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    零上低溫脅迫對(duì)藥蒲公英亞顯微結(jié)構(gòu)和生理特性的影響

    2018-02-13 01:29:12喬永剛王勇飛崔芬芬曹亞萍
    草地學(xué)報(bào) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:葉綠體脯氨酸蒲公英

    喬永剛, 王勇飛, 陳 亮, 崔芬芬, 曹亞萍, 宋 蕓

    (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西 太谷 030801)

    蒲公英為常用清熱解毒中藥材[1],也是重要的食藥兼用植物。隨著蒲公英的多元化開發(fā)利用,市場(chǎng)需求量增大,蒲公英的規(guī)?;N植也應(yīng)運(yùn)而生[2]。藥蒲公英(TaraxacumofficinaleF. H. Wigg.)株型大,產(chǎn)量高,品質(zhì)優(yōu),是中藥材蒲公英主要的栽培物種。栽培植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常會(huì)遭受水分、溫度等條件脅迫,會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[3]。藥蒲公英返青早,早春易受“倒春寒”影響,直接影響其產(chǎn)量與品質(zhì)[4]。低溫會(huì)影響植物體內(nèi)滲透壓平衡,破壞膜結(jié)構(gòu)及其組成,影響光合作用[5]。活體葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔玫挠行结?,可以探測(cè)植物光合作用過程的變化[6]。為了抵抗低溫脅迫,植物已經(jīng)發(fā)展了許多策略,包括積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高抗氧化酶活性等方式[7]。植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸可以使細(xì)胞保持水分吸收和膨脹,從而進(jìn)行正常的生理代謝,保護(hù)細(xì)胞免受損害[8]。低溫也導(dǎo)致大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,ROS可引起植物中的脂質(zhì)過氧化和氧化損傷[9]。為了避免ROS誘導(dǎo)的氧化損傷,植物可以積累抗氧化酶。過氧化物酶(Peroxidase,POD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是植物重要的抗氧化酶,其活性與植物的抗寒性相關(guān)[10]。植物細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其低溫抗性密切相關(guān),葉片的組織結(jié)構(gòu)對(duì)生長(zhǎng)條件反應(yīng)較為敏感。低溫脅迫會(huì)對(duì)細(xì)胞中各種結(jié)構(gòu)造成傷害,尤其是葉片中細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)[11]。胞質(zhì)分離現(xiàn)象也在低溫脅迫時(shí)經(jīng)常發(fā)生[12]。

    目前蒲公英在干旱脅迫[13]、鹽堿脅迫[14]方面的研究較多,低溫脅迫研究較少。本文探究藥蒲公英幼苗在零上低溫脅迫下顯微結(jié)構(gòu)和生理的變化,為揭示藥蒲公英低溫脅迫研究與耐低溫機(jī)制提供細(xì)胞學(xué)與生理學(xué)基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本研究采用藥蒲公英幼苗為試驗(yàn)材料。藥蒲公英種子為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的“銘賢1號(hào)”藥蒲公英種子。挑選籽粒飽滿的供試種子,將其在25℃蒸餾水中浸泡12 h,播種于裝有蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽(9 cm×9 cm)。在晝溫25±2℃,夜溫20±2℃,光照強(qiáng)度12 000 lx(16 h光照/8 h黑暗),65%相對(duì)濕度的人工氣候室中培養(yǎng)。出苗后,用Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng),每營(yíng)養(yǎng)缽定苗1株。在6~7葉期進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1低溫脅迫 選取長(zhǎng)勢(shì)一致、健康的幼苗進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn),4℃(16 h光照/8 h黑暗)環(huán)境下分別處理0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h。每組10株,3次重復(fù)。

    1.2.2葉片亞顯微結(jié)構(gòu)觀察 分別在藥蒲公英低溫脅迫的0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材,取第二節(jié)位葉片,用2.5%戊二醛固定,按范華[15]方法制備透射電鏡樣品,利用透射電子顯微鏡(JEM-100CX II型)觀察并拍照。

    1.2.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 使用葉綠素?zé)晒鈨x(OS5p+)對(duì)葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量前暗適應(yīng)30 min。測(cè)定初始熒光值Fo(Initial fluorescence)、最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm(Variable fluorescence / maximal fluorescence)、光系統(tǒng)II(Photosystem II,PSII)潛在光化學(xué)效率Fv/Fo(Variable fluorescence / initial fluorescence)、實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量ΦPSII(PSII actual photochemical quantum yield)、非光化學(xué)淬滅NPQ(Non-photochemical fluorescence quenchin)以及相對(duì)電子傳遞速率ETR(Electron transport rate)[16]。每個(gè)處理重復(fù)5次。

    1.2.4生理指標(biāo)分析 低溫脅迫處理0 h和48 h時(shí)取葉片材料,分別測(cè)量脯氨酸、丙二醛(MDA)的含量、抗氧化物酶(POD、CAT、SOD)的活性以及相對(duì)電導(dǎo)率的大小,測(cè)量方法參照李莎莎等[17]的方法,每個(gè)處理3次重復(fù)。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    用Microsoft Excel 2016和SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英葉片細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響

