氧陰離子(O2-) 的清除率來計(jì)算[21]，MDA含量、GSH和GSH-Px活力用比色法測定[22]。

1.4.3 組織形態(tài)學(xué)分析 每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)取魚3尾，麻醉，在冰盤上剖取肝臟，放入預(yù)先配制好的波恩氏固定液(體積分?jǐn)?shù)1.22%的飽和苦味酸75 mL，體積分?jǐn)?shù)40%甲醛溶液25 mL，冰醋酸5 mL)中固定[23]。然后水洗，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片(切片機(jī)型號(hào)為Leica RM-2255，德國)，附貼于用蛋白甘油處理過的載玻片上進(jìn)行HE染色，用中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡(NIKON DS-Fi1) 下觀察。

1.4.4 肝臟mRNA測定 用天根生物科技有限公司的試劑盒采用Trizol法提取各時(shí)間段的鯉魚肝組織總RNA，測定總RNA純度，使OD260/OD280為1.8 ~ 2.0，并凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (天根生物科技有限公司) 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA；根據(jù)鯉魚mRNA的基因全序列設(shè)計(jì)引物(表2) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件： 95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，循環(huán)40次。Sybergreen 法檢測目的基因的擴(kuò)增，β-actin為內(nèi)參基因，所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。mRNA水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算[24]。

1.4.5 核內(nèi)Nrf2含量監(jiān)測 采用western blot技術(shù)檢測肝臟細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量。取鯉肝組織100 mg，用溶液法抽提總蛋白，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，變性后電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用50 g/L脫脂奶粉TBS溶液于室溫下封閉2 h，用Nrf2一抗 (1∶1 000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司) 于4℃下孵育18 ~ 24 h，用洗膜緩沖液TBST（Tris Buffered Saline Tween）洗膜3 次，每次8 min，用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶10 000，Jackson ImmunoResearch) 室溫下孵育2 h，用TBST同法洗膜3 次，進(jìn)行2 min的免疫印跡化學(xué)發(fā)光（ECL）反應(yīng)，暗室中曝光、顯影和定影。用HRP偶聯(lián)內(nèi)參GAPDH一抗孵育2 h 后，用TBST 洗膜4 次，每次10 min，進(jìn)行2 min ECL反應(yīng)，同法曝光、顯影和定影。利用QuantiScan 3.0 軟件測量目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶灰度值，相對(duì)表達(dá)量以Nrf2灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。

表2 Nrf2基因熒光定量PCR引物

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)差異顯著時(shí)，采用Duncan’s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較, 差異水平定為0.05。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.M) 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氯化碳誘導(dǎo)肝臟損傷后姜黃素對(duì)鯉血液生理指標(biāo)的影響

圖1可見，經(jīng)四氯化碳誘導(dǎo)損傷后鯉血漿GPT活力受姜黃素投喂時(shí)間影響顯著。陰性對(duì)照組GPT活力在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)較為穩(wěn)定，活力較低；陽性對(duì)照組，120、240 mg/kg姜黃素組的GPT活力呈先升后降的變化趨勢(shì) (< 0.05)，而60 mg/kg姜黃素組無顯著差異。此外，鯉魚血漿GPT活力也受姜黃素添加量的影響。在投喂飼料1 d時(shí)，陽性對(duì)照組和各姜黃素組的GPT活力均顯著高于陰性對(duì)照組(< 0.05)；投喂4 d時(shí)，陽性對(duì)照組顯著高于陰性對(duì)照組 (< 0.05)，60、120、240 mg/kg組平均值高于陰性對(duì)照但差異不顯著 (> 0.05)；投喂7 d時(shí)，120 mg/kg組的GPT活力顯著低于陽性對(duì)照組 (< 0.05)，與陰性對(duì)照組無顯著差異，60、240 mg/kg組平均值也低于陽性對(duì)照組，但差異不顯著；投喂14 d時(shí)，各姜黃素組的GPT活力與陰性對(duì)照組均無顯著差異。

