植物光呼吸途徑的調(diào)控和優(yōu)化策略

周天驕，丁曉輝，王君暉

（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳與再生生物學(xué)研究所，杭州310058）

1 植物的光呼吸

植物的核酮糖-1，5-雙磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco）是地球上最豐富的蛋白質(zhì)，它是所有光合生物（如藍(lán)細(xì)菌、藻類(lèi)和陸地植物）催化固定大氣中CO2的關(guān)鍵物質(zhì)。大約30億年前，Rubisco從一個(gè)高濃度CO2和可忽略不計(jì)O2濃度的大氣環(huán)境中進(jìn)化而來(lái)，因此，其作為氧化酶的活性并未體現(xiàn)[1]。然而，由于光合作用的出現(xiàn)，大氣中的O2濃度升高，CO2濃度下降，導(dǎo)致Rubisco同時(shí)進(jìn)行羧化反應(yīng)和氧化反應(yīng)。Rubisco 固定CO2會(huì)產(chǎn)生2 分子的3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate, 3-PGA），而3-PGA 進(jìn)入卡爾文循環(huán)后合成糖類(lèi)和其他有機(jī)化合物；Rubisco 和O2發(fā)生反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生1 分子的3-PGA 和1分子的2-磷酸乙醇酸（2-phosphoglycolate, 2-PG）[2-3]。2-PG對(duì)植物有毒害作用，它通過(guò)限制磷酸果糖激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶的功能來(lái)致使核酮糖-1，5-雙磷酸（ribulose-1, 5-bisphosphate, RuBP）再生減少[3-4]。為了去除2-PG并使卡爾文循環(huán)的碳損失最小化，有氧光合作用的生物體進(jìn)化出了光呼吸循環(huán)途徑（也稱(chēng)為C2循環(huán)）[5-6]。在目前的大氣φ（CO2）/φ（O2）=0.04%/20.95%下，C3植物1/4～1/3的RuBP 分子被氧化而不是被羧化，所以大多數(shù)陸地植物在白天產(chǎn)生大量的2-PG[7-8]。光呼吸將2 分子2-PG 再循環(huán)為1 分子3-PGA，相當(dāng)于75%的有機(jī)碳被回收用于合成RuBP，并重新回到卡爾文循環(huán)，而25%的有機(jī)碳以CO2的形式損失[9]。

2 光呼吸途徑的基因通路

在高等植物中，光呼吸循環(huán)需要8 種核心酶和幾種輔助酶以用于回收Rubisco氧化反應(yīng)產(chǎn)生的2-PG，各個(gè)反應(yīng)分布在葉綠體、過(guò)氧化物酶體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，因此，光呼吸代謝物的流動(dòng)需要經(jīng)過(guò)許多膜通道步驟（圖1）。迄今為止，僅鑒定出了幾種質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：質(zhì)體乙醇酸/甘油酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（plastidic glycolate glycerate transporter,PLGG1）、質(zhì)體2- 酮 戊 二 酸/蘋(píng) 果 酸 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體（plastidic 2-oxoglutarate/malate transporter, DiT1）、谷氨酸/蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（glutamate/malate translocator, DiT2.1）和膽 汁 酸/鈉 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體（bile acid sodium symporter,BASS6），而大多數(shù)過(guò)氧化物酶體和線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍然未知[10-13]。其中，PLGG1 為筆者實(shí)驗(yàn)室先前所報(bào)道的AtLrgB[14-15]。30 多年前，研究者就預(yù)測(cè)，在光呼吸途徑中，有一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體把乙醇酸從葉綠體中運(yùn)出的同時(shí)把甘油酸從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)入[16-17]。我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)由At1g32080基因編碼的蛋白被反復(fù)報(bào)道，但功能未知，于是從美國(guó)SALK的T-DNA插入突變體庫(kù)中鑒定出它的突變體，由于該蛋白的C 端有一個(gè)LrgB 結(jié)構(gòu)域，所以將其命名為AtLrgB；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中它是個(gè)孤兒基因，但無(wú)論是在低等還是高等植物中，都有它的同源基因[14]。此外，另有學(xué)者從日本RIKEN的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽突變體庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了該基因的突變體，遵從我們的命名建議，也稱(chēng)它為AtLrgB[18]。另有研究小組從生物信息學(xué)的基因共表達(dá)分析入手，發(fā)現(xiàn)它與植物光呼吸相關(guān)的基因共表達(dá)，深入研究后發(fā)現(xiàn)，它的生化功能是質(zhì)體乙醇酸/甘油酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[11]。

