EVI1基因?qū)ξ赴┘毎L及侵襲的機制研究

柳子川

（廣州醫(yī)科大附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科 廣東 廣州 510095）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)病隱匿，初始臨床癥狀不顯著。很多患者確診的時候已經(jīng)是疾病的中、晚期，失去了治療的最佳機會。因此，發(fā)掘可能導(dǎo)致胃癌發(fā)生及進展的分子標(biāo)記物具有重要的意義。

胃癌的發(fā)病原因比較多，比如有飲食習(xí)慣，環(huán)境因素，幽門螺桿菌感染及癌基因的異常激活等因素。其中，癌基因的異常激活是導(dǎo)致胃癌發(fā)生及進展一個很重要的原因。這些癌基因的異常激活通?？梢詫?dǎo)致胃粘膜上皮細胞發(fā)生變異，出現(xiàn)異常的增殖，進而出現(xiàn)癌變[1]。檢測異常表達的癌基因可以較早期檢測出胃癌的病變，對胃癌的防治具有重要的臨床意義。

1.材料及實驗方法

1.1 實驗材料

PRMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰酶消化液購買自hyclone公司。MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），溴酚藍，多聚甲醛購買自sigma公司。Lipofectamine? RNAiMAX購自invitrogen公司。小分子干擾RNA片段購自廣州銳博公司。transwell小室購自corning公司。EVI1，cyclind1，MMP9和GAPDH內(nèi)參一抗購自santa cruz公司。鼠抗人二抗購自中杉金橋公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

胃癌細胞SGC-7901培養(yǎng)在含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基之中。細胞在含5% CO2,37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

將4×105個處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞均勻鋪在6孔板中。24小時細胞貼壁后，將Lipofectamine? RNAiMAX和小分子干擾RNA均勻混合，在室溫下面放置20分鐘。之后將上述混合物加入6孔板中轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞。EVI1干擾RNA轉(zhuǎn)染的細胞稱為si- EVI1，和陰性對照轉(zhuǎn)染的細胞稱為si-ctrl。

1.4 MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）實驗

將細胞鋪于96孔板，每個孔細胞密度為6×103/孔,分別于第1d、2d、3d、4d、5d和6d不同時間點，每個孔中加入20 μl初始濃度為5mg/ml的MTT溶液。之后在正常細胞培養(yǎng)環(huán)境中再孵育4個小時，棄掉培養(yǎng)液以及MTT。每個孔加入150μl 二甲基亞砜(DMSO)終止反應(yīng)。細胞活力的測定：采用酶標(biāo)儀在490nm 處讀取每孔的吸光度值，最后制作細胞增殖曲線。

1.5 平板克隆實驗

將細胞鋪于6孔板中，每4天換培養(yǎng)液1次。共培養(yǎng)2周之后，棄掉培養(yǎng)液。然后使用PBS沖洗干凈細胞，使用4%多聚甲醛固定細胞，蘇木素染色，顯微鏡下觀察細胞形成集落的大小。

1.6 細胞周期實驗

選取處于對數(shù)生長期的細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞。然后把細胞用PBS 溶液重懸，加入70%乙醇溶 液在4℃固定過夜。用PI對細胞進行染色，然后使用流式細胞儀對細胞周期進行分析。

1.7 RT-PCR實驗

使用Trizol提取細胞或者組織中的RNA，然后使用HiScript Ⅱ Q-RT SuperMix試劑盒對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.8.Transwell實驗

把細胞使用無血清培養(yǎng)基懸浮，鋪于transwell小室里面。將transwell小室放在12孔板上方，12孔板里面添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)劑。36個小時之后，取出transwell小室，將未遷徙的細胞用棉簽搽掉。使用4%多聚甲醛固定細胞，蘇木素染色。顯微鏡下面觀察細胞數(shù)目。