如圖1所示，四氯化碳誘導(dǎo)肝臟損傷后鯉魚血漿中GOT活力與GPT活力相似，亦受姜黃素添加量和飼料投喂時(shí)間的顯著影響。陽性對(duì)照組和120 mg/kg組的GOT活力隨著飼料投喂時(shí)間的增加均出現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì) (< 0.05)，而60、240 mg/kg組的變化并不明顯。此外，在投喂飼料1 d時(shí)，陰性對(duì)照組GOT活力顯著低于陽性對(duì)照組和各姜黃素組 (< 0.05)；投喂4 d時(shí)，陰性對(duì)照組GOT活力顯著低于陽性對(duì)照組和240 mg/kg組(< 0.05)，而與60 和120 mg/kg組差異不顯著 (> 0.05)；投喂7 d時(shí)，陰性對(duì)照組和120 mg/kg組的GOT活力顯著低于陽性對(duì)照組 (< 0.05)，60和240 mg/kg組的GOT活力與陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和120 mg/kg組均無顯著差異(> 0.05)。

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時(shí)間點(diǎn)間Duncan多重比較，凡含一個(gè)相同字母或無字母時(shí)無顯著性差異（P > 0.05）。

圖2可見，飼料中添加姜黃素顯著影響四氯化碳誘導(dǎo)鯉魚肝臟損傷后血漿中TP含量。隨著投喂時(shí)間增加，120 mg/kg組的TP含量呈先降后升變化趨勢(shì) (< 0.05)，其他各組均無顯著差異 (> 0.05)；在投喂1 d時(shí)，陽性對(duì)照組及240 mg/kg組的TP含量低于陰性對(duì)照組，60、120 mg/kg組的TP含量平均值低于陰性對(duì)照組但差異不顯著 (> 0.05)；投喂4 d時(shí)，陽性對(duì)照組的TP含量顯著低于陰性對(duì)照組 (< 0.05)，其余各組之間差異均不顯著(> 0.05)；投喂7 d時(shí)，120 mg/kg組的TP含量回升至陰性對(duì)照組水平 (> 0.05)，且120 mg/kg組平均值高于60和240 mg/kg組，但差異不顯著(> 0.05)；投喂14 d時(shí)，60、120 mg/kg組的TP含量顯著高于陽性對(duì)照組 (< 0.05)，與陰性對(duì)照組和240 mg/kg組差異不顯著 (> 0.05)。

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時(shí)間點(diǎn)間Duncan多重比較，凡含一個(gè)相同字母或無字母時(shí)無顯著性差異（P > 0.05）。

圖2可見，經(jīng)CCl4誘導(dǎo)后，鯉魚血漿T-AOC受姜黃素添加量影響顯著。隨著投喂時(shí)間的增加，120 mg/kg組的T-AOC和TP含量的變化趨勢(shì)基本相同，均呈先降后升變化趨勢(shì) (< 0.05)，其他各組之間無顯著差異(> 0.05)；在投喂1 d時(shí)，陽性對(duì)照組的T-AOC顯著低于陰性對(duì)照組，與其他各組無顯著性差異，在其他時(shí)間點(diǎn)，姜黃素添加量的不同對(duì)鯉血漿T-AOC并未造成顯著影響。

2.2 四氯化碳誘導(dǎo)后姜黃素對(duì)鯉魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

圖3可見，CCl4誘導(dǎo)后，肝臟SOD活力和MDA含量均受姜黃素添加量和投喂時(shí)間顯著影響。隨著投喂時(shí)間的增加，120、240 mg/kg組的SOD活力呈先降后升趨勢(shì) (< 0.05)，其他各組無顯著差異。在投喂飼料1 d時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組和240 mg/kg組的肝臟SOD活力顯著降低 (< 0.05)，60和120 mg/kg組的平均值降低，但差異不顯著 (> 0.05)；在投喂4 d時(shí)，各姜黃素組SOD活力平均值高于陽性對(duì)照組，低于陰性對(duì)照組，但差異并不顯著 (> 0.05)。MDA含量則呈相反趨勢(shì)，當(dāng)姜黃素的添加量為120 mg/kg時(shí)，隨著投喂時(shí)間的增加，肝臟MDA含量呈先升后降趨勢(shì)（< 0.05）。

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時(shí)間點(diǎn)間Duncan多重比較，凡含一個(gè)相同字母或無字母時(shí)無顯著性差異（P > 0.05）。