在葉綠體中，2-磷酸乙醇酸磷酸酶（2-phosphoglycolate phosphatase, PGLP）使2-PG 去磷酸化以產(chǎn)生乙醇酸[19]，乙醇酸由PLGG1和BASS6轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)，并通過(guò)未知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通道進(jìn)入過(guò)氧化物酶體[11-12,20]。在過(guò)氧化物酶體中，乙醇酸被乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase,GOX）氧化為乙醛酸并生成H2O2，H2O2隨后被過(guò)氧化氫酶（catalase, CAT）分解為H2O和O2。乙醛酸在谷氨酸∶乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（glutamate∶glyoxylate aminotransferase,GGAT）和絲氨酸∶乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（serine∶glyoxylate aminotransferase,SGAT）的作用下生成甘氨酸；甘氨酸從過(guò)氧化物酶體中輸出，并被未知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白帶入線粒體。在線粒體中，甘氨酸脫羧酶復(fù)合物（glycine decarboxylase multienzyme system, GDC）和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase,SHMT）聯(lián)合作用將2分子甘氨酸轉(zhuǎn)化為1 分子絲氨酸、CO2和NH3，并產(chǎn)生還原型輔酶Ⅰ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）。絲氨酸從線粒體回到過(guò)氧化物酶體中被SGAT催化為羥基丙酮酸，羥基丙酮酸還原酶（hydroxypyruvate reductase, HPR）將產(chǎn)生的羥基丙酮酸還原為甘油酸并消耗NADH。最后，PLGG1將甘油酸轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中，被甘油酸激酶（glycerate 3-kinase, GLYK）磷酸化為3-PGA[21]。最新研究表明，GLYK 在光照下表達(dá)編碼質(zhì)體定位GLYK（plastid-localized GLYK, ptGLYK）的長(zhǎng)mRNA，但在黑暗中它通過(guò)啟動(dòng)子的可變選擇表達(dá)一個(gè)短mRNA，編 碼 細(xì) 胞 質(zhì)GLYK（cytoplasmic GLYK,cytGLYK）。cytGLYK構(gòu)成光呼吸旁路，減輕波動(dòng)光誘導(dǎo)的光抑制[22]。3-PGA 作為卡爾文循環(huán)的中間體可用于RuBP的再生。光呼吸是一個(gè)消耗能量的過(guò)程，1 mol RuBP 被氧化需要消耗3.25 mol 腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）和2 mol 還原型輔酶Ⅱ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH），這大概占植物在大氣中固定CO2總能量的1/3[23]。

圖1 植物的光呼吸途徑Fig.1 Photorespiration pathway of plants

在過(guò)去的40年中，光呼吸的核心酶及其相應(yīng)的基因主要是以擬南芥為模式植物被鑒定出來(lái)[24]。觀察表明，相關(guān)酶的缺失會(huì)導(dǎo)致光呼吸表型，即突變體只能在高濃度的CO2條件下存活，在大氣環(huán)境中生長(zhǎng)不良甚至致死，所以光呼吸是植物在含氧環(huán)境中正常生長(zhǎng)所不可或缺的途徑[12,25]。它不僅僅是植物脫毒及碳骨架回收的過(guò)程，而且已經(jīng)與氮同化、三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle,TCA）、碳代謝和硫代謝等途徑整合，共同調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[26-29]。

3 優(yōu)化光呼吸途徑的方法

在小麥、水稻和大豆等C3作物中，光呼吸使光合作用轉(zhuǎn)化效率降低20%～50%[30]，在高溫和干旱條件下甚至更高[31]。因此，優(yōu)化光呼吸途徑長(zhǎng)期被視為作物改良的目標(biāo)[32]，尤其是在世界人口穩(wěn)步增長(zhǎng)、自然資源供應(yīng)有限和氣候變化帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)的背景下。目前，主要通過(guò)以下4 個(gè)方面調(diào)控和優(yōu)化光呼吸。