2.結(jié)果

2.1 EVI1影響胃癌細胞的生長能力

我們首先使用小分子干擾RNA（si-RNA）敲除胃癌細胞SGC-7901中EVI1基因的表達（圖1A）。我們把細胞分為對照組（si-ctrl）和實驗組（si-EVI1）。MTT實驗發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，實驗組細胞生長的速度明顯減慢（圖1B）。平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)：實驗組的細胞形成克隆的能力較對照組顯著減弱（圖1C）。我們檢測了細胞周期的變化情況。流式細胞儀發(fā)現(xiàn)：敲除EVI1基因之后，可以使細胞周期阻滯在G1期（圖1D）。使用western blot檢測調(diào)控細胞周期的因子，發(fā)現(xiàn)敲除EVI1基因之后，cyclinD1和E2F1表達水平下降（圖1E）。

圖1 （A）左圖：RT-PCR驗證實驗組、對照組EVI1的分別表達量，右圖：western blot驗證實驗組、對照組EVI1的分別表達量。（B）MTT實驗檢測實驗組、對照組細胞生長速率。（C）平板克隆實驗檢測實驗組、對照組細胞形成克隆的能力。（D）流式細胞儀檢測實驗組、對照組細胞周期分別的差異。（E）western blot驗證實驗組、對照組cyclinD1和E2F1的分別表達量。

2.2 EVI1可促進胃癌細胞的侵襲能力

研究EVI1基因?qū)ξ赴┘毎忠u能力的影響。進行transwell實驗，驗證細胞的侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，實驗組細胞侵襲能力下降（圖2A）。檢測影響胃癌細胞侵襲的金屬基質(zhì)蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：敲除EVI1基因之后，MMP3和MMP9表達水平下降（圖2B）。

2.3 EVI1可激活胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路

探索EVI1基因?qū)ξ赴┘毎绊懙目赡軝C制。由于PI3K/AKT信號通路可以促進胃癌細胞的增殖及侵襲能力，研究EVI1是否可以通過激活PI3K/AKT信號通路，從而發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)作用。

我們使用western blot實驗，檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)在實驗組和對照組之間的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：和對照組相比，實驗組細胞中磷酸化PI3K及磷酸化AKT表達水平都下調(diào)（圖2C）。這結(jié)果提示：EVI1可能激活PI3K/AKT信號通路。

圖2 （A）transwell實驗驗證實驗組、對照組細胞遷徙數(shù)目。（B）western blot驗證實驗組、對照組MMP3和MMP9的分別表達量。（C）western blot驗證實驗組、對照組磷酸化PI3K（p-PI3K）及磷酸化AKT（p-AKT）的分別表達量。

2.4 EVI1在胃癌組織中表達上升

最后，探討EVI1蛋白在腫瘤組織，尤其胃癌組織中的表達情況。使用TCGA（The Cancer Genome Atlas）在線分析數(shù)據(jù)庫（http：//tumorsurvival.org/）來分析EVI1蛋白在腫瘤組織中的表達情況。發(fā)現(xiàn)：EVI1蛋白在一系列腫瘤組織中表達都上升，尤其是在胃癌組織中（圖3）。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中EVI1蛋白在一系列惡性腫瘤中的表達水平（紅色圈部分代表胃癌組織）。

3.討論

胃癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，患者具有生存時間較短，容易復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的特點。同時，胃癌發(fā)病隱匿性較高，很多患者確診的時候已經(jīng)是疾病的晚期狀態(tài)[2]。因此，闡明胃癌發(fā)病的分子機制，尋找新的可以預(yù)測胃癌發(fā)病的相關(guān)分子，并開發(fā)新的治療靶點，在臨床治療中具有重要的意義。