圖4可見，經(jīng)CCl4誘導(dǎo)后，肝臟中GSH-Px和GSH活力均受飼料投喂時(shí)間和姜黃素添加量顯著影響。隨著投喂時(shí)間的增加，120、240 mg/kg組GSH-Px活力和GSH含量均呈先降后升趨勢(shì) (< 0.05)，其他各組無顯著差異 (> 0.05)。試驗(yàn)開始時(shí)，陽性對(duì)照組和各姜黃素組肝臟GSH平均值較陰性對(duì)照組有所下降，但差異不顯著，而與陰性對(duì)照組相比，各組GSH-Px活力顯著下降 (< 0.05)；在投喂1 d時(shí)，陽性對(duì)照組和各姜黃素組的GSH-Px活力顯著低于陰性對(duì)照組 (< 0.05)，而與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組的GSH含量顯著降低(< 0.05)，各姜黃素組的GSH含量有所下降，但差異不顯著(> 0.05)；在投喂4 d時(shí)，各姜黃素組的GSH和GSH-Px活力平均值與前一次采樣相比均有所升高 (> 0.05)，且與陰性對(duì)照組相比無顯著差異，各組間差異也不顯著 (> 0.05)；在投喂7、14 d時(shí)，各姜黃素組GSH和GSH-Px活力基本恢復(fù)至正常水平，各組間無顯著差異 (> 0.05)。

2.3 四氯化碳誘導(dǎo)后姜黃素對(duì)鯉魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

圖5可見，投喂飼料1 d時(shí)，在油鏡（×1000）下，陽性對(duì)照組、60、120及240mg/kg組的肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重空泡及細(xì)胞膨大現(xiàn)象，大部分肝細(xì)胞的細(xì)胞核大而明顯且出現(xiàn)偏移，大量細(xì)胞核出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，更有甚者，肝細(xì)胞有出血現(xiàn)象。而陰性對(duì)照組的肝細(xì)胞形狀較為正常，無細(xì)胞膨大及明顯的脂肪空泡現(xiàn)象；細(xì)胞核大小適中，分布于細(xì)胞中間。在投喂7 d時(shí)，陽性對(duì)照組和60 mg/kg組仍有細(xì)胞核聚集和脂肪空泡化等現(xiàn)象；此外，120 mg/kg組肝臟細(xì)胞形狀較為正常，無明顯細(xì)胞膨大和脂肪空泡現(xiàn)象，細(xì)胞核大小適中，分布于細(xì)胞中間；240 mg/kg組雖有些許脂肪空泡，但與投喂1d相比癥狀已減輕。

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時(shí)間點(diǎn)間Duncan多重比較，凡含一個(gè)相同字母或無字母時(shí)無顯著性差異（P > 0.05）。

圖5 姜黃素對(duì)鯉魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

2.4 四氯化碳誘導(dǎo)后姜黃素對(duì)鯉魚肝臟中Nrf2 mRNA表達(dá)量的影響

圖6可見，經(jīng)四氯化碳誘導(dǎo)后，鯉魚肝臟mRNA表達(dá)量受姜黃素添加量影響顯著。在試驗(yàn)開始及投喂1 d時(shí)，各組間肝臟mRNA表達(dá)量均無顯著差異 (> 0.05)；在投喂4 d時(shí)，120 mg/kg組mRNA表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組 (< 0.05)，其余各組間差異均不顯著 (> 0.05)；在投喂7、14 d時(shí)，各姜黃素組mRNA表達(dá)量均顯著高于陰性對(duì)照組 (< 0.05)，而陽性對(duì)照組表達(dá)量平均值高于陰性對(duì)照組，但差異不顯著 (> 0.05)。

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時(shí)間點(diǎn)間Duncan多重比較，凡含一個(gè)相同字母或無字母時(shí)無顯著性差異（P > 0.05）。

2.5 四氯化碳誘導(dǎo)后姜黃素對(duì)鯉魚肝臟細(xì)胞核Nrf2蛋白水平的影響

如圖7所示，在投喂飼料7 d后，鯉魚肝臟細(xì)胞核中的Nrf2含量受姜黃素添加量影響。與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組，60、120、240 mg/kg組的肝臟細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量均升高，其中，120 mg/kg組最高。