3.1 改造Rubisco

雖然Rubisco 在植物代謝中起著核心作用，但它是一種相對(duì)低效的酶[33]。Rubisco 一直是基因調(diào)控的目標(biāo)，目的是使其具有更高的CO2特異性和更高的催化效率，但這些努力只取得了有限的成功[34-36]。大多數(shù)Ⅰ型Rubisco（發(fā)現(xiàn)于陸地植物、綠藻和藍(lán)細(xì)菌中）似乎在催化效率和底物特異性之間表現(xiàn)出平衡。因此，通過(guò)增強(qiáng)Rubisco對(duì)CO2的特異性來(lái)降低其加氧酶活性可能會(huì)破壞CO2的催化位點(diǎn)，導(dǎo)致較低的酶活性[37]；反之亦然，如果改造具有更高酶活性的Rubisco，必須降低其對(duì)CO2的特異性，導(dǎo)致更高的氧化速率[38-39]。但這一特點(diǎn)在來(lái)自硅藻的Ⅰ型Rubisco 中沒(méi)有觀察到，它含有碳濃縮機(jī)制（carbon concentrating mechanisms,CCM），除了氧化速率較慢以外，還維持著與C3水平相近的酶特異性和羧化轉(zhuǎn)化率[40]。

盡管如此，只是略微改進(jìn)Rubisco 也可能產(chǎn)生明顯的效果。據(jù)計(jì)算，將紅藻（Griffithsia monilis）中的Rubisco 移植到作物中，可使碳同化量增加25%，因?yàn)榕c植物Rubisco 相比，這種酶的CO2特異性/活性比增加了2 倍[35]。然而，將深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）[41]和 藍(lán) 細(xì) 菌（Synechoccoccus elongatus）[42]的Rubisco 取代煙草的Rubisco，轉(zhuǎn)基因植物只能在高濃度的CO2環(huán)境中生長(zhǎng)，與相應(yīng)的野生型相比顯示出嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷。重新改造的S.elongatus轉(zhuǎn)基因植株在高濃度CO2條件下恢復(fù)了生長(zhǎng)，但與野生型相比，Rubisco 水平顯著降低為原來(lái)的10%[43]。這表明，原則上可以將高催化性能的外源Rubisco 移植到植物中，但是單獨(dú)改良的Rubisco能否在田間條件下顯著提高光合作用產(chǎn)量，仍有待證明[44]。

3.2 實(shí)施CCM

除了直接改造Rubisco外，另外一種途徑是通過(guò)增加Rubisco 附近的CO2濃度，從而有效地抑制Rubisco 的氧化反應(yīng)，提高CO2的固定效率[45]。與植物Rubisco相比，藍(lán)細(xì)菌進(jìn)化出對(duì)O2更敏感的酶，然而，使藍(lán)細(xì)菌在高氧環(huán)境中茁壯成長(zhǎng)的是它們復(fù)雜的CCM。功能性CCM 所需的成分包括Rubisco 周?chē)聂然w、碳酸酐酶以及無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[46-50]。通過(guò)使用活性碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和CO2吸收系統(tǒng)，藍(lán)細(xì)菌胞質(zhì)溶膠中積累的無(wú)機(jī)碳濃度比CCM 突變體高1 000 倍[51]。此外，Rubisco 和Ca2＋被封裝在羧基體內(nèi)，導(dǎo)致Rubisco 活性部位周?chē)腃O2濃度升高；而且羧基體的可選擇性滲透蛋白的外殼使內(nèi)部O2濃度最小化，從而防止浪費(fèi)的光呼吸[52]。據(jù)估計(jì)，將一種功能性藍(lán)細(xì)菌CCM 移植到C3植物將導(dǎo)致CO2同化量增加36%～60%[53]。即使僅從CCM引入碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)光合作用也有明顯的凈效益[53-54]。

