30例胃腸道間質(zhì)瘤KIT與PDGFRA基因突變檢測(cè)結(jié)果分析

黃曉青

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310008）

胃腸道間質(zhì)瘤(Gastro intestinal stromal tumor,GIST)是消化道間葉來(lái)源腫瘤中最常見(jiàn)的類型，約占消化道惡性腫瘤的1～3%，腫瘤起源于Cajal間質(zhì)細(xì)胞[1]。使用CD117抗體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)可以鑒定胃腸道間質(zhì)瘤中CD117特征性的表達(dá)[2]。約90%的胃腸道間質(zhì)瘤中KIT基因發(fā)生了功能性的突變，該突變是GIST最主要的驅(qū)動(dòng)突變類型。KIT基因編碼的KIT蛋白是一種跨膜受體蛋白，受體結(jié)合干細(xì)胞因子。KIT蛋白的細(xì)胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)功能為酪氨酸激酶。因此，一旦KIT基因發(fā)生功能性突變將導(dǎo)致受體酪氨酸激酶的持續(xù)性激活進(jìn)而引起細(xì)胞的增值能力異常升高[3]。以往研究認(rèn)為胃腸道間質(zhì)瘤對(duì)腫瘤化療耐藥，而且由于缺乏有效的治療手段而預(yù)后較差。甲磺酸伊馬替尼是一種針對(duì)KIT、PDGFRA以及BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制劑靶向藥物，被批準(zhǔn)用于治療胃腸道間質(zhì)瘤。在胃腸道間質(zhì)瘤中，除了KIT基因突變外，還有小部分的KIT野生型患者攜帶血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α（Platelet derived growth factor receptor-α，PDGFRA）基因突變，伊馬替尼同樣能結(jié)合并抑制PDGFRA[4]。

以往研究表明，KIT和PDGFRA基因突變對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤具有預(yù)后和預(yù)測(cè)的潛力，KIT基因突變往往伴隨著腫瘤的侵襲性更強(qiáng)臨床預(yù)后更差，而PDGFRA突變的胃腸道間質(zhì)瘤生物學(xué)表型更偏向良性[5]。此外，KIT和PDGFRA基因突變對(duì)伊馬替尼藥物的療效都具有重要的預(yù)測(cè)作用[6]。近年來(lái)研究表明，免疫組化和基因突變檢測(cè)對(duì)輔助診斷胃腸道間質(zhì)瘤非常有幫助，因?yàn)榇蠹s95%的腫瘤表達(dá)CD117蛋白（KIT基因編碼蛋白），而且大約90%的腫瘤攜帶KIT基因突變，大約5%攜帶PDGFRA突變。盡管CD117免疫組化陽(yáng)性表達(dá)被認(rèn)為是診斷胃腸道間質(zhì)瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道存在部分間質(zhì)瘤CD117、CD34、S-100或SMA表達(dá)陰性的情況，因此明確診斷往往存在困難。[7]分子研究表明，胃腸道間質(zhì)瘤患者攜帶KIT基因第9外顯子突變往往表現(xiàn)為對(duì)伊馬替尼敏感度較弱，而攜帶KIT基因第11外顯子突變的患者對(duì)伊馬替尼敏感性較強(qiáng)。KIT基因外顯子13突變對(duì)伊馬替尼敏感度與外顯子11突變類似，而外顯子17突變患者往往對(duì)伊馬替尼和舒尼替尼都耐藥[8]。上述研究結(jié)果表明KIT與PDGFRA基因突變、CD117等標(biāo)志物對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤患者的臨床治療具有較大臨床意義。本研究主要分析胃腸道間質(zhì)瘤中KIT、PDGFRA基因突變分布及其與CD117表達(dá)、臨床病理特征之間的相關(guān)性，為GIST的靶向治療提供依據(jù)。

1.資料和方法

1.1 標(biāo)本選取

本研究選取2018年—2019年存檔在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院的福爾馬林固定石蠟包埋胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本30例，每例標(biāo)本由2位病理醫(yī)生重新復(fù)查確認(rèn)。

1.2 免疫組化檢測(cè)

蠟塊標(biāo)本進(jìn)行3～5微米連續(xù)切片，切片在二甲苯中脫蠟10分鐘，重復(fù)2次，再進(jìn)行梯度酒精洗脫，使用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，CD117抗體1：100稀釋后滴加在切片組織上，濕盒中室溫2小時(shí)，PBS清洗3次，滴加二抗（北京中杉金橋公司），濕盒中室溫30分鐘后用DAB顯色，蘇木素復(fù)染后樹(shù)膠封片。細(xì)胞膜棕色染色為陽(yáng)性染色。