3 討論

3.1 四氯化碳誘導(dǎo)肝臟損傷后姜黃素對(duì)鯉魚血液生理指標(biāo)的影響

動(dòng)物血液生理指標(biāo)可用來判斷機(jī)體的基礎(chǔ)代謝和營養(yǎng)狀況。通過血液生理指標(biāo)的變化可判斷機(jī)體的營養(yǎng)和健康狀況以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)情況[25]。肝臟是動(dòng)物機(jī)體最主要的代謝器官，具有抗氧化、代謝蛋白質(zhì)及儲(chǔ)存糖元等功能，肝臟損傷可嚴(yán)重影響機(jī)體的健康。GPT和GOT是魚類最重要的轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于肝臟中，可在一定程度上反映肝臟的生理狀態(tài)[26]。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝臟細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生改變，GPT和GOT會(huì)被大量釋放到血液中，因而被認(rèn)為是檢測肝功損害最具有特異性的重要指標(biāo)[27]。本研究中，在四氯化碳誘導(dǎo)鯉魚肝臟損傷初期，陽性對(duì)照組及60、120、240 mg/kg姜黃素組的血漿GPT和GOT活力顯著高于陰性對(duì)照組；但隨著投喂飼料時(shí)間的延長，與陽性對(duì)照組相比，3個(gè)姜黃素組的GPT和GOT活力平均值均有所降低，其中，120 mg/kg組的血漿GPT和GOT活力較60、240 mg/kg組差異更為顯著。這說明姜黃素在一定程度上對(duì)鯉魚幼魚肝臟損傷具有修復(fù)作用。

血漿TP含量是反應(yīng)機(jī)體營養(yǎng)和代謝水平的重要指標(biāo)，可維持正常的滲透壓和恒定的pH，并與脂肪、膽紅素、膽固醇和磷酸等的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。而肝臟是蛋白質(zhì)合成的唯一場所，當(dāng)肝臟損傷時(shí)，血液TP含量將顯著降低，因而，血液中TP含量也可作為檢測肝臟受損程度的重要指標(biāo)[28]。有學(xué)者認(rèn)為，在運(yùn)輸、氨氮、病原菌感染等急性應(yīng)激下血液蛋白含量將增加，而在慢性應(yīng)激下將降低[29-30]。然而張春暖[31]研究表明，在急性熱應(yīng)激和氨氮應(yīng)激24 h后，團(tuán)頭魴（Yih）血漿TP含量顯著降低。黃琪琰等[32]對(duì)異育銀鯽（）溶血性腹水病的病理及生理反應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示患病魚體的血液TP含量顯著低于健康魚。本研究中，在四氯化碳誘導(dǎo)初期，陽性對(duì)照及各姜黃素組TP含量顯著降低，與團(tuán)頭魴急性熱應(yīng)激后TP含量的變化一致。隨投喂時(shí)間的增加，各姜黃素組TP含量逐漸提升， 120 mg/kg組對(duì)TP含量的提升效果最為明顯， 240 mg/kg組提升效果最差。說明飼料中添加姜黃素可在一定程度上促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抗氧化應(yīng)激的目的，且當(dāng)姜黃素添加量為120 mg/kg時(shí)效果最優(yōu)。Harikrishnan等[33]研究植物提取物對(duì)鯉生理反應(yīng)的影響時(shí)表明，日糧中添加中草藥提取物能增加血液中的TP含量，使魚體抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，與本研究結(jié)論一致。這可能是因?yàn)榻S素可一定程度上提升機(jī)體的免疫功能，可通過提高機(jī)體的非特異性免疫能力來促進(jìn)機(jī)體代謝，從而維持機(jī)體抗氧化平衡，進(jìn)而達(dá)到修復(fù)肝臟損傷的目的[34]。