研究擬探討EVI1基因在胃癌中的作用及具體的分子機制。EVI1是一個重要的癌基因，在包括急性白血病，卵巢癌，結(jié)腸癌，肺癌，鼻咽癌等多種惡性腫瘤中高度表達[3]。EVI1高度表達的腫瘤患者其預(yù)后不良，這類患者其無疾病生存時間及總生存時間通常短于低表達的患者[4]。這提示EVI1有可能作為惡性腫瘤一個預(yù)后監(jiān)測的指標(biāo)，并有可能作為一個新的治療靶點。EVI1的生物學(xué)作用在胃癌中的研究相對比較少，本研究擬初步探討其在胃癌細胞中的功能。

在既往的研究當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)EVI1可通過多種途徑促進腫瘤的發(fā)生以及進展。例如在乳腺癌當(dāng)中，EVI1可以促進細胞的增殖，調(diào)控細胞周期，從而導(dǎo)致細胞的生長[5]。在卵巢癌細胞中，EVI1可以促進細胞的侵襲，從而導(dǎo)致了腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。EVI1還可以賦予腫瘤細胞對凋亡的抵抗，從而促進了腫瘤細胞的生長，以及對化療的抵抗[6]。在白血病細胞當(dāng)中，EVI1還可以直接結(jié)合在其下游基因的啟動子水平，發(fā)揮廣泛的基因調(diào)控作用，從而促進白血病的發(fā)生進展[7]。EVI1還可以和microRNA(miRNA)相互結(jié)合，從而間接調(diào)控miRNA下游的靶基因，發(fā)揮一系列廣泛的生物學(xué)功能[8]。從這些研究結(jié)果，可以看出EVI1是具有很廣泛的調(diào)控腫瘤的作用。

在我們的研究當(dāng)中，首先在胃癌細胞中敲除EVI1的表達，然后開始研究相關(guān)的生物學(xué)功能。MTT和平板克隆結(jié)果提示，在敲除EVI1之后，胃癌細胞的生長能力下降。腫瘤細胞的生長受到多個因子及因素的調(diào)控。還進一步發(fā)現(xiàn)，EVI1可以促進腫瘤細胞由G1期進入S期。對調(diào)控細胞周期的相關(guān)蛋白進行驗證后，我們還發(fā)現(xiàn)EVI1可以上調(diào)cyclinD1和E2F1的表達。這結(jié)果和之前的研究結(jié)果相一致[9,10]。還用transwell實驗驗證EVI1對胃癌細胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：敲除EVI1之后，胃癌細胞侵襲的能力下降。金屬基質(zhì)蛋白酶過度表達可以促進腫瘤細胞的侵襲以及遠處轉(zhuǎn)移，包括胃癌細胞[11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EVI1可以上調(diào)胃癌細胞金屬基質(zhì)蛋白酶中的MMP-3和MMP-9表達水平。這提示EVI1有可能是通過調(diào)控金屬基質(zhì)蛋白酶，從而促進胃癌細胞的侵襲能力。綜上所述，這些研究結(jié)果進一步證明了EVI1對腫瘤細胞生長和侵襲能力的影響。

最后，我們還探討了EVI1可能促進胃癌細胞生長及侵襲的分子機制。在之前的研究當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)EVI1可以直接抑制PTEN，從而激活PI3K/AKT信號通路[12]。EVI1還可以激活ERK/mTor通路，從而促進腫瘤細胞的侵襲及化療抵抗[13]。PI3K/AKT信號通路通常在腫瘤細胞中是異常激活的。在胃癌細胞中，PI3K/AKT信號通路可以促進細胞的增殖以及侵襲[14]。我們探討了EVI1對PI3K/AKT信號通路活性的影響。我們發(fā)現(xiàn)：敲除EVI1之后，PI3K/AKT信號通路活性下降。由此可見，EVI1是通過PI3K/AKT信號通路促進了胃癌細胞的增殖及侵襲能力。

綜上所述，EVI1可以促進胃癌細胞的生長、侵襲能力。其中的機制可能是EVI1激活了PI3K/AKT信號通路。EVI1可做為胃癌治療的一個新靶點。