    觀察藥蒲公英在不同時(shí)間低溫脅迫后的亞顯微結(jié)構(gòu),結(jié)果如下:0 h時(shí),藥蒲公英葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞質(zhì)中間有大液泡;在細(xì)胞質(zhì)中有圓形線粒體和梭形的葉綠體;葉綠體類囊體片層清晰可見;線粒體出現(xiàn)在葉綠體周圍(圖1-A)。低溫處理3 h后,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)少量膜泡,線粒體的數(shù)量增加(圖1-B)。處理6 h后,葉綠體形態(tài)開始扭曲,類囊體片層部分減少,淀粉粒積累明顯(圖1-C)。脅迫12 h后,葉綠體外膜開始溶解,基粒片層和類囊體片層稀疏(圖1-D),核膜比較穩(wěn)定(圖1-G)。脅迫24 h后,液泡膜開始溶解,線粒體數(shù)量較之前增加,有比較明顯的內(nèi)嵴,線粒體膜變得模糊不清(圖1-E),沒有出現(xiàn)明顯的破裂,說明線粒體受傷害較葉綠體小。脅迫48 h后,葉綠體膜和片層溶解嚴(yán)重,液泡膜溶解(圖1-F);出現(xiàn)比較明顯的胞質(zhì)分離現(xiàn)象(圖1-H);此外,在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)一種雙層膜的結(jié)構(gòu)(圖1-I)。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),藥公英葉片亞顯微結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞,葉片受到損傷。

    圖1 不同低溫脅迫處理時(shí)間對(duì)藥蒲公英葉片細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 The influence of low temperature treatment time on ultrastructure of leaves of T. officinale注:A:0 h,B:3 h,C:6 h,D:12 h;E:24 h;F:48 h;G:12 h;H:48 h;I:48 h;Ch:葉綠體;MT:線粒體;V:液泡;CW:細(xì)胞壁;SG:淀粉粒;細(xì)胞核:N;核膜:NMNote:A:0 h;B:3 h;C:6 h;D:12 h;E:24 h;F:48 h;G:12 h;H:48 h;I:48 h;Ch:chloroplast;MT:mitochondrion;V:vacuole;CW:cell wall;SG:starch giains;N:nucleus;NM:nuclear membrane

    2.2 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

    利用葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定藥蒲公英不同時(shí)間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。與0 h相比,低溫脅迫3 h時(shí),F(xiàn)o呈上升趨勢(shì),在3 h~48 h呈下降的趨勢(shì),其中在3 h~12 h時(shí)下降緩慢(圖2-A),F(xiàn)o降低說明低溫脅迫可能會(huì)降低藥蒲公英的葉綠素濃度。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo及ΦPSII呈下降的趨勢(shì),但在6 h~12 h均有較小幅度上升(圖2-B、圖2-C、圖2-D),說明低溫影響PSII光能轉(zhuǎn)化率,使得藥蒲公英PSII的光化學(xué)反應(yīng)速率下降。從圖2-E可以看出,藥蒲公英的ETR在0 h~3 h呈上升趨勢(shì),3 h~48 h呈下降趨勢(shì),說明低溫影響藥蒲公英的光合電子傳遞速率的快慢,電子傳遞速率減小,影響其光合作用。NPQ在0 h~12 h呈上升的趨勢(shì),在12 h~48 h,NPQ呈下降趨勢(shì)(圖2-F)。

    圖2 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)葉綠素?zé)晒獾挠绊慒ig.2 The influence of low temperature treatment time on chlorophyll fluorescence parameters of T. officinale注:A:初始熒光值Fo;B:最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm;C:PSII潛在光化學(xué)效率Fv/Fo;D:實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量ΦPSII;E:相對(duì)電子傳遞速率ETR;F:非光化學(xué)淬滅NPQNote:A:initial fluorescence;B:maximum photochemical quantum yield;C:PSII potential photochemical efficiency;D:actual photochemical quantum yield;E:electron transport rate;F:non-photochemical fluorescence quenching

    2.3 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英生理特性的影響

    通過測(cè)量脯氨酸、MDA含量、POD、CAT、SOD活性以及相對(duì)電導(dǎo)率的大小,結(jié)果表明:低溫脅迫48 h,葉片中MDA、相對(duì)電導(dǎo)率的含量以及脯氨酸的水平與0 h相比增加(圖3-A、圖3-B、圖3-C),說明低溫脅迫下,藥蒲公英葉片細(xì)胞膜受到損傷,并且滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸在藥蒲公英抵抗低溫脅迫過程中起調(diào)節(jié)作用。低溫處理48 h后,葉片的CAT、SOD活性與0 h相比下降(圖3-D、圖3-E),POD活性升高(圖3-F)。說明藥蒲公英抗氧化酶對(duì)低溫脅迫有一定的保護(hù)作用。

    圖3 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英生理特性的影響Fig.3 Effects of low temperature on physiological characteristics of T. officinale