3.2 四氯化碳誘導(dǎo)后姜黃素對(duì)鯉魚肝臟相關(guān)抗氧化酶和Nrf2 mRNA表達(dá)量的影響

SOD是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一以超氧陰離子自由基（O2-）為底物的酶，可催化O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2。谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px) 又可通過還原性谷胱甘肽 (GSH) 將H2O2催化生成水，以達(dá)到抵抗體內(nèi)自由基的目的。MDA是羥基陰離子 (?OH) 攻擊細(xì)胞膜后脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。這些相關(guān)抗氧化酶在機(jī)體中參與肝臟Ⅱ相代謝反應(yīng)，俗稱Ⅱ相代謝酶。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，與機(jī)體的防御系統(tǒng)密切相關(guān)，可通過與機(jī)體肝臟酶促反應(yīng)中相關(guān)代謝酶中啟動(dòng)子區(qū)域特定的DNA序列組成的抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element, ARE）相互作用，上調(diào)多種抗氧化酶及解毒酶，提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物質(zhì)的表達(dá)水平[35-36]，從而保護(hù)機(jī)體組織免受有毒物質(zhì)的攻擊。本研究中，四氯化碳誘導(dǎo)初期，除陰性對(duì)照組外，其他各組SOD、GSH-Px活力和GSH含量均出現(xiàn)不同程度的降低，MDA含量卻相反，這說明四氯化碳對(duì)鯉魚幼魚肝臟造成了一定損傷。而當(dāng)投喂飼料7 d時(shí)，陽性對(duì)照組和各姜黃素組的SOD、GSH-Px活力和GSH含量較投喂1 d時(shí)，均出現(xiàn)不同程度的提高，除240 mg/kg組GSH-Px活力外，投喂7 d時(shí)的120和240 mg/kg組的SOD、GSH-Px活力和GSH含量較投喂1 d時(shí)差異顯著。同時(shí)，肝臟mRNA表達(dá)量的結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，隨著投喂時(shí)間的增加，陽性對(duì)照和各姜黃素組表達(dá)量均值呈不同程度的上升現(xiàn)象。這說明姜黃素可通過調(diào)控的表達(dá)來上調(diào)機(jī)體相關(guān)抗氧化酶的活力，從而達(dá)到維持機(jī)體氧化與抗氧化生理平衡以及修復(fù)肝臟損傷的目的。

3.3 四氯化碳誘導(dǎo)后姜黃素對(duì)鯉魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

通過觀察經(jīng)四氯化碳誘導(dǎo)后魚體的肝臟組織切片可確定姜黃素對(duì)鯉肝臟損傷有否修復(fù)作用。結(jié)果顯示，在四氯化碳誘導(dǎo)初期，魚體肝臟出現(xiàn)空泡化、細(xì)胞核偏移及細(xì)胞核聚集等現(xiàn)象。投喂姜黃素7 d時(shí)，120 mg/kg組肝臟組織已無空泡化、細(xì)胞膨大和細(xì)胞核聚集現(xiàn)象，與陰性對(duì)照組無明顯差異，而陽性對(duì)照組和60 mg/kg組肝臟組織仍有細(xì)胞核聚集和細(xì)胞空泡現(xiàn)象，且240 mg/kg組肝細(xì)胞也有輕微空泡化。表明飼料中添加姜黃素對(duì)鯉魚肝臟損傷有一定修復(fù)作用。其中，以120 mg/kg姜黃素添加效果最佳。原因可能有以下幾點(diǎn)：首先，在肝臟損傷初期，機(jī)體產(chǎn)生大量ROS分子，其可導(dǎo)致受損細(xì)胞DNA分子損傷，而姜黃素可提高相關(guān)抗氧化酶的活力來消除ROS分子；其次，姜黃素作為一種中草藥添加劑，其功能或與大黃素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因修復(fù)肝臟損傷[37]類似，但劑量不足或過量使用均不能達(dá)到最優(yōu)效果。

3.4 四氯化碳誘導(dǎo)后姜黃素對(duì)鯉魚肝臟細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量的影響

Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)家族，是包括p45、Nrf1、Nrf2和Nrf3在內(nèi)的CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在機(jī)體的代謝器官和解毒器官（如肝臟）中表達(dá)。而Nrf2的活性是由胞漿蛋白伴侶分子Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）精確調(diào)控的。在正常的生理狀態(tài)下，Keap1通過其DGR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)分別與Nrf2和肌動(dòng)蛋白相結(jié)合，從而將Nrf2約束于細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)細(xì)胞受到外源性化學(xué)制劑刺激或者氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1或者Keap1的DGR區(qū)構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而使Nrf2從Keap1上解離出來，移位至細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件ARE相互作用，進(jìn)一步激活了ARE介導(dǎo)下的相關(guān)代謝酶基因的表達(dá)[38]。本研究中，投喂飼料7 d后，添加姜黃素組鯉肝臟細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白含量高于陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組，其中，以120 mg/kg組核內(nèi)Nrf2的含量最高。這說明，姜黃素可促使Nrf2從Keap1上解離出來，從細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核中，進(jìn)而參與調(diào)控相關(guān)抗氧化酶的合成，最終達(dá)到修復(fù)肝臟損傷和維持機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡的目的。這與肝臟切片和Nrf2 mRNA表達(dá)的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