另一個(gè)研究方向是在無(wú)CCM 作物的葉綠體內(nèi)引入羧基體，預(yù)計(jì)在高溫和干旱條件下可使產(chǎn)量提高60%[53]。功能性羧基體已經(jīng)在大腸埃希菌中重組，證明其在外源宿主中具有強(qiáng)大的自組裝潛力，提高了將羧基體引入其他生物體的可行性[55]。將β-羧基蛋白引入煙草的葉綠體中，自組裝出更高級(jí)的蛋白結(jié)構(gòu)[56]。在煙草中表達(dá)藍(lán)細(xì)菌的Rubisco 和羧基體內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白CcmM，葉綠體內(nèi)產(chǎn)生了這2種蛋白的聚合體，類(lèi)似于早期的羧基組裝復(fù)合體[42]。這些結(jié)果為未來(lái)葉綠體功能性羧基體的研究奠定了基礎(chǔ)?？紤]到每個(gè)葉綠體所需的羧基體數(shù)目尚不清楚，引入這種復(fù)雜的CCM 是對(duì)植物有益還是負(fù)擔(dān)仍有待觀察[57]。

3.3 優(yōu)化光呼吸酶的表達(dá)

另外一種降低光呼吸對(duì)作物產(chǎn)量影響的方法是優(yōu)化光呼吸酶的表達(dá)，加速光呼吸通量，使葉綠體中2-PG 和乙醇酸的積累和毒性效應(yīng)最小化，從而提高RuBP 再生率，改善植物的生長(zhǎng)。有研究表明，植物光呼吸途徑的通量受線粒體甘氨酸-絲氨酸轉(zhuǎn)化率的限制[58]。GDC 包含4 個(gè)亞基（L、H、P、T亞基），擬南芥GDC不同亞基的過(guò)表達(dá)支持該假設(shè)。H-蛋白[59]或L-蛋白[60]的過(guò)表達(dá)降低了CO2補(bǔ)償點(diǎn)，且優(yōu)化了植物的生長(zhǎng)，這可能是由于光呼吸途徑的通量增加[61-62]。T-蛋白顯然不是一個(gè)限制因子，因?yàn)槠浠钚缘南抡{(diào)或上調(diào)都不會(huì)影響光合CO2的固定和植物的生長(zhǎng)[63]。此外，當(dāng)植物暴露于高光呼吸壓力條件下，煙草中H-蛋白的過(guò)表達(dá)減少了對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ的損害[62]。水稻線粒體SHMT的過(guò)表達(dá)也能夠提高水稻的光合效率和植株生產(chǎn)力[64]。在分子水平上，產(chǎn)生上述結(jié)果的原因和影響尚不清楚，但線粒體反應(yīng)的能力似乎可以控制整個(gè)光呼吸通量，或以某種方式參與光合活性的調(diào)節(jié)。近年研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸可能作為光呼吸轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的代謝信號(hào)，進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)[65]。

與那些有益的作用相比，SGAT 的過(guò)表達(dá)對(duì)植物有負(fù)面的影響。在大氣環(huán)境條件下，過(guò)表達(dá)SGAT 使植物光合作用的CO2攝取減少，絲氨酸和天冬酰胺消耗增加，從而擾亂C/N平衡，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)不良[66]。顯然，光呼吸與其他代謝途徑（如氮代謝）緊密相連，改造任一光呼吸酶也會(huì)對(duì)其他代謝過(guò)程造成影響，所以我們應(yīng)更好地理解這些代謝途徑的相互作用和相互依賴(lài)性。

3.4 設(shè)計(jì)光呼吸旁路

設(shè)計(jì)光呼吸旁路的目的在于避免線粒體甘氨酸脫羧和NH3的釋放，降低光呼吸的能量成本。目前，在模式植物中主要設(shè)計(jì)了3種光呼吸旁路（圖2）。