1.3 核酸提取

蠟塊使用切片機(jī)切取蠟卷3～5片，使用二甲苯和酒精對(duì)蠟卷進(jìn)行脫蠟，用蛋白酶K對(duì)組織進(jìn)行消化裂解，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen，德國(guó)）提取石蠟包埋組織中基因組DNA。

1.4 基因外顯子擴(kuò)增和DNA測(cè)序

使用PCR對(duì)KIT基因外顯子9、11、13、17以及PDGFRA基因外顯子12、18進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物清潔后使用ABI3130XL測(cè)序儀進(jìn)行正向與反向測(cè)序。

表1 擴(kuò)增KIT與PDGFRA基因外顯子引物列表

2.結(jié)果

2.1 患者一般資料

30例胃腸道間質(zhì)瘤中，男性16例，女性14例，男女比為1.14：1，平均年齡54歲（23～87歲）。

2.2 腫瘤特點(diǎn)

腫瘤發(fā)生部位在尾部的13例（占43.3%），腸7例（占23.3%），腸道外10例（占33.3%，包括腹腔7例、盆腔2例、腹膜1例）。

2.3 KIT基因突變分析

30例胃腸道間質(zhì)瘤中，共25例檢測(cè)到了KIT基因突變，且均為CD117免疫組化表達(dá)陽(yáng)性，其中23例為KIT基因外顯子11突變陽(yáng)性，1例為外顯子9突變陽(yáng)性，1例外顯子11與外顯子13雙突變，1例外顯子13突變陽(yáng)性。在CD117陽(yáng)性的患者中，KIT基因突變率為86.2%（25/29）。所有突變均為雜合性突變。在所有外顯子11的突變中，最常見(jiàn)的形式為缺失突變，占86.3%（19/22），單堿基突變4例，約占18.1%，最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為p.V559D。KIT外顯子9突變1例為插入重復(fù)突變，具體類型為p.Y503_F504insAY，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。1例外顯子13的突變?yōu)辄c(diǎn)突變，具體類型為p.K642E，1例雙突變?yōu)橥怙@子11缺失突變+外顯子13點(diǎn)突變p.K642E（表2）。

2.4 PDGFRA基因突變分析

本研究納入的30例胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本中（包括6例KIT基因野生型標(biāo)本）未檢測(cè)到PDGFRA基因的突變，可能與GIST發(fā)病率較低，入組數(shù)量不足有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道PDGFRA基因的突變一般存在于KIT基因野生型GIST中，以外顯子18突變?yōu)橹鳎饕蛔冃问綖閜.D842V點(diǎn)突變。

2.5 KIT與PDGFRA突變與臨床病理特征的相關(guān)性

KIT、PDGFRA基因突變與胃腸道間質(zhì)瘤侵襲性危險(xiǎn)度評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性，與腫瘤體積、核分裂像、細(xì)胞形態(tài)、器官累及等特征也無(wú)明顯的相關(guān)性。

表2 KIT、PDGFRA、CD117檢測(cè)結(jié)果表

3.討論

近年來(lái)，靶向酪氨酸激酶治療在胃腸道間質(zhì)瘤中扮演了越來(lái)越重要的角色，研究表明KIT與PDGFRA基因的突變與靶向治療的療效高度相關(guān)，KIT與PDGFRA基因的突變導(dǎo)致受體酪氨酸激酶的持續(xù)活化使得細(xì)胞增殖失控，因此GIST標(biāo)本KIT與PDGFRA基因突變的臨床檢測(cè)變得越來(lái)越重要。

在本次研究中，我們回顧性地檢測(cè)并分析了30例GIST標(biāo)本的KIT與PDGFRA基因突變情況，并比較了基因突變與CD117表達(dá)、臨床病理特征的相關(guān)性，研究結(jié)果展示了KIT與PDGFRA基因突變的突變頻率、突變類型。我們的KIT基因突變率與類型基本與以往的研究報(bào)道數(shù)據(jù)接近，但未發(fā)現(xiàn)PDGFRA突變，可能由于PDGFRA基因的突變頻率較低，而本研究入組的病例數(shù)太少有關(guān)。未來(lái)有必要進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大入組標(biāo)本進(jìn)行更詳細(xì)的研究。另外，本次入組的病人中還檢測(cè)到了1例患者同時(shí)攜帶2種驅(qū)動(dòng)突變，該類患者的預(yù)后及對(duì)靶向治療的反應(yīng)有待未來(lái)積累更多數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步隨訪研究。本研究數(shù)據(jù)為胃腸道間質(zhì)瘤的預(yù)后及靶向治療提供一定的支持。