    3 討論

    本研究中探討了低溫脅迫對(duì)藥蒲公英葉片亞顯微結(jié)構(gòu)和光合作用的影響。在進(jìn)行低溫脅迫處理后,藥蒲公英的葉片逐漸萎縮,葉片細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,葉片細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)分離,細(xì)胞液外滲減少,受到一定損害。另外,藥蒲公英葉片線粒體在葉綠體周圍分布并且數(shù)量增加,葉綠體中的淀粉粒數(shù)量也增加,這些可能有助于緩解低溫造成的葉片損傷。在細(xì)胞中觀察到一些雙層膜結(jié)構(gòu),猜測(cè)這種未知結(jié)構(gòu)對(duì)藥蒲公英應(yīng)對(duì)低溫脅迫有重要的作用,需進(jìn)一步深入研究。馬鈴薯[3]、紫花苜蓿[18]以及棉花[19]在低溫脅迫時(shí)也有相似的結(jié)構(gòu)變化。

    葉綠素?zé)晒鈪?shù)是反映植物體內(nèi)光合作用變化的指標(biāo)[20]。Fo可以反應(yīng)植物葉綠素濃度[21],且其變化與PSII反應(yīng)中心的失活有關(guān)[22]。試驗(yàn)結(jié)果表明藥蒲公英Fo在3~48 h下降,可能由于低溫破壞了PSII反應(yīng)中心,從而使葉綠素含量降低。Fv/Fm代表PSII反應(yīng)中心吸收光量子的最大比例,其主要是用來反映PSII復(fù)合物的光抑制傷害程度[23]。此外,藥蒲公英低溫脅迫后Fv/Fm、Fv/Fo及ΦPSII基本呈下降的趨勢(shì),PSII的光化學(xué)反應(yīng)速率下降可能與光抑制有關(guān)。ETR的高低可以反映出其潛在最大光合能力的大小。在正常情況下,植物的ETR值通常處于動(dòng)態(tài)平穩(wěn)狀態(tài),但在遭受低溫等逆境脅迫后,ETR出現(xiàn)下降[23]。低溫脅迫使藥蒲公英的電子傳遞速率降低,減弱CO2的同化能力,限制光合碳代謝的電子供應(yīng)和光合效率,產(chǎn)生光抑制,進(jìn)而作用于其光合作用,原因可能是低溫導(dǎo)致葉綠體類囊體的膜結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生變化,最終對(duì)PSII的功能產(chǎn)生抑制[24]。植物遭受低溫脅迫時(shí),其自我保護(hù)機(jī)制被激發(fā),大量由天線色素吸收的光能轉(zhuǎn)化為熱能散發(fā),葉綠體等光合作用器官的損傷程度減小[25]。NPQ能體現(xiàn)PSII反應(yīng)中心內(nèi)將光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力,它是一種自我保護(hù)機(jī)制,對(duì)光合器官具有保護(hù)作用[26]。本研究中藥蒲公英的NPQ在脅迫12 h內(nèi)呈升高趨勢(shì),可能是藥蒲公英在低溫脅迫中啟動(dòng)了自我保護(hù)機(jī)制,其天線色素將吸收的光能以熱能形式散發(fā),保護(hù)了自身的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。但在脅迫12 h后呈下降趨勢(shì),說明其自我保護(hù)有一定的限度,超過這個(gè)度將會(huì)影響光合作用。NPQ降低可能由于低溫條件下光合相關(guān)酶的活性降低,從而影響光反應(yīng)。

    植物可以通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來增強(qiáng)其抗脅迫的能力。正常生長(zhǎng)環(huán)境下,植物體內(nèi)游離脯氨酸含量低,但遭受低溫、水分脅迫等逆境時(shí),游離脯氨酸會(huì)大量積累,且積累含量與植物抗逆性密切相關(guān)[27]。藥蒲公英脯氨酸含量在低溫脅迫后增加,其增加可能會(huì)增強(qiáng)植物的抗逆性。有研究表明植物在逆境環(huán)境中膜結(jié)構(gòu)會(huì)受損甚至破壞,導(dǎo)致其通透性增大,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)外滲的狀況[28],本研究中藥蒲公英的電導(dǎo)率、MDA增大恰好反應(yīng)其膜結(jié)構(gòu)受損的狀態(tài)。此外,植物抗氧化酶活性的增強(qiáng),可以增強(qiáng)其膜保護(hù)系統(tǒng),降低膜脂過氧化的程度,使其抗逆性提高[29]。藥蒲公英在低溫脅迫后,POD的活力升高,可見POD在低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著積極作用;SOD和CAT的活力呈下降趨勢(shì),這可能是由于脅迫時(shí)間較長(zhǎng),蒲公英體內(nèi)的自由基含量增加活性氧平衡系統(tǒng)遭到破壞,致使酶活性下降。低溫環(huán)境時(shí)紫花苜蓿的抗氧化酶活性也有類似變化[29]。

    4 結(jié)論

    零上低溫脅迫影響藥蒲公英葉片亞顯微結(jié)構(gòu)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及生理特性。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),藥蒲公英葉片膜通透性增加,光合能力下降,亞顯微結(jié)構(gòu)受到明顯破壞,葉片受到損傷,影響生長(zhǎng)發(fā)育。

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