第1種是在葉綠體中引入甘油酸旁路。該途徑在葉綠體中將乙醇酸轉(zhuǎn)化為甘油酸，并釋放1 分子的CO2，甘油酸再回到卡爾文循環(huán)中[67]。該過(guò)程避免了NH3的釋放，ATP 消耗少。由于整個(gè)過(guò)程在葉綠體中進(jìn)行，因此CO2會(huì)在Rubisco 附近釋放，從而減少氧化反應(yīng)[68-69]。將大腸埃希菌的甘油酸途徑引入擬南芥、馬鈴薯和茶樹(shù)的葉綠體后，轉(zhuǎn)基因植株的光合作用增強(qiáng)，生長(zhǎng)速率加快，生物量增加。有趣的是，在葉綠體中單獨(dú)過(guò)表達(dá)乙醇酸脫氫酶（glycolate dehydrogenase,GDH）的轉(zhuǎn)基因植株中也意外地觀察到生長(zhǎng)的改善，這表明需要更多的探究來(lái)充分了解葉綠體中發(fā)生的生物化學(xué)變化[67-69]。

第2 種是在過(guò)氧化物酶體中引入甘油酸旁路。在煙草的過(guò)氧化物酶體中引入大腸埃希菌乙醛酸醛連接酶（glyoxylate carboligase,GCL）和羥基丙酮酸異構(gòu)酶（hydroxypyruvate isomerase,HYI），將乙醛酸轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為甘油酸，從而繞過(guò)線粒體[70]。雖然這種替代途徑可能會(huì)降低2-PG回收的成本，但在這些煙草株系中無(wú)法檢測(cè)到HYI蛋白，因此，其對(duì)植物產(chǎn)量的影響有待證實(shí)[71]。

第3種是在葉綠體中引入蘋(píng)果酸合成途徑。該途徑需要表達(dá)GOX、CAT 和蘋(píng)果酸合成酶（malate synthetase, MS），在葉綠體中將2-PG 氧化為CO2，從而繞過(guò)NH3的釋放，并提高了Rubisco周?chē)腃O2濃度，可以導(dǎo)致生物量增加。這一途徑在擬南芥中進(jìn)行試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株的光合速率和鮮質(zhì)量均有所提高[72]。

最近，這些光呼吸旁路經(jīng)過(guò)改造已應(yīng)用于煙草中。SOUTH等在煙草的葉綠體中設(shè)計(jì)了3種旁路：1）使用大腸埃希菌乙醇酸氧化途徑中的5 個(gè)基因；2）使用植物的乙醇酸氧化酶和蘋(píng)果酸合成酶以及大腸埃希菌中的過(guò)氧化氫酶；3）使用植物的蘋(píng)果酸合成酶和綠藻乙醇酸脫氫酶。同時(shí)，利用RNA干擾技術(shù)（RNA interference,RNAi）抑制PLGG1，防止乙醇酸的輸出。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株的生產(chǎn)力比野生型植株提高了40%[30]。

事實(shí)上，自然光呼吸和各種合成旁路之間實(shí)際流量的分布仍然難以確定，為了評(píng)估這些旁路對(duì)植物光呼吸代謝的影響，還應(yīng)開(kāi)展進(jìn)一步的研究工作。

4 展望

光呼吸是植物長(zhǎng)期進(jìn)化中獲得的重要代謝途徑，可以使植物在含氧環(huán)境中健康成長(zhǎng)；但它同時(shí)又是浪費(fèi)能量的過(guò)程，成為制約作物產(chǎn)量的重要因素。目前已鑒定出光呼吸途徑的核心基因通路，然而過(guò)氧化物酶體和線粒體的大部分相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道仍然未知，還需要進(jìn)一步探究。另外，更深入地了解光呼吸中間產(chǎn)物在其他代謝途徑中的作用也是一個(gè)重要的研究方向。目前已有幾種調(diào)控和優(yōu)化光呼吸的方法，植株的生物量也有所增加，但是大部分使用的是模式植物，將這些方法應(yīng)用到主要糧食作物上仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，且對(duì)植物抗逆性的影響還不可預(yù)知。盡管如此，優(yōu)化光呼吸的研究具有良好的發(fā)展前景，代謝工程、合成生物學(xué)和數(shù)學(xué)建模等方向的結(jié)合為優(yōu)化光呼吸途徑開(kāi)啟了新的大門(mén)，有望達(dá)到提高農(nóng)作物產(chǎn)量的最終目的。

圖2 3種優(yōu)化光呼吸途徑的方法Fig.2 Three approaches to optimizing photorespiration pathway