姜黃素可通過介導(dǎo)Nrf2來提高鯉魚相關(guān)抗氧化酶的活力，從而對(duì)魚體的肝臟損傷進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)姜黃素的添加水平為120 mg/kg時(shí)，機(jī)體的抗氧化功能最強(qiáng)，對(duì)肝臟損傷的修復(fù)力也最強(qiáng)。

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Research of Curcumin on Recovery Effect of Liver Injury inInduced by Carbon Tetrachloride

ZHANG Yuan-yuan1, SONG Li-ping1, GUO Hui2, WANG Xiao-li1

（1.,’250013,2.,’250022,）

【】To evaluate the recovery of curcumin in liver injury ofinduced by carbon tetrachloride (CCl4), for future screening of green treatment drugs for the tr fish hepatobiliary syndrome.【】A basal diet supplemented with 0, 60, 120 and 240 mg/kg curcumin as four experimental diets. The experiment included five groups: positive control group (injected with 15% carbon tetrachloride solution, fed basic feed), negative control group (injected with olive oil, fed basic feed), 60, 120 and 240 mg/kg curcumin group (injected with 15% carbon tetrachloride solution, fed the diet supplemented with 60, 120 and 240 mg/kg curcumin respectively).The activity of GPT, GOT, MDA content, Total Protein (TP) in blood, T-AOC, SOD, GSH, GSH-Px, and expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) were detected, and histological exaination for liver was conducted .【】 By comparing blood physiological indexes (GPT, GOT, TP and T-AOC) and other antioxidant indexes (SOD, MDA, GPx, GSH and Nrf2, et al) among groups at different times, the therapy effect of curcumin to liver injury induced by carbon tetrachloride inwere evaluated. It was found that: during the experiment period, blood physiological indexes and other antioxidant indexes are significantly (<0.05) influenced by the dose and feeding time of curcumin. Initially, there were a significant (<0.05) increase on glutamic oxalacetic transaminase (GOT) and glutamic pyruvictransaminase (GPT) activities of the plasma and liver malondialdehyde (MDA) content in the positive control group and the three curcumin groups, and the mean values of these indexes decreased with increasing feeding time. The activity of GPT, GOT and MDA content of 120 mg/kg group and GPT activity of 240 mg/kg group had a significantly difference(<0.05) with increasing feeding time. In addition, the trend of total protein (TP) and total antioxidant capacity (T-AOC) of plasma and liver superoxidedismutase (SOD), glutathione (GSH) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities were the opposite of that of GPT. T-AOC, SOD and GSH-Px activities and TP and GSH contents of 120 mg/kg group. The activity of SOD and GSH-Px and GSH content of 240 mg/kg group increased firstly and then decreased(<0.05) with increasing feeding time. Curcumin (120 mg/kg curcumin per diet) can repair the damage of liver caused by carbon tetrachloride and restored liver tissue to normal. Results ofmRNA expression in liver and Nrf2 protein level in nucleus also indicated that the dietary supplementation with optimal curcumin could increase themRNA expression in liver and enhance antioxidant status of carp by promoting the release of Nrf2, which increase the activity of antioxidantenzymes and finally protect common carp from liver injury by CCl4.【】Curcumin (especially 120 mg/kg) can improve activities of related antioxidant enzymes through the regulation of Nrf2 activity, so as to repair liver damage in fish.

; liver injury; recoveryeffect; curcumin; Nrf2

S917；S948

A

1673-9159（2020）05-0001-11

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.001

2020-01-04

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2018PC030）

張媛媛（1984－），女，博士，助理研究員，從事水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與免疫研究. E-mail: yyuanzhang2008@163.com

張媛媛，宋理平，郭輝，等. 姜黃素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)鯉肝臟損傷的修復(fù)作用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（5）：1-11.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）